专利名称：一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，具体地说，是一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾患， 主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的药物。但长期应用后大部分患者会出现症状波动、运动障碍和精神症状。加之实验室发现高浓度多巴胺(dopamine， DA)和左旋多巴由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死。因此，联合其他药物共同治疗H)运动并发症十分迫切。此外，研究发现纹状体GRKs和Arrestins表达的变化与H)的发展关系密切。近年研究表明，帕金森病运动并发症的发生与表达Dl受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的憐酸化蛋白-32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症(levodopa-induced dyskinesia, LID)的发病。目前认为使用左旋多巴控释剂、多巴胺受体激动剂、B型单胺氧化酶(monoamine oxidase-B type,MAO-B)抑制剂和儿茶酌氧位-甲基转移酶抑制剂(eateehol-O-methyl transferase inhibitor,C0MTI)可延缓运动并发症的出现。但这些药物往往副作用较大， 容易形成耐药性，不宜长期服用。我国在中医药治疗PD方面积累了丰富经验，总结其治疗原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则。中国专利文献CN100409867C公开了一种熄风止颤胶囊，提供了由白芍、钩藤等组成的复方中药，治疗PD，改善震颤症状、肌强直、运动不能症状。李敏等提出了补肾活血中药可以改善ro患者运动并发症症状，且疗效随治疗时间延长而增加，该补肾活血中药由山萸肉10g，何首乌15g，丹参15g，水蛭6g等中药组成，但没有公开其他中药成分 (详见李敏等.补肾活血颗粒治疗帕金森病运动并发症临床研究.中华中医药杂志， 2011，26(6) : 1296-1299.)。但是关于一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物。本发明的再一的目的是，提供一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻10-25份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5_20份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻12-20份、黄芪12-18份、熟地黄12-18份、白芍药16-26份、当归12-14份、钩藤12-18份、僵蚕8_12份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻16份、黄芪15份、熟地黄15 份、白芍药20份、当归15份、钩藤17份、僵蚕12份。所述的中药组合物的剂型是合剂、口服液或糖浆剂。所述的片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂的制备方法是所述的中药组合物，通过加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。所述的片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂的制备方法是通过加10倍量水，煎煮2小时，滤出药汁；再加8倍量水，煎煮I小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是所述的中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。本发明优点在于
1、本发明的中药组合物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、 无毒副作用、价格低等优点，采用治疗原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到治疗的效果；
2、制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
附图I是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型AM评分的影响，#与西药组比较，P〈0. 05 与小剂量组比较，均P〈0. 05 ；+与中剂量组比较，P〈0. 01。附图2是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型剂峰旋转次数的影响，#与西药组比较，均Ρ〈0· 01 ;*与西药组比较，均Ρ〈0· 01。附图3是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的免疫组化结果，A: sham组(假手术组),B:LID组,C: Ievodopa组(西药组),D:TCM_low 组(小剂量组)，E:TCM-medium组(中剂量组)，F:TCM_high (大剂量组)组。附图4是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的 Western 结果，I: sham 组，2: LID 组，3: Ievodopa 组,4: TCM-low 组，5: TCMnedium 组，6:TCM-high 组。附图5是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (THr75)表达的影响的免疫组化结果,A: sham组，B:LID组，C: Ievodopa组，D:TCM-Iow组，E:TCM_medium 组，F: TCM-high 组。附图6是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (THr75)表达的影响的 Western 结果，I: sham 组，2: LID 组，3: Ievodopa 组,4:TCM_low 组， 5: TCMnedium 组，6: TCM-high 组。附图7是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区GRK6的影响的免疫组化结果，I: sham 组，2: LID 组，3: Ievodopa 组,4: TCM-low 组，5: TCMnedium 组,6: TCM-high 组；U:未损伤侧，L:损伤侧。附图8是不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型纹状体区GRK6的影响的Western 结果，1，、2，:sham 组，3’、4’ PD 组，5’、6’ LID 组，1、2: Ievodopa 组，3、4:TCM_low 组，5、 6:TCM-medium 组，7、8:TCM-high 组；I，、3，、5，、1、3、5、7:未损伤侧，2’、4’、6’、2、4、6、8: 损伤侧。附图9是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区β-arrestinl的影响的免疫组化结果，I sham 组,2: LID 组,3: Ievodopa 组,4:TCM_low 组,5: TCM-medium 组， 6:TCM-high组；U:未损伤侧，L:损伤侧。附图10是中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型纹状体区β -arrestinl的影响的 Western 结果，I，、2， sham 组，3，、4，PD 组，5，、6，: LID 组，1、2: evodopa 组，3、4: TCM-Iow 组，5、6:TCM-medium 组，7、8:TCM-high 组；I，、3，、5，、1、3、5、7:未损伤侧，2’、4’、6’、2、4、
6、8:损伤侧。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明提供一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻10-25份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、 当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份。实施例I中药组合物的制备(一)
天麻10份、黄芪20份、熟地黄10份、白芍药30份、当归10份、钩藤20份、僵蚕5份， 常规方法煎煮。实施例2中药组合物的制备(二)
天麻12份、黄芪19份、熟地黄11份、白芍药28份、当归11份、钩藤19份、僵蚕6份，
常规方法煎煮。实施例3中药组合物的制备(三)
天麻14份、黄芪18份、熟地黄12份、白芍药26份、当归12份、钩藤18份、僵蚕8份， 常规方法煎煮。实施例4中药组合物的制备(四)
天麻16份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤17份、僵蚕12份，
常规方法煎煮。实施例5中药组合物的制备(五)
天麻18份、黄芪17份、熟地黄13份、白芍药24份、当归13份、钩藤16份、僵蚕10份， 常规方法煎煮。
实施例6中药组合物的制备(六)
天麻20份、黄芪16份、熟地黄14份、白芍药22份、当归14份、钩藤15份、僵蚕14份，
常规方法煎煮。实施例7中药组合物的制备(七)
天麻22份、黄芪14份、熟地黄16份、白芍药18份、当归16份、钩藤14份、僵蚕16份，
常规方法煎煮。实施例8中药组合物的制备(八)
天麻24份、黄芪13份、熟地黄17份、白芍药16份、当归17份、钩藤13份、僵蚕18份， 常规方法煎煮。实施例9中药组合物的制备(九)
天麻25份、黄芪12份、熟地黄18份、白芍药14份、当归18份、钩藤12份、僵蚕20份，
常规方法煎煮。实施例10中药组合物的制备(十)
天麻19份、黄芪11份、熟地黄19份、白芍药12份、当归19份、钩藤11份、僵蚕9份，
常规方法煎煮。实施例11中药组合物的制备(i^一)
天麻13份、黄芪10份、熟地黄20份、白芍药10份、当归20份、钩藤10份、僵蚕15份，
常规方法煎煮。需要说明的是，实施例1-11所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。实施例12中药组合物片剂/胶囊剂的制备
取实施例1-11任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷， 加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加入制药辅料，真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。实施例13中药组合物颗粒剂的制备
取实施例1-11任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷， 加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制粒，干燥，整粒，得颗粒，分装。实施例14中药组合物合剂/ 口服液/糖浆剂的制备
取实施例1-11任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷， 加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成合剂、口服液或糖浆剂。实施例15本发明的中药组合物的临床前试验一、实验方法
I. LID模型制备和分组
利用6-0HDA制备H)模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg苄丝肼)溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中)4周，制备异动症 (levodopa-induced dyskinesia, LID)大鼠模型，随机将LID模型分为:LID组、西药组、中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组。LID组为LID模型大鼠腹腔注射O. 2%维生素C液29天。西药组为腹腔注射左旋多巴甲酯+苄丝肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg苄丝肼，溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中，2次/d (上午9 点和下午5点)，持续29d ;中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组在给予左旋多巴甲酯+苄丝肼的基础上分别加用本发明的中药组合物，9ml /kg，每日I 次灌胃，连续4周。中药组合物中剂量组参照实施例4所述的方法制备中药组合物；中药组合物大剂量组按照中剂量组各中药原料药各增加20% ;中药组合物小剂量组按照中剂量组各中药原料药各减少20%。在治疗过程中于第8、15、22、29天上午用药后进行异常不自主运动(AM)评分及剂峰旋转次数测定。AM评定AM分成4个组分(上肢AM、口面部AM、轴性AIM和旋转AIM)进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级(0-4) 0无； I持续时间小于30s ;2持续时间大于30s，小于60s ;3持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察lmin。AIM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上I只大鼠一次用药后各组分AIM最大评分为4分，总AIM评分为16分。剂峰旋转次数注射左旋多巴后,每5min 记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。2.免疫组化染色
结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，于左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5 μ m。取纹状体冠状层面采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结 (SP)法行免疫组化染色,步骤如下石腊切片脱腊至水；3%双氧水室温避光孵育5min,以消除内源性过氧化氢酶活性；PH7.7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min ；GRK6多克隆抗体 (I :200)、β -arrestinl 多克隆抗体(I :500)、兔抗鼠 DARPP-32 抗体(I :500)、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗体(I :500)、兔抗大鼠总ERK1/2单克隆抗体(I :500)和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体(I :500) 4°C湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min ;联苯二胺 (3,3，-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10X40)下观察， 采用0LYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5. I图象处理软件进行半定量分析，计算GRK6蛋白阳性细胞指数(IOD)=阳性细胞面积X校正光密度值(测量区光密度一背景光密度)。3. Western blot 蛋白免疫印迹
结束注射后3h，快速冰上分离双侧纹状体，每IOmg组织加入100 μ I蛋白裂解液RIPA 和1μ I蛋白酶抑制剂PMSF，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后于-80°C保存。40yg 样本经10% SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至二氟化树(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，用5%脱脂奶粉洗脱缓冲液后室温封闭I h;加入抗GRK6抗体(1:500)、抗β -arrestinl 抗体(1:500)、抗总 DARPP-32 抗体(1:1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75) 抗体(l:1000)、抗总ERKl/2抗体 (1:1000)或抗磷酸化ERK1/2抗体(I :500)或抗β -actin (1:1000)，4°C孵育过夜；TBST冲洗，加HRP标记的山羊抗兔二抗(1:1000)或山羊抗小鼠二抗(1:3000)，37°C孵育Ih ；TBST冲洗，滴加ECL显色液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。 Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。4.统计学方法
采用SPSS 13. O软件进行统计学处理。数据以均数土标准误差表示，用单因素方差分析及独立T建议进行检验，P<0. 05表示差异有统计学意义。二、结果
(一)不同剂量中药组合物对异动症大鼠模型行为学的影响
I.中药组合物不同剂量对异动症大鼠模型各组分AIM评分的影响就口面部AM评分而言，第8天各组间均值无显著差异(A=2. 18，P >0.05)，第15、22、 29天各组间均值差异显著(A=IO. 43、/^=11. 70、/^=15. 62，IKQ. 01)。小剂量组与西药组比较，各天差异均不明显。第15、22、29天中剂量组比小剂量组明显降低，差异有统计学意义 ( =5. 06、 =5. 48、 =5. 46，均7X0.01)。中剂量组与大剂量组比较，无统计学差异。就上肢AM评分而言，第8、22、29天各组间均值差异有统计学意义(片9. 64、 /7=13. 70^=30. 30, /Χ0. 01)，第15天各组间无明显差异。小剂量组与西药组比较，仅于第 22天差异显著( =5. 69，7X0.01)。中剂量组于第8、15、22天于小剂量组比较差异不显著， 仅于第29天差异有统计学意义( =6. 20，P<Q. 01)，与西药组比较，第22、29天差异有统计学意义( =3. 11、 =7. 30，均7X0.05)。大剂量组与中剂量组之间比较，第8、22天时差异有统计学差异( =5. 06、 =2. 53，均/XO. 05);与西药组比较，第8、15、22、29天差异均有统计学意义( =3. 10、t=2. 72、 =6. 06、t二 · 31，均/XO. 05)。就轴向AM评分而言，第8、15、22、29天各组间比较，均无统计学意义。就旋转AM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异显著(A=17. 12、片27. 26、 /^=26. 18, 7X0.01)。第8、15、22、29天小剂量组与西药组比较均无统计学意义。第15、22、 29天中剂量组与西药组比较，旋转AIM值均明显降低，差异有统计学意义(t=5. 67、 =6. 80、 t=6. 40，均/XO. 01)。大剂量组比中剂量组第15、22天旋转AIM评分降低( =2. 43、 =2· 32， 均7X0.05)。(见表 I)
表I中药组合物TCM小、中、大剂量与西药组AM评分的比较( Ti ±S,分)
权利要求
1.一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻10-25份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、 当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份。
2.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻12-20份、黄芪12-18份、熟地黄12-18份、白芍药16-26份、当归12-14 份、钩藤12-18份、僵蚕8-12份。
3.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻16份、黄芪15份、熟地黄15份、白芍药20份、当归15份、钩藤17份、 僵蚕12份。
4.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物的剂型是片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。
5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述的片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂的制备方法是所述的中药组合物，通过加6-10倍量水，煎煮1-3小时， 滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液， 浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。
6.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述的片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂的制备方法是通过加10倍量水，煎煮2小时，滤出药汁；再加8倍量水，煎煮I小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。
7.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物在制备治疗帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻10-25份、黄芪10-20份、熟地黄10-20份、白芍药10-30份、当归10-20份、钩藤10-20份、僵蚕5-20份。本发明还提供这种中药组合物的应用。本发明优点在于配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、无毒副作用、价格低等优点，采用益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到治疗的效果；制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的缓解帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
文档编号A61P25/16GK102600373SQ201210063009
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘振国, 吴娜, 袁伟恩, 陈伟, 魏江磊 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院