专利名称：一种预防帕金森病的中药组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防帕金森病的中药组合物及其用途，具体地说，是以中草药为原料制备的中成药。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾患，主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。中医认为ro属于“颤证”，多发生于中老年“天癸”竭時，“天癸”竭表征肾精匮乏，荣卫双虚，上不养肝木，外不濡筋脉，水不涵木则阴虚阳亢、心悸、汗出、潮热、烦躁频发；筋脉失柔现晨僵、四肢拘挛、震颤、强直、疼痛、运动迟缓。综观历代医家的经验，旁及现代医学研究，通过临证观察，我们认为，治以益气化痰、柔肝熄风法。益气补肾以消痰浊，柔肝善阴平定震颤。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的预防帕金森病药物。但左旋多巴长期应用3-5年后，大约5%的H)患者会逐渐产生症状波动和(或)运动障碍等左旋多巴的“长期综合征”，即H)运动并发症，加之实验室发现高浓度多巴胺(dopamine，DA)和左旋多巴会由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死，因此，联合其他药物共同预防H)运动并发症十分迫切。近年研究表明，PD发生与表达Dl受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的憐酸化蛋白 ~32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了运动并发症的发病。目前在H)运动并发症的预防方面，主要采用COMT抑制剂、金刚烷胺、DR激动剂、 L-dopa甲酯或乙酯等。如中国专利文献CN 200880108979. 7，公布日2010年8月18日， 公开了一种“用于改善帕金森病的运动并发症或精神症状的药剂”，所述的药剂具有5-羟色胺IA受体部分激动剂作用，同时对多巴胺D3受体具有激动剂作用，对于在反复给药左旋多巴时伴随产生的运动并发症具有改善和延迟发病的效果。但是西药预防副作用较大，不如中药预防安全可靠。我国在中医药预防H)方面积累了丰富经验，总结其预防原则有益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，用于预防 PD的中药组合物也有多种，但是关于预防ro运动并发症的中药组合物却很少，如中国期刊 《中华中医药杂志》，2011年6月第26卷第6期，刊出的“补肾活血颗粒预防帕金森病运动并发症临床研究”，公开了补肾活血颗粒可以改善H)患者运动并发症症状，但是并未充分公开所述的补肾活血颗粒的药物组成和配比。因此，必须积极探索能有效预防帕金森病运动并发症、安全可靠的药物，但是目前关于这类药物还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种预防帕金森病的中药组合物。
本发明的再一的目的是，提供一种上述中药组合物的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种预防帕金森病的中药组合物，它是由下列重量份的原料药制成天麻10-22份、黄 芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25份。所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻12-18份、黄芪13-18份、 熟地黄13-18份、白芍药16-26份、当归12-18份、钩藤18-22份。所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻18份、黄芪18份、熟地黄 18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份。所述的中药组合物的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒、口服液、合剂或糖浆剂。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是
所述的中药组合物在制备预防帕金森病药物中的应用。本发明优点在于
1、本发明的中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，遵循“益气化痰、柔肝熄风 法”的治疗方法，从病原根本入手，对症下药，辅助预防帕金森病效果明显；
2、本发明的中药组合物由纯中药制成，具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接
受；
3、本发明的中药组合物药味数少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在预防帕 金森病中有良好的应用前景。
附图1是中药组合物对ro大鼠模型AIM总分的影响。附图2是中药组合物对ro大鼠模型剂峰旋转次数的影响。附图3是ro大鼠模型纹状体区GRK6的免疫组化图。附图4是ro大鼠模型纹状体区GRK6的免疫组化柱状图。附图5是大鼠模型纹状体区GRK6表达的Western图谱。附图6是大鼠模型纹状体区GRK6表达的定量图。附图7是大鼠模型模型纹状体区P -arrestinl的免疫组化图。附图8是大鼠模型模型纹状体区P -arrestinl表达的Western图谱。附图9是大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (Thr75)的免疫组化图。附图10是大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (Thr75)表达的Western图谱。附图11是大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2的免疫组化图。附图12是大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达表达的Western图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1预防帕金森病的中药组合物的制备(一)
天麻10份、黄芪23份、熟地黄10份、白芍药32份、当归10份、钩藤25份，常规方法煎煮。实施例2预防帕金森病的中药组合物的制备(二)天麻22份、黄芪10份、熟地黄25份、白芍药10份、当归28份、钩藤15份，常规方法煎煮。实施例3预防帕金森病的中药组合物的制备(三)
天麻10份、黄芪10份、熟地黄25份、白芍药32份、当归10份、钩藤15份，常规方法煎煮。实施例4预防帕金森病的中药组合物的制备(四)
天麻22份、黄芪23份、熟地黄25份、白芍药10份、当归28份、钩藤15份，常规方法煎煮。实施例5预防帕金森病的中药组合物的制备(五)
天麻10份、黄芪23份、熟地黄10份、白芍药10份、当归10份、钩藤25份，常规方法煎煮。实施例6预防帕金森病的中药组合物的制备(六)
天麻22份、黄芪10份、熟地黄10份、白芍药32份、当归28份、钩藤25份，常规方法煎煮。实施例7预防帕金森病的中药组合物的制备(七)
天麻12份、黄芪18份、熟地黄13份、白芍药26份、当归12份、钩藤25份，常规方法煎煮。实施例8预防帕金森病的中药组合物的制备(八)
天麻18份、黄芪13份、熟地黄18份、白芍药16份、当归18份、钩藤18份，常规方法煎煮。实施例9预防帕金森病的中药组合物的制备(九)
天麻12份、黄芪13份、熟地黄18份、白芍药26份、当归12份、钩藤22份，常规方法煎煮。实施例10预防帕金森病的中药组合物的制备(十)
天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份，常规方法煎煮。需要说明的是，实施例1-10所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。实施例11预防帕金森病中药组合物片剂/胶囊的制备
取实施例1-10任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。实施例12预防帕金森病中药组合物颗粒的制备
取实施例1-10任一所述的中药组合物，加7-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，真空干燥，粉碎制粒，干燥，整粒，得20g颗粒，分装IOg/袋。实施例13预防帕金森病中药组合物合剂/ 口服液/糖浆剂的制备取实施例1-10任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加 6-10倍量水，煎煮1-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，制成合剂、口服液或糖浆剂。实施例14预防帕金森病中药组合物疗效的动物实验一、实验方法
I.ro大鼠模型制备
取65只大鼠进入实验,其中5只为假手术组,即sham组,于前脑内侧束(right medical forebrain, MFB)注射生理盐水。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，严格平头颅位固定大鼠于脑立体定向仪，参照包新民所著大鼠脑立体定向图谱(DeWire SM, Lefkowitz RJ, Shenoy SKj et al. Beta arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol. 2007， 69: 483-510.)，确定右侧前脑内侧束坐标①前因后3. 7 mm，矢状缝右侧I. 7 mm，颅骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 mm 前囟后4. 4 mm,矢状缝右侧I. 2 mm,卢页骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10 μ I的微量注射器抽取6-0HDA 6 μ I (含 O. 2%维生素C的生理盐水配置，浓度4 μ g/μ 1)，每点注射3μ 1，留针10 min后退针，缝合创面。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡(O. 5 mg / kg)，平均旋转频率>7次/min为成功 H)模型。分组与治疗
将25只成功的ro模型大鼠随机分为3大组。(I) ro对照组ro模型大鼠腹腔注射 O. 2%维生素C液29天；(2)西药处理组腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼，注射剂量为50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg苄丝肼，二者均溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中，2 次/d (上午9点和下午5点),持续29d ； (3)中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、 中药组合物大剂量组给予如组(2)中的左旋多巴甲酯/苄丝肼的基础上分别加用实施例 10制备的中药组合物，按照50g原料药浓缩至IOOml的比例煎煮，中药组合物小剂量组使用剂量为7. 2 ml/kg,中药组合物中剂量组使用剂量为9 ml/kg,中药组合物大剂量组使用剂量为10. 8 ml/kg,每日I次灌胃，连续4周。行为学测定
在治疗过程中于第2、8、15、22、29天上午用药后进行大鼠行为学观察和评分。AM评定AM分成4个组分(上肢AM、口面部AM、轴性AM和旋转AM)进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级(0-4):0无；I持续时间小于30s ;2持续时间大于30s， 小于60s ；3持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察lmin。AM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上I只大鼠一次用药后各组分AIM最大评分为4分，总AIM评分为16分。 剂峰旋转次数注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。免疫组化显示纹状体β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的变化结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固
定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5 μ m。石腊切片脱腊至水；3%双氧水室温避光孵育5min,以消除内源性过氧化氢酶活性；pH7. 7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl)微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min ;兔抗鼠GRK6抗体、兔抗鼠β -arrestinl多克隆抗体、兔抗鼠DARPP-32抗体、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗体、兔抗大鼠总ERK1/2 和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体4°C湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min ;联苯二胺 (3, 3 ' -diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10X40)下观察， 采用0LYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5. I图象处理软件进行半定量分析，计算阳性细胞指数(IOD) =阳性细胞面积X校正光密度值(测量区光密度一背景光密度)。法检测β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的表达
最后一次注射后3h，3%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头取脑，冰上剥离双侧纹状体，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后，置_80°C冻存备用。40 μ g蛋白样本经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，以电转膜仪转移至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上。封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭2h，按照相应浓度稀释抗GRK6抗体(I 500)、 抗 β-arrestinl 抗体(I 500)、抗总 DARPP-32 抗体(I 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75)抗体(I 1000)、抗总 ERK1/2 抗体(I 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗体(I 500) 或抗β-actin (I 1000)，4°C轻摇孵育过夜。次日加入二抗，室温下摇床孵育I h ;滴加 ECL显色混合液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000 图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。统计分析方法
实验数据采用SPSS 13. O统计软件进行分析。所得计量资料以均数土标准差(
X 土S)表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P〈0.05
为差异具有统计学意义。二、实验结果
I.中药组合物对ro大鼠模型行为的影响
I.I中药组合物对ro大鼠模型各组分AIM评分的影响
中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组和西药处理组对F1D 大鼠模型各组分AIM评分的影响结果如表I所示。就口面部AM评分而言，第2天各组间均值无显著差异。第8、15、22、29天各组间均值差异显著(F=4. 98、F=22. 70、F=30. 96、F=23. 27，P〈0. 01)。其中，中药组合物小剂量组在第22天口面部AM评分较西药处理组降低，差异有统计学意义(t=2. 50，P〈0. 05)，其余几天差异均无统计学意义；中药组合物中剂量组第8、15、22、29天口面部AIM评分较中药组合物小剂量组明显降低，差异有统计学意义(t=2. 86、t=3. 80、t=4. 38、t=6. 54，均P〈0. 05);中药组合物中剂量组与中药组合物大剂量组比较，仅于第22天中药组合物大剂量组较中药组合物中剂量组口面部AM评分降低，差异有统计学意义(t=2. 50，P〈0. 05)。就上肢AM评分而言，第2、8天各组均值无明显差异，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义(F=15. 12、F=32. 86、F=35. 80，P〈0. 01)。用药第2天和第8天中药组合物小剂量组上肢AM评分与西药处理组比较无显著性差异，至用药第15、22、29天中药组合物小剂量组上肢AM评分低于西药处理组，差异有统计学意义(t=4. 45、t=4. 47，均P〈0. 05)。 第15、22、29天中药组合物中剂量组比中药组合物小剂量组上肢AM评分明显降低，差异有统计学意义(t=3. 40、t=4. 04、t=3. 95，均P〈0. 01)。中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组之间比较，差异无统计学差异。就轴向AM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义(F=3.30、 F=25. 06、F=36. 41，Ρ〈0· 01)。中药组合物小剂量组用药至第22,29天轴向AM值比西药处理组降低，差异有统计学意义(t=3. 93、t=3. 04，均P〈0. 05);中药组合物中剂量组与中药组合物小剂量组比较，仅于第29天差异有统计学意义(t=3. 05，P<0. 05);中药组合物大剂量组明显降低了轴向AIM值，但与中药组合物中剂量组比较，仅于第29天有差异(t=2. 83， P〈0. 05)，其它时间点差异无统计学差异。就旋转AM评分而言，第8、15、22、29天各组间均值差异显著(F=IO. 50、F=Il. 62、 F=18. 92、F=61. 26，P〈0. 01)。中药组合物小剂量组与西药处理组旋转AM评分比较，差异无统计学意义。中药组合物中剂量组用药至第15、22、29天，旋转AIM评分比西药处理组明显降低，差异有统计学意义(t=3. 43、t=5. ll、t=7. 63，均P〈0. 01);中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组比较，第8、15、29天差异明显(t=3. 81、t=2. 52、t=3. 58，均P〈0. 05 )。表I中药组与西药组AM评分的比较G ±S，分)
权利要求
1.一种预防帕金森病的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成 天麻10-22份、黄芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25 份。
2.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成 天麻12-18份、黄芪13-18份、熟地黄13-18份、白芍药16-26份、当归12-18份、钩藤18-22 份。
3.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成 天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份。
4.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒、口服液、合剂或糖浆剂。
5.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物在制备预防帕金森病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种预防帕金森病的中药组合物，它是由下列重量份的原料药制成天麻10-22份、黄芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25份。本发明还涉及上述中药组合物在制备预防帕金森病中的用途。本发明的优点在于本发明的中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，从病原根本入手，对症下药，辅助预防帕金森病疗效确切；由纯中药制成，具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接受；药味数目少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在预防帕金森病中有良好的应用前景。
文档编号A61P25/16GK102600371SQ20121006246
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘振国, 吴娜, 袁伟恩, 陈伟, 魏江磊 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院