专利名称：一种中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物的用途，具体地说，是一种中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的用途。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾患， 主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的治疗帕金森病药物。但左旋多巴长期应用后大部分患者会出现症状波动、异动症(levodopa-induced dyskinesia, LID)和精神症状，即H)运动并发症，加之实验室发现高浓度多巴胺(dopamine，DA)和左旋多巴会由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死，因此，联合其他药物共同预防和治疗ro运动并发症十分迫切。近年研究表明，PD发生与表达Dl受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的憐酸化蛋白 ~32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症的发病。目前在TO运动并发症的治疗方面，主要采用COMT抑制剂、金刚烷胺、DR激动齐[J、 L-dopa甲酯或乙酯等。如中国专利文献CN 200880108979. 7，公布日2010年8月18日， 公开了一种“用于改善帕金森病的运动并发症或精神症状的药剂”，所述的药剂具有5-羟色胺IA受体部分激动剂作用，同时对多巴胺D3受体具有激动剂作用，对于在反复给药左旋多巴时伴随产生的运动并发症具有改善和延迟发病的效果。但是西药治疗副作用较大，不如中药治疗安全可靠。我国在中医药治疗H)方面积累了丰富经验，总结其治疗原则有益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，用于治疗 PD的中药组合物也有多种，但是关于缓解ro运动并发症的中药组合物却很少，如中国期刊 《中华中医药杂志》，2011年6月第26卷第6期，刊出的“补肾活血颗粒治疗帕金森病运动并发症临床研究”，公开了补肾活血颗粒可以改善PD患者运动并发症症状，但是并未充分公开所述的补肾活血颗粒的药物组成和配比。因此，必须积极探索能有效治疗帕金森病运动并发症、安全可靠的中药组合物，但是目前关于这类中药组合物还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中药组合物的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的用途，所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药15-25 份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕7-13份、天南星7_13份。
所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻12-18份、黄芪12-18份、 熟地黄12-18份、白芍药18-22份、当归12-18份、钩藤12-18份、僵蚕8_12份、天南星8_12 份。所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻15份、黄芪15份、熟地黄 15份、白芍药20份、当归15份、钩藤15份、僵蚕10份、天南星10份。所述的中药组合物的药剂是胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、合剂、糖浆剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。本发明优点在于
1、该中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，采用补肾固表法从病原根本入手， 对症下药，辅助治疗帕金森病运动并发症疗效确切；
2、该中药组合物治疗帕金森病运动并发症无毒副作用，价格低等优点，易于被患者接
受；
3、该中药组合物药味数少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在治疗帕金森病运动并发症中有良好的应用前景。
附图附图附图附图附图附图附图附图附图附图
I是不同剂量中药组合物对LID大鼠模型AIM评分的影响。
2是不同剂量中药组合物对LID大鼠模型剂峰旋转次数的影响。
3是LID大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的免疫组化图。
4是LID大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的Western图谱。
5是LID大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (THr75)表达的免疫组化图。
6是LID大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (THr75)表达的Western图谱c 7是LID大鼠模型纹状体区GRK6表达的免疫组化图。
8是LID大鼠模型纹状体区GRK6表达的Western图谱。
9是LID大鼠模型纹状体区β -arrestinl表达的免疫组化图。
10是LID大鼠模型纹状体区β -arrestinl表达的Western图谱。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(一)
天麻10份、黄芪20份、熟地黄10份、白芍药25份、当归10份、钩藤20份、僵蚕7份、 天南星13份，常规方法煎煮。实施例2治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(二)
天麻20份、黄芪10份、熟地黄20份、白芍药15份、当归20份、钩藤10份、僵蚕13份、 天南星7份，常规方法煎煮。实施例3治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(三)
天麻10份、黄芪10份、熟地黄20份、白芍药25份、当归10份、钩藤10份、僵蚕13份、 天南星13份，常规方法煎煮。实施例4治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(四)天麻20份、黄芪10份、熟地黄10份、白芍药25份、当归20份、钩藤10份、僵蚕7份、
天南星13份，常规方法煎煮。实施例5治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(五)
天麻20份、黄芪20份、熟地黄20份、白芍药25份、当归10份、钩藤10份、僵蚕7份、 天南星7份，常规方法煎煮。实施例6治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(六)
天麻12份、黄芪18份、熟地黄12份、白芍药22份、当归12份、钩藤18份、僵蚕8份、 天南星12份，常规方法煎煮。实施例7治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(七)
天麻18份、黄芪12份、熟地黄18份、白芍药18份、当归18份、钩藤12份、僵蚕12份、 天南星8份，常规方法煎煮。实施例8治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(八)
天麻12份、黄芪12份、熟地黄18份、白芍药22份、当归12份、钩藤12份、僵蚕12份、 天南星12份，常规方法煎煮。实施例9治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(九)
天麻18份、黄芪12份、熟地黄12份、白芍药22份、当归12份、钩藤12份、僵蚕8份、 天南星8份，常规方法煎煮。实施例10治疗帕金森病运动并发症中药组合物的制备(十)
天麻10份、黄芪18份、熟地黄20份、白芍药18份、当归18份、钩藤10份、僵蚕13份、 天南星8份，常规方法煎煮。需要说明的是，实施例1-10所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。实施例11治疗帕金森病运动并发症的中药组合物片剂/胶囊的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10 倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。实施例12治疗帕金森病运动并发症的中药组合物颗粒的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10 倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，真空干燥，粉碎制粒，干燥，整粒，得20g颗粒，分装IOg/袋。实施例13治疗帕金森病运动并发症的中药组合物合剂/口服液/糖浆剂的制备取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10
倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，制成合剂、口服液或糖浆剂。实施例14治疗帕金森病运动并发症的中药组合物微囊制剂的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；选用药学上可接受的囊材，制成微囊制剂。实施例15治疗帕金森病运动并发症的中药组合物注射剂的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10 倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，80°C蒸馏回收，配以注射用水，制成注射液。实施例16治疗帕金森病运动并发症的中药组合物栓剂的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10 倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料(按照常规的方法选用药用辅料)，真空干燥，粉碎制粒，注模，制成栓剂。实施例17治疗帕金森病运动并发症的中药组合物喷雾剂的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10 倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用液化剂，注入非金属喷雾器，制成喷雾剂。实施例18治疗帕金森病运动并发症的中药组合物软膏剂的制备
取实施例1-10任一所述的药物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液 2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入适宜基质混合，制成软膏剂。实施例19该中药组合物治疗帕金森病运动并发症的临床前试验一、实验方法
I.异动症(levodopa-induced dyskinesia, LID)模型制备和分组腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，严格平头颅位固定大鼠于脑立体定向仪，参照包新民所著大鼠脑立体定向图谱(DeWire SM, Lefkowitz RJ, Shenoy SK, et al. Beta arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol. 2007, 69: 483-510.),确定右侧前脑内侧束坐标①前囟后3. 7 mm,矢状缝右侧I. 7 mm,卢页骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 mm ; ②前囟后4. 4 mm,矢状缝右侧I. 2 mm,卢页骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10 μ I的微量注射器抽取6-0HDA 6 μ I (含O. 2%维生素C的生理盐水配置，浓度4 yg/yl)，每点注射3μ1，留针10 min后退针，缝合创面。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡(O. 5 mg / kg)，平均旋转频率>7次/min为成功H)大鼠模型。利用6-0HDA制备H)模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg 苄丝肼溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中)4周，制备LID大鼠模型，随机将LID大鼠模型分为LID组、西药组、小剂量组、中剂量组、大剂量组。LID组为LID模型大鼠腹腔注射
O.2%维生素C液29天。西药组为腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼(注射剂量50 mg/kg 左旋多巴甲酯和25 mg/kg苄丝肼，二者都溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中)，2次 /d (上午9点和下午5点)，持续29d ;小剂量组、中剂量组、大剂量组在给予左旋多巴甲酯/ 苄丝肼的基础上分别加用实施例10的中药组合物，按照每50g原料药浓缩至IOOml的比例煎煮，小剂量组7. 2 ml/kg，中剂量组9 1111/1^，大剂量组10.8 ml/kg，每日I次灌胃，连续4 周。在治疗过程中于第8、15、22、29天上午用药后进行异常不自主运动(AM)评分及剂峰旋转次数测定。另设有以下对照组sham组正常大鼠，不作处理；假手术组每日一次灌胃无菌水；生理盐水组LID大鼠，腹腔注射含O. 2%维生素C的消毒生理盐水；ro组ro模型大鼠。2. AIM 评定
AIM分成4个组分(上肢AIM、口面部AM、轴性AM和旋转AM)进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级(0-4):0无；I持续时间小于30s ;2持续时间大于30s， 小于60s ；3持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察lmin。AM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上I只大鼠一次用药后各组分AIM最大评分为4分，总AIM评分为16分。 剂峰旋转次数注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。3.免疫组化染色
结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，于左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5 μ m。取纹状体冠状层面采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结 (SP)法行免疫组化染色,步骤如下石腊切片脱腊至水；3%双氧水室温避光孵育5min,以消除内源性过氧化氢酶活性；pH7.7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl)微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min ；GRK6多克隆抗体 (I 200)、β-arrestinl 多克隆抗体(I 500)、兔抗鼠 DARPP-32 抗体(I 500)、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗体(I 500)、兔抗大鼠总ERK1/2单克隆抗体(I 500)和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体(I 500)4°C湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min ;联苯二胺 (3,3，-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、 透明、封片。各步骤之间均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10 X 40)下观察，采用0LYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5. I图象处理软件进行半定量分析，计算 GRK6蛋白阳性细胞指数(IOD)=阳性细胞面积X校正光密度值(测量区光密度一背景光密度)。4. Western blot 蛋白免疫印迹
结束注射后3h，快速冰上分离双侧纹状体，每IOmg组织加入100 μ I蛋白裂解液RIPA 和1μ I蛋白酶抑制剂PMSF，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后于一 80°C保存。40 yg 样本经10% SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至二氟化树(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，用5%脱脂奶粉洗脱缓冲液后室温封闭I h ;加入抗GRK6抗体(I 500)、抗 β-arrestinl 抗体(I 500)、抗总 DARPP-32 抗体(I 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75)抗体(I :1000)、抗总 ERK1/2 抗体(I 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗体(I 500)或抗β-actind 1000)，4°C孵育过夜；TBST冲洗，加HRP标记的山羊抗兔二抗(I : 1000) 或山羊抗小鼠二抗(I 3000)，37°C孵育Ih ;TBST冲洗，滴加ECL显色液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。4.统计学方法
采用SPSS 13. O软件进行统计学处理。数据以均数土标准误表示，用单因素方差分析及独立T建议进行检验，P<0. 05表示差异有统计学意义。二、结果
I.不同剂量中药组合物对LID大鼠模型行为学的影响
I.I不同剂量中药组合物对LID大鼠模型各组分AM评分的影响就口面部AM评分而言，第8天各组间均值无显著差异(F=2. 18，P >0.05)，第15、22、 29天各组间均值差异显著(F=IO. 43、F=Il. 70、F=15. 62，Ρ〈0· 01)。小剂量组与西药组比较，各天差异均不明显。第15、22、29天中剂量组比小剂量组明显降低，差异有统计学意义 (t=5. 06、t=5. 48、t=5. 46，均Ρ〈0· 01)。中剂量组与大剂量组比较，无统计学差异。就上肢AM评分而言，第8、22、29天各组间均值差异有统计学意义(F=9.64、 F=13. 70、F=30. 30，P〈0. 01)，第15天各组间无明显差异。小剂量组与西药组比较，仅于第 22天差异显著(t=5. 69，P〈0.01)。中剂量组于第8、15、22天与小剂量组比较差异不显著， 仅于第29天差异有统计学意义(t=6. 20，P〈0. 01),与西药组比较，第22、29天差异有统计学意义(t=3. 11、t=7. 30，均P〈0. 05)。大剂量组与中剂量组之间比较，第8、22天时差异有统计学差异(t=5. 06、t=2. 53，均P〈0. 05);与西药组比较，第8、15、22、29天差异均有统计学意义(t=3. 10、t=2. 72、t=6. 06、t=7. 31，均 Ρ〈0· 05)。就轴向AM评分而言，第8、15、22、29天各组间比较，均无统计学意义。就旋转AIM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异显著(F=17. 12、F=27. 26、 F=26. 18，P〈0. 01)。第8、15、22、29天小剂量组与西药组比较均无统计学意义。第15、22、 29天中剂量组与西药组比较，旋转AIM值均明显降低，差异有统计学意义(t=5. 67、t=6. 80、 t=6. 40，均Ρ〈0· 01)。大剂量组比中剂量组第15,22天旋转AM评分降低(t=2. 43、t=2. 32， 均 Ρ〈0·05)。(见表 I)
表I小、中、大剂戀且与西药组AMi粉的比较(Jc 土S，分)
权利要求
1.一种中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的用途，其特征在于，所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20 份、白芍药15-25份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕7_13份、天南星7_13份。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻12-18份、黄苗12-18份、熟地黄12-18份、白苟药18-22份、当归12-18份、 钩藤12-18份、僵蚕8-12份、天南星8-12份。
3.根据权利要求I或2所述的用途，其特征在于，所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成天麻15份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤15份、僵蚕10份、天南星10份。
4.根据权利要求I或2所述的用途，其特征在于，所述的中药组合物的药剂是胶囊剂、 颗粒剂、片剂、口服液、合剂、糖浆剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
全文摘要
本发明涉及一种中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的用途，所述的中药组合物是由以下重量份的原料药制成天麻10-20份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药15-25份、当归10-20份。本发明优点在于该中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，采用补肾固表法从病原根本入手，对症下药，辅助治疗帕金森病运动并发症疗效确切；该中药组合物治疗帕金森病运动并发症具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接受；该中药组合物药味数少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在治疗帕金森病运动并发症中有良好的应用前景。
文档编号A61K35/64GK102579847SQ20121006234
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘振国, 吴娜, 袁伟恩, 陈伟, 魏江磊 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院