专利名称：一种冻干灭活乙型脑炎疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型冻干灭活乙型脑炎全病毒疫苗。
背景技术：
流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B,简称乙脑)的病原体1934年在日本发现，故又称日本乙型脑炎(Japanese Encephalitise)。乙脑病毒属披膜病毒科黄病毒属，球形病毒颗粒外有囊膜，对温度、乙醚等有机溶剂敏感。乙脑病毒经蚊虫传播，夏秋季流行。全球每年发病约50000例，主要流行地区为我国南方、东南亚及热带地区等国家，WHO建议所有乙脑流行国家均应实施乙脑疫苗免疫。目前国际上使用的乙脑疫苗主要为全病毒乙脑灭活疫苗和减毒活疫苗。疫苗在运输和储存过程中保持良好稳定性是保证疫苗免疫效果的关键。与液体制剂相比，冻干疫苗具有更好的稳定性。目前我国绝大部分冻干疫苗含有动物源蛋白，如人血白蛋白、明胶等。人血白蛋白及明胶具有携带源自动物本身病毒等外源因子的潜在危险，同时，明胶或血清蛋白也常常引起疫苗受种者的过敏反应。因此有必要寻找一种适合于全病毒灭活疫苗的稳定的不含蛋白的赋形剂，尤其是适合于乙脑全病毒的稳定剂。另外，由于纯化疫苗中杂蛋白含量较低，与疫苗有效蛋白加在一起总蛋白含量也仅为100微克以内，病毒颗粒处于完全裸露状态，因此比起未经纯化的疫苗，纯化疫苗更加不稳定。本发明的目的就是建立一种不含明胶和人血白蛋白的稳定剂和赋形剂配方，使疫苗在冻干、储存及运输过程中保持良好的稳定性。
发明内容
本发明提供了一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含(a)灭活的乙脑全病毒；(b)稳定剂，其包含麦芽糖，乳糖，和任选地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸(优选地，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸中的一种或更多种，更优选地为精氨酸)；以及任选地(c)缓冲剂(优选地,磷酸盐)，表面活性剂(优选地，tween80),等渗调节剂(优选地钠盐，更优选地氯化钠)，和/或螯合剂(优选地EDTA或EDTA钠盐)。在一个实施方式中，本发明的乙脑全病毒冻干制剂中稳定剂为麦芽糖，乳糖。在一个实施方式中，本发明的乙脑全病毒冻干制剂中稳定剂为麦芽糖，乳糖和海藻糖。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和甘露醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和甘露醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和山梨醇。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式中，所述稳定剂为麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇和精氨酸。在一个实施方式 中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，甘露醇，氯化钠和磷酸盐缓冲剂。在一个实施方式中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，氯化钠和磷酸盐缓冲剂。在一个实施方式中，本发明的冻干制剂包含灭活的乙脑全病毒，麦芽糖，乳糖，海藻糖，精氨酸，和磷酸盐缓冲剂。本文所述稳定剂并不排除所述物质除了稳定作用之外还起其它作用，例如，所述麦芽糖，乳糖，海藻糖，甘露醇等物质还可以起赋形剂的作用。其它物质的命名(例如，缓冲齐 ，表面活性剂，等渗调节剂，螯合剂等等)也是类似的。本发明的乙脑全病毒冻干制剂不包含动物源蛋白质，例如明胶和人血白蛋白。本发明的乙脑全病毒冻干制剂中所述灭活的乙脑全病毒是以VERO细胞或者人二倍体细胞为基质生产的，优选地，采用生物反应器和无血清培养基培养细胞和繁殖病毒。本发明的乙脑全病毒冻干制剂中所述灭活乙脑病毒采用下述方法灭活将收获的病毒悬液经过超滤浓缩、超速离心纯化后用甲醛灭活。本发明的乙脑全病毒冻干制剂在使用前需要进行重构，重构按照本领域的已知方法并根据生产商提供的说明书进行。例如，在一个实施方式中，本发明的冻干制剂用O. I-Iml注射用水/ 一次人用剂量(例如，O. 4-0. 6ml注射用水/ 一次人用剂量，例如O. 5ml注射用水/一次人用剂量)进行重构。本文所述一次人用剂量优选地为一个包装单元的剂量，例如一瓶冻干制剂剂量。在本发明的乙脑全病毒冻干制剂重构后的溶液中病毒的浓度为10-20微克/ml，并且总蛋白不高于20微克/ml，糖类(例如，麦芽糖，乳糖和海藻糖)的浓度(W/W)为I % -15% (例如，1-14%, 1-13%, 1-12%, 1-11%, 1-10 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10%,11%，12%，13%，14%，15% 等)，例如，麦芽糖浓度(W/W)为 1-10% (例如，I %，2 %，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)，乳糖浓度(W/W)为 1-10% (例如，I %，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)，海藻糖浓度(W/W)为 0-10% (例如，O. 1%,0. 2%,O. 3%,0.4%，0.5%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%等)。下述物质如果存在的话，其在所述冻干制剂重构后的溶液中的浓度分别为如下所述甘露醇 2 % -20 % (W/W)，山梨醇 2-10 % (ff/ff)，EDTA 或者 EDTA 钠盐 O. 03-3 % (V/ff)，tween80 O. 001-0. I % (ff/ff)，磷酸盐缓冲液 IOmM-IOOmM,氯化钠 O. 05-0. 15M,精氨酸O. 35 O. 9mM,谷氨酸O. 8 I. 6mM,谷氨酰胺O. 15 O. 45mM,赖氨酸O. 385 O. 77mM。本文所用的“W/W”表示“重量/重量”。在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖与乳糖的重量比为0.5 : 1-1 : O. 5,在一个实施方式中，所述重量比为O. 6 : 1-1 : O. 6,在一个实施方式中，所述重量比为O. 7 1-1 O. 7，在一个实施方式中，所述重量比为0.8 1-1 O. 8，在一个实施方式中，所述重量比为O. 9 1-1 O. 9，在一个实施方式中，所述重量比为I : I。在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖与海藻糖的重量比为10 : 1-2 : I,在一个实施方式中，所述重量比为9 1.2 1，在一个实施方式中，所述重量比为8 : 1.2 : 1，在一个实施方式中，所述重量比为7 1-2 1，在一个实施方式中，所述重量比为6 1.2 1，在一个实施方式中，所述重量比为5 1-2 1，在一个实施方式中，所述重量比为4 : 1-2 : I,在一个实施方式中,所述重量比为3 : 1-2 : I,在一个实施方式中，所述重量比为5 2。在一个实施方式中，本发明冻干制剂中麦芽糖乳糖海藻糖的重量比为5 : 5 : 2，在一个实施方式中，所述重量比为10 5 4，在一个实施方式中，所述重量比为10 10 1，在一个实施方式中，所述重量比为10 : 5 : I。 本发明还提供了上述任一种乙脑全病毒冻干制剂重构所得的液体制剂。在一个实施方式中，所述液体制剂为用O. 5ml注射用水将冻干制剂重构获得。本文所述“包含”，“包括”等类似开放式用语也涵盖了“由......组成”的情形。本发明与现有的疫苗相比具有显著的优越性。表I为本发明疫苗的一种配方与现有乙脑疫苗配方的比较表I现行乙脑疫苗赋形剂与本发明配方比较
权利要求
1.一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含 (a)灭活的乙脑全病毒； (b)稳定剂，其包含麦芽糖，乳糖，和任选地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸(优选地，精氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸中的一种或更多种，更优选地为精氨酸)； 以及任选地 (C)缓冲剂(优选地,磷酸盐),表面活性剂(优选地，tween80),等渗调节剂(优选地钠盐，更优选地氯化钠)，和/或螯合剂(优选地EDTA或EDTA钠盐)。
2.权利要求I的乙脑全病毒冻干制剂，所述制剂不包含动物源蛋白质，例如明胶和人血白蛋白。
3.权利要求I的乙脑全病毒冻干制剂，所述灭活的乙脑全病毒是以VERO细胞或者人二倍体细胞为基质生产的，优选地，采用生物反应器和无血清培养基培养细胞和繁殖病毒。
4.权利要求3的乙脑全病毒冻干制剂，所述灭活乙脑病毒采用下述方法灭活将收获的病毒悬液经过超滤浓缩、超速离心纯化后用甲醛灭活。
5.权利要求I的乙脑全病毒冻干制剂，其中在所述冻干制剂重构后的溶液中病毒的浓度为10-20微克/ml，并且总蛋白不高于20微克/ml。
6.权利要求I的乙脑全病毒冻干制剂，其中在所述冻干制剂重构后的溶液中糖类(例如，麦芽糖，乳糖和海藻糖)的浓度为1^-10% (W/W)。
7.权利要求I的乙脑全病毒冻干制剂，其中下述物质如果存在的话，其在所述冻干制剂重构后的溶液中的浓度分别为如下所述甘露醇2%-20% (W/W)，山梨醇2-10% (ff/ff)，EDTA 或者 EDTA 钠盐 0. 03-3 % (ff/ff)，tween80 0. 001-0. I % (ff/ff)，磷酸盐缓冲液IOmM-IOOmM,氯化钠0. 05-0. 15M,精氨酸0. 35 0. 9mM,谷氨酸0. 8 I. 6mM,谷氨酰胺.0.15 0. 45mM,赖氨酸 0. 385 0. 77mM。
8.权利要求5-7任一项的乙脑全病毒冻干制剂,其中所述重构是用0.I-Iml注射用水/ 一次人用剂量(例如，0. 5ml注射用水/ 一次人用剂量)进行的。
9.由权利要求1-8任一项的乙脑全病毒冻干制剂重构所得的液体制剂。
全文摘要
本发明提供了一种乙脑全病毒冻干制剂，其包含(a)灭活的乙脑全病毒；(b)稳定剂，其包含麦芽糖，乳糖，和任选地，海藻糖，甘露醇，山梨醇和/或氨基酸；以及任选地(c)缓冲剂，表面活性剂，等渗调节剂)，和/或螯合剂。
文档编号A61K47/26GK102631672SQ20121013111
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者任秀宝, 石慧颖 申请人:天津百若克医药生物技术有限责任公司