专利名称：一种热保护剂及含有该热保护剂的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗用热保护剂及含有该热保护剂的疫苗，属于生物制品技术领域。
背景技术：
目前甲型肝炎减毒活疫苗常用冷冻干燥技术制成固体形态，疫苗中含有冻干保护剂及冻干后的水分，其中，水分是影响成品疫苗感染性滴度的关键因素，而减毒活疫苗的感染性滴度是决定减毒活疫苗免疫效果的唯一指标。因此，冻干甲型肝炎减毒活疫苗在生产过程中，尤其在冻干保护剂确定的条件下，至少还有二个决定疫苗质量的关键步骤，一是冻干程序的设置，二是冻干后水分含量的控制，而这两个关键步骤都受到冻干设备的限制，因此对设备的稳定性能以及设备的日常维护提出了更高的要求。冻干甲型肝炎减毒活疫苗虽是一种免疫效果很好的疫苗，但由于生产中需要经过冷冻干燥，不仅增加了疫苗生产的能耗，而且还增加了企业的生产和维护成本。此外，冻干甲型肝炎减毒活疫苗在运输及保存过程中，均要求温度控制在2°C 8°C，因此在长途运输及仓储过程中，还需支付高昂的制冷成本。
发明内容
为了解决冻干甲肝减毒活疫苗存在的冷冻干燥耗能，工艺流程长，运输及仓储温度控制严格，制冷成本高等问题，本发明提供一种热保护剂及含有该热保护剂的疫苗。采用液体热保护剂代替冻干保护剂，相比冻干型疫苗有以下2个优势
①省去了冷冻干燥过程，直接降低了生产过程的成本，减少了技术复杂性;@在37°C条件
下2周内能使疫苗感染性滴度维持平稳，因此能把运输和仓储过程的温度适度提高，减少运输及仓储过程的成本。本发明提供的是这样一种热保护剂，其特征在于每IOOml热保护剂溶液中含有下列的组分
泊咯沙姆O. I 15g组氨酸O. I 2. 5g
α乳糖I. O 8. Og硫酸锌O. I I. Og
甘氨酸O. I 2. Og硫酸镁O. 2 5. 0g。所述泊咯沙姆，α乳糖，甘氨酸，组氨酸，硫酸锌，硫酸镁均为市购医用级产品。本发明提供的是这样一种含有热保护剂的疫苗，其特征在于疫苗与热保护剂的体积比为1:1，其中，每IOOml热保护剂溶液中含有下列的组分
泊咯沙姆O. I 15g组氨酸O. I 2. 5g
α乳糖I. O 8. Og硫酸锌O. I I. Og甘氨酸O. I 2. Og硫酸镁O. 2 5. 0g。所述疫苗为甲型肝炎减毒活疫苗。所述热保护剂经过下列方法制得
1)将泊咯沙姆，甘氨酸，硫酸锌，用水溶解，经O.11 μ m滤膜过滤除菌后，得A溶液，40C 储存备用；
2)将α乳糖，组氨酸，硫酸镁，用水溶解，经O.Ilym滤膜过滤除菌后，得B溶液，4°C储存备用；
3)将步骤I)的A溶液与步骤2)的B溶液混合均匀，得液体热保护剂。所述含有热保护剂的疫苗经下列方法制得
按1:1的体积比，将液体热保护剂与疫苗混合搅拌均匀，得含有热保护剂的疫苗。本发明具有下列优点和效果采用上述方案制备的含有热保护剂的甲肝减毒活疫苗，其日常形态为液体，生产工艺较为简化，同时能较好的保持疫苗感染性滴度，经37°C热加速实验证实，疫苗感染性滴度能保持2周，保护效果较好。
具体实施例方式本发明实施例中使用的试剂如下
泊咯沙姆为市购USP级产品，分子量小于10，000。α乳糖为市购产品，纯度大于等于99%，经验分子式C12H22O11 ·Η20，分子量360. 31. 甘氨酸为市购L-甘氨酸，纯度大于等于99. 0%。组氨酸为市购L-组氨酸，纯度大于等于99. 0%。硫酸锌为市购产品，纯度大于等于99. 5%，分子式ZnSO4 · 7Η20,分子量为287. 56. 硫酸镁为市购产品，纯度大于等于99. 5%，分子式MgSO4 · 7Η20,分子量为246. 47.
BSA (99. 9%),购自 sigma 公司。甲肝快速ELISA试剂盒，购自中国医学科学院昆明医学生物研究所。甲型肝炎减毒活疫苗购自中国医学科学院昆明医学生物研究所。实施例I
1)、A溶液配制精确称取泊咯沙姆O.10g，甘氨酸O. 10g，硫酸锌O. 10g，用纯水溶解后 25°C下定容至50ml，经O. 11 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存；
2)、B溶液配制精确称取α乳糖I.0g，组氨酸O. lg，硫酸镁0. 2g，用纯水溶解后25°C 下定容至50ml,经0. 11 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存；
3)将步骤I)的A溶液和步骤2)的B溶液混合，用蠕动泵并在6mL/min的流速、4°C条件下均匀混合，得液体热保护剂；
4)将步骤3)的液体热保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗按I:I体积比，用蠕动泵并在6mL/ min的流速、4°C条件下均匀混合，得含有热保护剂的甲型肝炎减毒活疫苗。实施例2
1)、A溶液配制精确称取泊咯沙姆15.Og,甘氨酸2. Og,硫酸锌I. 0g，用纯水溶解后 25°C下定容至50ml，经0. 11 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存；
2)、B溶液配制精确称取α乳糖8.0g，组氨酸2.5g，硫酸镁2.0g，用纯水溶解后25°C 下定容至50ml,经0. Ilym滤膜过滤除菌后4°C储存；3)将步骤I)的A溶液和步骤2)的B溶液混合，用蠕动泵并在6mL/min的流速、4°C条件下均匀混合，得液体热保护剂；
4)将步骤3)的液体热保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗按I:I体积比，用蠕动泵并在6mL/ min的流速、4°C条件下均匀混合，得含有热保护剂的甲型肝炎减毒活疫苗。实施例3
1)、A溶液配制精确称取泊咯沙姆3.0g，甘氨酸O. 60g，硫酸锌O. 30g，用纯水溶解后 25°C下定容至50ml，经O. 11 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存；
2)、B溶液配制精确称取α乳糖8.0g，组氨酸0.62g，硫酸镁1.93g，用纯水溶解后 25°C下定容至50ml，经O. 11 μ m滤膜过滤除菌后4°C储存；
3)将步骤I)的A溶液和步骤2)的B溶液混合，用蠕动泵并在6mL/min的流速、4°C条件下均匀混合，得液体热保护剂；
4)将步骤3)的液体热保护剂与甲型肝炎减毒活疫苗按I:I体积比，用蠕动泵并在6mL/ min的流速、4°C条件下均匀混合，得含有热保护剂的甲型肝炎减毒活疫苗。为表明热保护剂对甲型肝炎减毒活疫苗的保护效果，本发明在45°C及37°C条件下，用常规的ELISA方法分别检测实施例1、2、3所得含有热保护剂的疫苗感染性滴度
一、热加速实验
(I)将甲肝减毒活疫苗分为有热保护剂的45°C组、有热保护剂的37°C组、无保护剂的 45°C组、无保护剂的37°C组。每组10份，分装于Eppendorf管，每支管500 μ I。⑵取上述有热保护剂的45°C组10支置于45°C，分别在I天后，2天后，3天后，5 天后，10天后取出，每次取2支。⑶取上述有热保护剂的37°C组10支置于37°C分别于I周后，2周后，3周后，4周后，5周后取出，每次取2支。⑷取无保护剂45°C组10支置于45°C，分别在I天后，2天后，3天后，5天后，10天后取出，每次取2支。(5J取无保护剂37 C组10支直于37 C分别于I周后，2周后，3周后，4周后，5周后取出，每次取2支。二、ELISA检测疫苗感染性滴度
U)将热加速后的所有样品及对照组均作10倍系列稀释，取稀释度为10_4疫苗接种入
细胞，每个稀释度接种2孔，每孔100 μ 1，置5%C02，37°C培养箱吸附I小时，完成后加维持液每孔2ml继续培养21天，于第7天及第14天更换维持液。接种病毒后的细胞继续培养至第21天，弃维持液，用O. OlM PBS溶液洗细胞面3次，每孔加250 μ I含有1% Triton X-100 的O. OlM PBS溶液，置37°C作用20分钟裂解细胞释放病毒，裂解液4°C离心30分钟，转速 14. 8 X IO3转/分钟。离心后取上清液进行ELISA检测。
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⑵按ELISA试剂盒中的说明包被ELISA板，一抗为人H2株HAV-IgG特异性抗体，
酶标二抗为人H2株HRP标记HAV-IgG特异性抗体，首先用包被缓冲液按1:1000稀释一抗， 包被96孔板，每孔100 μ 1，4°C湿盒过夜；取出后用洗涤缓冲液洗板3次，用含I. 5% BSA的 O. OlM PBS溶液封闭，每孔100 μ 1，37°C湿盒40分钟；封闭完成后洗板3次。(3)裂解上清液各取100 μ I加入包被好的ELISA板，每份裂解液重复2孔，置37°C
湿盒反应I小时，反应完成后洗板3次，加按1:3000稀释的酶标二抗，每孔100 μ 1，37°C湿盒反应I小时。反应完成后洗板3次，避光条件下加入显色液，每孔100 μ 1，反应5分钟，反应完成后加浓度为2mol/L的硫酸每孔100 μ I终止反应。阳性参照孔加入无保护剂减毒甲肝活疫苗；
阴性参照孔加入疫苗与PBS以I: I体积混合后做10倍系列稀释，取稀释度为10_5的稀释液，平行3孔。三、结果如下
实施例I的45°C热加速后疫苗感染性滴度结果见表I ;
实施例I的37°C热加速后疫苗感染性滴度结果表2 ；
实施例2的45°C热加速后疫苗感染性滴度结果见表3 ；
实施例2的37°C热加速后疫苗感染性滴度结果表4 ；
实施例3的45°C热加速后疫苗感染性滴度结果见表5 ；
实施例3的37°C热加速后疫苗感染性滴度结果表6 ；
表I 45°C热加速后疫苗感染性滴度(lgCCID5(l/ml)变化
权利要求
1.一种热保护剂，其特征在于每IOOml热保护剂溶液中含有下列的组分泊咯沙姆0. I 15g组氨酸0. I 2. 5ga乳糖I. 0 8. Og硫酸锌0. I I. Og甘氨酸0. I 2. Og硫酸镁0. 2 5. 0g。
2.如权利要求I所述的热保护剂，其特征在于所述泊咯沙姆，a乳糖，甘氨酸，组氨酸， 硫酸锌，硫酸镁均为市购医用级产品。
3.一种含有热保护剂的疫苗，其特征在于疫苗与热保护剂的体积比为1:1，其中，每 IOOml热保护剂溶液中含有下列的组分泊咯沙姆0. I 15g组氨酸0. I 2. 5ga乳糖I. 0 8. Og硫酸锌0. I I. Og甘氨酸0. I 2. Og硫酸镁0. 2 5. 0g。
4.如权利要求I所述的含有热保护剂的疫苗，其特征在于所述疫苗为甲型肝炎减毒活疫苗。
全文摘要
本发明提供一种热保护剂及含有该热保护剂的疫苗，热保护剂是每100ml热保护剂溶液中含有下列的组分泊咯沙姆0.1～15g，组氨酸0.1～2.5g，α乳糖1.0～8.0g，硫酸锌0.1～1.0g，甘氨酸0.1～2.0g，硫酸镁0.2～5.0g；疫苗与热保护剂的体积比为1:1。所得含有热保护剂的甲肝减毒活疫苗，其日常形态为液体，生产工艺较为简化，同时能较好的保持疫苗感染性滴度，经37℃热加速实验证实，疫苗感染性滴度能保持2周，保护效果较好。
文档编号A61K39/29GK102580103SQ20121008015
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者冯凯, 王海漩, 胡云章, 胡凝珠 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所