专利名称：鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用，鲜地黄水提物具有雌激素样作用，有效用于由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的治疗用药问题。
背景技术：
鲜地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜块根,秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用，即为鲜地黄。历代名家对其均有论述和研究，认为其性甘、 苦、寒，归心、肝、肾经，清热生津，凉血，止血，主用于热病伤阴，舌绛烦渴，发斑发疫，吐血， 衄血，咽喉肿痛。现代药理及临床研究表明鲜地黄可用于炎性疾病的治疗，如中耳炎、咽喉炎、关节炎、肝炎、红斑狼疮、肾炎、糖尿病等。但是至今仍未有关于鲜地黄雌激素样活性方面的研究报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决制备由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的药物，从而有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的治疗用药问题。本发明解决的技术方案是，鲜地黄水提物在制备雌激素药物中的应用，该鲜地黄水提物是，将鲜地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物，该鲜地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现鲜地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)药物中的应用。本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了鲜地黄药用新用途，临床意义巨大。
图I为本发明鲜地黄水提物对MCF-7细胞增殖的影响土s，n=8)示意图。图2为本发明鲜地黄水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响卩土s，n=10)示意图。图3为本发明鲜地黄水提物对ERE调控的报告基因瞬时表达结果^ 土s，n=3)示意图。图4为本发明鲜地黄水提物对ERE调控的报告基因瞬时表达结果^ 土s，n=3)示意图。
具体实施例方式以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体情况作详细说明。本发明在具体实施中，所述的鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用，该鲜地黄水提物是由以下实施例给出实施例I本发明在具体实施中，所述的鲜地黄水提物是，将鲜地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.) IOOg用其10倍重量的水IOOOg(即1000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物，得率为12. 03%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例2本发明在具体实施中，所述的鲜地黄水提物是，将鲜地黄(Rehmannia glutinosa Libosch. )200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物，得率为15. 84%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例3本发明在具体实施中，所述的鲜地黄水提物是，将鲜地黄(Rehmannia glutinosa Libosch. )300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物，得率为14. 99%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。根据上述方法按鲜地黄和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的鲜地黄水提物，并经反复实验，均取得了相同和相近似的结果，方法稳定可靠，所得鲜地黄水提物用于制备雌激素类药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下采用细胞增殖实验、动物实验及报告基因技术对其进行了充分证明，其有关试验资料如下首先通过MCF-7细胞增殖实验(E-SCREEN)，发现鲜地黄水提物能够促进MCF-7细胞的增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。其次通过小鼠子宫增重实验，证明鲜地黄水提物能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测，进一步验证鲜地黄水提物是通过与雌激素受体ERi3的结合而发挥雌激素样作用。发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下一、实验材料与方法I.实验药物玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜块根。秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，即为鲜地黄。鲜地黄以10倍重量的水煎煮2次，每次2h，水煎液减压干燥浓缩干燥得到鲜地黄水提物。2.实验动物与细胞株及质粒昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9 12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞(MCF-7)由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。P -半乳糖苷酶(P-galactosidase, P-gal)对照质粒P0 gal-Control、重组报告基因pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ER a (humanER a，hER a )表达载体pCXN2_hER a和重组人 ER3 (humanERP ,hERP )表达载体pCXN2_hERP由东京大学医学系Satoshi Inoue博士惠赠。3.主要试剂RPMI1640 培养基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂质体 LipofectamineTM2000Reagent购自 Gibco Invitrogen 公司；胎牛血清、无酌 红RPMI1640 培养基、17 ^ -雌二醇(17 ^ -estrogen, E2)、氨节青霉素(Amp)、Tris 碱和活性炭(Charcoal) 均购自Sigma公司；葡聚糖T-70 (Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酹片(合肥久联制药)；邻-硝基苯-P -D-半乳卩比喃糖苷(0-Nitrophenyl- ^ -D-galactopy ranoside, 0NPG)、EDTA、MTT 及 DMSO 为 Amresco 公司产品；Steady- GloR稳定突光素酶检测系统试剂盒(Steady- GloR Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo Iysis Buffer)购自Promega公司；其余试剂均为国产分析纯。4.所用主要仪器普通手术器械；二氧化碳培养箱(REVCO);倒置显微镜(NIKON ECLIPSE TS100)； KDC-160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；酶标仪(BI0-RAD 680);纯水仪(Sartorius 611VF) ;90_3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司);ZRD_7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)； AB204-N电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；10cm培养皿、 96孔培养板、冻存管均为Corning公司生产；超净工作台(江苏苏净集团)；UV_7504PC型紫外-可见分光光度计(福州健洋科技仪器有限公司)；VeritasTM微板光度计(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHP_150型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。5.实验方法5. 1MCF-7细胞增殖实验MCF-7细胞经无酚红含10%去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0. 25 %胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2 %去激素血清的 RPMI1640培养基吹打均匀，以IX IO4个/ml的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为 200 u I0培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37°C、5% CO2培养72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 U 1，37°C继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150 u 1DMS0， 震荡5 lOmin，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值 (A),计算平均A值和增殖率(Proliferation Rate, RP)。实验平行重复三次。RP =实验组A值/空白组A值K1X 100%5. 2小鼠子宫增重实验
将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水 O. 2ml/10g灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(O. 35mg/kg/d)灌胃；鲜地黄水提物按临床用药的20倍量X提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按O. 2ml/10g灌胃。最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重X (体重ΓΧΙΟΟ^ )。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。5. 3ERE调控的报告基因瞬时表达检测5. 3. I细胞接种于转染前72h将处于对数生长期的HEK293细胞接种于24孔板，密度为16. OX IO4 个/0. 5ml/孔，且培养液为含10%去雌激素血清的无酚红RPMI1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。5. 3. 2质粒的转染(I) 72h后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μ I含10%去雌激素血清的无酚红RPMI1640培养基。(2)取 3 只 EP 管，ERa 管中加 500 μ I 无酚红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2_hERa 质粒、8 μ IpERE-TAL-luc 质粒、8 μ Ip β gal-Control 质粒；ER^ 管中加 500 μ I 无酹红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2-hER β 质粒、8 μ lpERE-TAL-Iuc 质粒、8 μ I β gal-Control 质粒；脂质体管中加入1000 μ I无酚红RPMI1640培养基和24 μ I脂质体。(3)倒转混匀脂质体管，室温放置5min，取500 μ I分别加入ER α和ER β管，室温放置20min ；(4)倒转混匀ER α和ER β管，取80 μ IER α管中脂质体/DNA复合物分别加入24 孔板ERa实验孔，取80 μ 1ER0管中脂质体/DNA复合物分别加入24孔板ER β实验孔。前后摇匀，放入培养箱。(5) 6h后加入对照药物和检测药物。5. 3. 3ERE调控的报告基因瞬时表达检测加药后24h的细胞，吸去培养液，用ImlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-Glo 稳定突光素酶检测系统试剂盒(Steady-Glo Luciferase Assay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物(荧光素)，置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。5. 3.4 β-gal 活性检测为了考察转染效率，对内参照β -gal活性进行了检测。(I) 54 μ I β -巯基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管,每管加1800 μ I ;(2)每管加20 μ I裂解上清液；(3)每管加400 μ I 0NPG，倒转混匀；(4)放置37°C温箱，至显黄色；(5)加 Na2CO3Iml 终止反应；(6)测 OD420 值；二、统计处理实验数据以表示，SPSS13.0进行单因素方差分析(One-Way AN0VA)统计处理。
三、实验结果I.鲜地黄水提物对MCF-7细胞增殖影响的实验结果结果显示，鲜地黄水提物的剂量在O. 01 lmg/ml时与空白组相比对MCF-7细胞均有显著促增殖作用(P <0.01)。说明鲜地黄水提物在体外具有雌激素样作用。见表1， 图I。表I鲜地黄水提物对MCF-7细胞增殖的影响(x 土 s，n=8)
权利要求
1.一种鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用，该鲜地黄水提物是，将鲜地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物。
全文摘要
本发明涉及鲜地黄水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决制备由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，从而有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的治疗用药问题，该鲜地黄水提物是，将鲜地黄每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到鲜地黄水提物，该鲜地黄水提物可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，实现鲜地黄水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，方便，成本低，有效用于制备雌激素类药物，开辟了鲜地黄药用新用途。
文档编号A61K125/00GK102579673SQ20121006649
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者冯卫生, 刘朝妍, 王小兰, 蒋云, 郑晓珂 申请人:河南中医学院