与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的抗体及其治疗和成像用途

与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的抗体及其治疗和成像用途
【专利摘要】本发明涉及与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体和耐久霉素肽以及它们在治疗病毒感染和癌症中的用途。本发明公开了关于阴离子磷脂和氨基磷脂在肿瘤血管结构和病毒入侵及传播中的作用的惊人发现，以及将这些发现用于治疗癌症和病毒感染的组合物和方法。本发明还公开了可结婚并抑制阴离子磷脂和氨基磷脂的有益抗体、免疫缀合物和基于耐久霉素的组合物和联合，可用于安全有效的治疗癌症、病毒感染和相关疾病。
【专利说明】与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的抗体及其治疗和成像用途
[0001]发明背景
[0002]本申请是于2003年7月15日提交的中国发明专利申请03816751.4的分案申请。本申请要求于2002年7月15日提交的、系列号为60/396263的共同待审美国临时申请的优先权，该文件的公布内容，包括说明书、权利要求、附图和序列在此都特别收编作为参考而并未放弃。
[0003]1.发明领域
[0004]本发明涉及氨基磷脂和阴离子磷脂生物学、肿瘤血管和病毒感染领域。它提供了惊人的新组合物、方法和组合，可用于肿瘤血管的靶向和癌症治疗、抑制病毒侵入和扩散以及治疗病毒感染。本发明另外还提供了许多结合并抑制氨基磷脂和阴离子磷脂的优选抗体、免疫缀合物和基于耐久霉素的组合物，可用于治疗癌症、病毒感染和有关疾病。
[0005]2.相关领域描述
[0006]肿瘤细胞对化疗剂的抗性在临床肿瘤学中是一个重要问题。在肿瘤治疗中要解决的另一主要问题是期望“全部细胞杀死”，即，杀死所有能不受控生长并取代通过治疗可去除的任何肿瘤块的所谓“克隆源性”恶性细胞。尽管在此领域内有了一定的进展，但这仍是为何许多普遍形式的人类癌症依然耐受有效的化学治疗干预的两个主要原因。
[0007]对于开发接近全部细胞被杀死的疗法这一目的而言，某些类型的肿瘤比其它类型灵易受治疗的影响。例如，淋巴瘤等软组织肿瘤和白血病等血液和血液形成器官的肿瘤通常比癌瘤等实体瘤对化学疗法更有反应性。
[0008]软组织肿瘤和以血液为基础的肿瘤对化学疗法的易感性的一个原因是淋巴瘤和白血病细胞更易于接受化学疗法干预。简而言之，大部分化疗剂到达实体瘤块的所有细胞比到达软组织肿瘤和以血液为组织的肿瘤的所有细胞要难得多，因此完成全部细胞杀死也要困难得多。增加化疗剂的剂量大部分情况下常常会导致毒副作用，这通常限制了常规抗肿瘤剂的效力。
[0009]另一肿瘤治疗方法是使用“免疫毒素”，其中用抗肿瘤细胞抗体将毒素投递至肿瘤细胞。不过，和化学治疗方法一样，免疫毒素疗法在应用于实体瘤时也存在着重要的缺点。例如，抗原阴性或抗原缺乏的细胞能继续存活并再生成肿瘤或导致进一步的转移。实体瘤对基于抗体的疗法有耐受性的另一原因是肿瘤块对于抗体和免疫毒素等大分子剂来说通常是不能通过的。肿瘤内的物理扩散距离和间质压力都造成了对此类型疗法的限制。
[0010]改良的治疗方法是靶向于实体瘤的血管结构。靶向于肿瘤血管而非肿瘤细胞本身具有一定的优越之处，即这不太可能导致抗性肿瘤细胞的发生，而且被靶向的细胞容易接近。此外，血管的破坏导致了抗肿瘤效果的扩大，因为许多肿瘤细胞依赖单一血管来提供其氧气和养分。例示性的血管靶向剂(VTAs)如美国专利5855866、5965132、6261535、6051230和6451312中所述，这些文献描述了抗细胞剂和毒素向肿瘤血管结构标记物的靶向投递。[0011 ] 另一有效的血管靶向方案是将凝血因子靶向于肿瘤血管结构或基质中表达或吸附的标记物(Huang等，1997 ;美国专利申请6093399、6004555、5877289和6036955)。将凝血剂而非毒素投递至肿瘤血管结构具有另外的优越之处，即降低了免疫原性，甚至减少了产生毒副作用的风险。如美国专利5877289中所述，用于所说的肿瘤特异性“凝血配体”中的优选凝固因子是截短形式的人凝血诱导蛋白质，组织因子(TF)，即血液凝结的主要起始因子。
[0012]最近，氨基磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)被确定为肿瘤血管结构的特殊标记(Ran等，1998)。这引起了对用于投递抗细胞剂、毒素和凝血因子至肿瘤血管的新型抗PS和抗PE免疫缀合物的开发(美国专利6312694)。此外，还发现未缀合的抗PS和PE抗体无需与治疗剂附着就可发挥抗癌作用，这已知为针对肿瘤血管靶向和治疗的氨基磷脂“裸抗体”方法(美国专利6406693)。
[0013]尽管前述免疫缀合物和氨基磷脂血管靶向方法代表了肿瘤治疗中的重大进展，但某些外周肿瘤细胞在这些疗法所造成的普遍肿瘤破坏当中仍能幸存。因此考虑将抗血管发生的方法与美国专利5855866、6093399、6312694和6406693中的VTA、凝血配体和氨基磷脂靶向方法结合使用，前者抑制了从原先存在的血管和/或循环内皮干细胞中发展出新的血管结构。
[0014]血管发生不仅在胚胎发生、伤口愈合和月经等生理学过程中起着重要的作用，还涉及肿瘤生长、关节炎、牛皮癣和糖尿病性视网膜病等病理活动(Ferrara，1995)。应用于肿瘤治疗中时，抗血管发生的方法是以抑制开始发生的血管的增殖(通常在实体瘤的外围)为基础的。这些疗法通常用于在较常规的干预治疗(如外科手术或化疗)后降低实体微小转移的风险或抑制实体瘤的进一步生长。
[0015]美国专利6342219、6524583、6342221和6416758描述了与血管发生的一种主要刺激物血管内皮生长因子_A(VEGF，以前已知为血管渗透因子VPF)结合的抗体和免疫缀合物。这些抗体具有只抑制VEGF与两个主要VEGF受体中的一个结合的重要优势。通过阻断VEGF与VEGF2而非VEGFl的结合，这些抗体在提高安全性的同时，保持了例如巨噬细胞、破骨细胞和破软骨细胞功能中由VEGFRl所介导的有利功效。
[0016]尽管前述方法促进了肿瘤治疗领域的发展，仍然需要开发另外的或可选择的血管靶向疗法。为了扩大治疗选择的数目，需要鉴定肿瘤血管结构的新标记。具有抗癌特性的新的裸抗体的开发会是一个尤其重要的进展，因为它允许相同的靶向部分既作为单一治疗剂也作为血管靶向剂用于投递其它的药物。在同一分子内具有抗血管发生和抗血管，即肿瘤破坏性特征的治疗剂是很有价值的。更重要的进展将是在其它系统中具有抗癌特性和治疗作用的治疗剂的确定。开发既能治疗癌症又能治疗病毒感染(这是此阶段最重要的医学疑症中的两种)的制剂应是一个引人注目的重要突破。
[0017]发明简述
[0018]本发明通过提供新方法和组合物用于安全有效的肿瘤血管靶向、抗血管发生和破坏肿瘤来致力于解决现有技术中的前述需要及其它需要，所说的方法和组合物对于抑制病毒入侵和扩散以及治疗病毒感染和疾病也出乎意料地非常有效。本发明在某种程度上基于的是关于肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达和作用以及病毒入侵和扩散中氨基磷脂和阴离子磷脂的参与这些惊人发现。本发明另外还提供了结合氨基磷脂和阴离子磷脂的特别有效的抗体和免疫缀合物，以及与磷脂酰乙醇胺结合的以肽为基础的一类新型衍生物。
[0019]综述:在第一个全面的实施方案中，本发明根据下述意外的发现，即诸如磷脂酰肌醇(PD、磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)(以及磷脂酰丝氨酸PS)等的阴离子磷脂是肿瘤血管结构上的易接近且可稳定靶向的标记物，提供了用于肿瘤血管靶向、肿瘤成像和治疗的新方法。此实施方案起因于抗PA、P1、PG和其它阴离子磷脂组分的抗体特异地定位于实体瘤的血管结构的意外发现。
[0020]本实施方案的其它方面源自另一意外发现，即，在缺乏与毒素或凝血剂等效应分子缀合的的情况下，抗PA、PI和PG(以及PS)等阴离子磷脂的裸抗体可特异性抑制体内肿瘤血管发生并诱发血管结构的毁坏和肿瘤坏死。本发明因此提供了利用结合阴离子磷脂的单一组分且基于抗体的治疗剂进行血管靶向、抗肿瘤发生和肿瘤治疗的安全有效的方法。
[0021]本发明的根本不寻常的特征是，至少在很大程度上，阴离子磷脂向肿瘤血管内皮细胞表面的转位与细胞损伤和细胞凋亡或其它细胞死亡机制无关。因此肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达不是细胞死亡和毁坏的结果或触发物，而是发生于形态完整的血管内皮细胞中。这意味着肿瘤血管结构中阴离子磷脂的表达不是短暂的，而是足够稳定的，从而能为治疗性干预提供靶目标。
[0022]由于发现了阴离子磷脂在肿瘤血管结构中被稳定诱导，本发明还提供了利用抗阴离子磷脂抗体的免疫缀合物进行肿瘤血管成像和破坏的一系列新方法和组合物。这些免疫缀合物包含有效连接了毒素和凝血剂等治疗剂且可用于将诊断剂和治疗剂特异投递至肿瘤血管内皮细胞膜表面的抗阴离子磷脂抗体。治疗剂被投递至与肿瘤血管内皮细胞膜密切接触，从而可以快速进入靶细胞或迅速与效应细胞、凝血级联过程中的组分等缔合。
[0023]在第二个全面的实施方案中，本发明提供了与氨基磷脂和阴离子磷脂结合的许多优选抗体(以及相关的免疫缀合物和组合物)，所说的抗体具有优于本领域已知的其它抗体的结构和特性。这些所谓的“第二代”或改良的抗体将优选用于本文所述的抗血管发生、抗癌和抗病毒以及其它治疗方法中。
[0024]通过提供不具有本领域抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体通常相关联的病理特性的治疗用抗体，本领域所提供的与氨基磷脂和阴离子磷脂结合的新型抗体克服了现有技术中的各种缺点。本发明的开发，在部分程度上，是利用了从本发明
【发明者】对肿瘤血管内皮细胞中磷脂性能的独特观察结果中发展而来的新免疫接种和筛选技术，并且胜过了从疾病相关抗磷脂抗体中产生的抗体。这样的抗体不仅具有独一无二的特性和改良的安全性，还与比较研究中的已有抗体同样有效或更有效。利用所提供抗体的特定分类，本发明这些方面的组合物和方法还延伸到了免疫缀合物和化合物的用途。
[0025]在本发明之前，结合氨基磷脂和阴离子磷脂且具有本文所公布的新抗体特性的抗体是未知的。不过，根据本文所公布的发明，目前为本领域提供了产生新的候选抗体的方法以及通过检测这些抗体从候选抗体集合中鉴定更多的有用抗体的技术。因此，根据本发明，可以制备具有优越特性和氨基磷脂和阴离子磷脂结合特征的一系列抗体，它们不会有现有技术中的抗体相关的显著缺点和副作用。因此这样的抗体可用于多种实施方案中，包括抑制血管发生和治疗癌症和病毒感染。
[0026]除了本文所提出的新免疫法和筛选技术之外，现在可以利用单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4通过竞争和/或功能检测法鉴定与氨基磷脂和阴离子磷脂结合且具有许多优越特性的抗体。目前，1B12、3B10、9D2和3G4抗体是优选的，因为这些抗体在结合磷脂时不需要血清。更优选单克隆抗体9D2和3G4，目前最优选单克隆抗体3G4(ATCC4545)。为了鉴定与任何前述抗体竞争的另外的抗体，优选3G4，目前优选的检测法是基于ELISA进行的竞争性检测法，其中的许多种方法在此进行了描述，而有关的工作实施例也公布于此。
[0027]在第三个全面的实施方案中，本发明提供了与氨基磷脂的一种-磷脂酰乙醇胺(PE)结合的细胞不可渗透且以肽为基础的新型衍生物。这些“结合PE的肽衍生物”至少包含第一 PE结合肽，优选耐久霉素，它已被修饰成基本上防止了非特异的毒性，这优选通过修饰PE结合肽(优选耐久霉素)而形成基本上细胞不可渗透或基本上无孔形成的结合PE的构建物来实现。
[0028]“基本上细胞不可渗透的”结合PE的构建物或耐久霉素的产生优选通过将结合PE的肽或耐久霉素与至少一种第一细胞不渗透基团结合而完成的。在此描述了许多典型耐久霉素衍生物的合成。“细胞不渗透基团或基团组”可以是小分子、惰性载体或其自身可以是赋予所产生构建物进一步靶向功能的靶向分子，诸如靶向于肿瘤血管结构。因而，结合PE的肽可以是与惰性载体连接的唯一靶向药剂，或者可以是分别将靶向功能赋予构建物的两种药剂之一。此外，结合PE的肽，优选耐久霉素，与效应分子有效的连接，从而使结合PE的肽或耐久霉素提供靶向功能，而所连接的药剂一旦递送至靶细胞则具有充分的治疗功效。优选的例子是与核苷等抗病毒剂连接的结合PE的肽或耐久霉素。
[0029]由于正常条件下正常细胞表面基本上不存在PE，所以本发明的基本上细胞不可渗透的结合PE的肽可以发挥选择性结合诸如肿瘤血管内皮细胞、增殖和/或病毒感染细胞等异常细胞或疾病相关细胞表面上的PE的功能。通过与所说的异常靶细胞结合，结合PE的构建物或衍生物抑制或阻断PE在那些细胞中的功能，因此产生全面的治疗效用，如，在肿瘤和/或病毒疾病的治疗中。本文公布了基本上细胞不可渗透的结合PE的肽在抑制病毒入侵和扩散中的成功应用。在将结合PE的肽与诸如西多福韦等抗病毒药剂连接的实施方案中，提供了更有效且更安全的抗病毒疗法。
[0030]在第四个全面的实施方案中，本发明进一步提供了抑制病毒复制、感染和扩散的一类重要的新型组合物和方法，可用于治疗病毒感染和疾病。这些方法基于的是如下不寻常的观察结果:结合诸如PS、PE、P1、PA和PG(尤其是PS和PE)等氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体和肽会是安全有效的抗病毒剂。本发明不仅已证实了此观察结果是正确的，还提供了数据显示结合氨基磷脂和阴离子磷脂的抗体和肽在对抗病毒扩散中出乎意料的有效，意味着这些药剂可广泛的应用于一系列病毒感染及相关疾病的治疗中。
[0031]这些发现进一步包括使用新类型的免疫缀合物、组合物、药剂盒和方法，其中抗氨基磷脂或阴离子磷脂(尤其是PS和PE)的抗体与抗病毒药剂有效连接。基本上细胞不可渗透的结合PE的肽衍生物，如耐久霉素肽衍生物，也可与抗病毒剂连接。因而这些药剂中的每一种都提供了独特地靶向于病毒感染细胞的新抗病毒药物。
[0032]因此，在异常血管发生、癌症和病毒感染及疾病治疗中有效的新型安全治疗剂的开发是现有技术中的一个突破。
[0033]尽管可以有效的单独应用，但本发明的各种方法和组合物还可与其它疗法和药剂结合使用，以提供综合治疗方法和本发明的相关组合物、药物和药剂盒。因此，在第五个全面的实施方案中，正如本文将要更详细描述的，本发明进一步提供了具体的联合组合物、方法和药剂盒，如，用于癌症治疗中，发现它们在一起作用时效果意外的好。
[0034]第二代抗体:在本文实施例1V中描述了在产生具有目的特性的抗体中发挥良好功能的某些方法，这些方法包括在所附权利要求中。这些方法可以产生本发明的优势抗体，代表性的有单克隆抗体 1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2 和 3G4，尤其是 3G4 (ATCC 4545)。
[0035]本发明因此提供了纯化的抗体及其抗原结合片段和免疫缀合物，它们与至少一种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合，而且与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4(ATCC 4545)，最优选与3G4有效竞争结合氨基磷脂或阴离子磷月旨，优选PS。
[0036]当用于整个申请文件各处时，术语“一个”、“一种”指“至少一种(个)”、“至少第一种(个)”、“一种(个)或多种(个)”或“众多”所提及的组分或步骤，除非在其后特别提出了一个上限。因此，一种(个)“抗体”，用于此处时，指“至少第一种抗体”。正如已知任何单一药剂的量一样，本领域普通技术人员根据本申请的内容将了解各组合的可行限量和参数。
[0037]在某些方面，抗体将与单克隆抗体1B9、1B12、3B 10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4 (ATCC 4545)，最优选与3G4有效竞争结合氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，或者具有单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4，优选9D2或3G4，最优选3G4的氨基磷脂或阴离子磷脂结合特征，如表4中所示；且将不具有血清依赖性，即其结合氨基磷脂或阴离子磷脂时不需要血清；并非来自患病者，且不会显著抑制体外凝结反应，引起体内显著的血栓形成或具有狼疮抗凝剂活性。
[0038]优选的，与文献中的抗体相比，所说的抗体还将在对照研究中展示结构性质的改良或有利功能特性的范围或程度的增进，诸如对于IgG而言，具有更高的亲合力或显示出与活化内皮细胞的结合增强，增强了对内皮细胞增殖或血管发生的抑制，提高了肿瘤血管定位、抗癌和/或抗病毒作用。
[0039]因此本发明的独特方面是以
【发明者】最早的、意外的制备出具有前述、另外公布的和固有的有利特性的抗体为基础的。目前已提供了一组优选抗体和许多特别优选的抗体，本发明进一步包含一类表位特异性确定的抗体，其中所说的抗体或其抗原结合片段与单克隆抗体 1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2 或 3G4,优选与 9D2 或 3G4 (ATCC 4545)，最优选与 3G4有效竞争抗原的结合，从而它们结合的表位基本上与单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G 7、7C5、9D2或3G4，优选与9D2或3G4，最优选与3G4(ATCC 4545)的结合表位相同。
[0040]根据本说明书和方便获得的技术文献、实际知识和起始资料，本申请中要求保护的发明能够得到实施。尽管如此，以本发明申请者Broad of Regents, The Universityof Texas System的名义提交了产生3G4单克隆抗体的杂交瘤细胞系小鼠杂交瘤Mab3G4-2B 样品，在美国典型培养物保藏中心(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas,VA20110-2209，美国保存。该样品是由许可证持有者Peregrine制药有限公司的附属机构美国 Avid B1services 有限公司，14272 Franklin 大街，Tustin, CA92780 在 2002 年 7 月8日开始的一周内提交的，2002年7月10日收到，7月12日证明是存活的，2002年7月30日指定ATCC登记号为PTA 4545。
[0041] 此保藏是根据用于专利程序的国际公认的微生物保藏布达佩斯条约有关条款及其细则(布达佩斯条约)进行的。所说的杂交瘤将根据布达佩斯条约的规定在授予美国专利权后由ATCC向公众提供。已保存的杂交瘤的可获得性不能解释为可以违反任何政府当局根据其专利法所批准权利实施本发明的许可。
[0042]根据所研究的抗体、优选的抗体和本文所公布及本领域已知的技术，现在向本领域普通技术人员提供了一种结合氨基磷脂或阴离子磷脂且具有有利特性的新型抗体。这些抗体“类似”或“基于”单克隆抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2或3G4。优选的，本发明的抗体是“基于9D2或9D2样的抗体”，更优选的，本发明抗体是“基于3G4或3G4样的抗体”。下文针对3G4抗体所用的表述“某某样”抗体是为了简明表达，但特别收编于此作为参考，可分别应用于1B9、1B12、3B10、2G7、7C5和9D2抗体。
[0043]3G4样抗体是所结合表位与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)基本上相同或结合第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)上的表位与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)所结合表位基本相同的抗体或其抗原结合片段。优选的，抗体或其抗原结合片段将结合与单克隆抗体3G4 (ATCC 4545)相同的表位。
[0044]术语“结合与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)大约、基本上或本质上相同或同一表位”指抗体与单克隆抗体3G4(ATCC 4545) “交叉反应”。“交叉反应性抗体”是指这样的抗体，即它们与单克隆抗体3G4(ATCC4545)相比，识别或结合基本上或本质上相同或完全相同的表位、表位位点或共同的氨基磷脂或阴离子磷脂表位或具有对这样的表位的免疫特异性，从而能与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)有效的竞争结合至少一种氨基磷脂或阴离子磷月旨、一种以上的氨基磷脂或阴离子磷脂或单克隆抗体3G4(ATCC 4545)所结合的所有氨基磷脂或阴离子磷脂。“3G4交叉反应性抗体”简称为“3G4样抗体”和“基于3G 4的抗体”，这些术语在此可互换使用，并适用于组合物、用途和方法中。
[0045]由于现在已经提供了具有有利特性的3G4，与单克隆抗体3G4(ATCC4545)相比，结合大约、基本上、本质上或完全相同表位的一种或多种抗体的鉴定是一个直接的技术问题。因为交叉反应性抗体的鉴定是与参照抗体(3G4)相比较确定的，应理解为真实地测定参照抗体(3G4)和待测抗体所结合表位在任何情况下都不是鉴定所结合的表位与单克隆抗体3G4相同或基本上相同的抗体所必需的。不过，本文还是提供了 3G4所结合表位的重要信息且可进一步进行表位作图。
[0046]交叉反应性抗体的鉴定可以用各种免疫学检测法中的任一种方便的测定，其中可以测定抗体的竞争。所有这些检测法在本领域中都是常规的方法且在此有进一步的详述。美国专利6342219和6342221各自特别收编于此作为参考，其目的是为了对本发明关于如何制备具有下述特点的抗体的教导作一些补充，即，该抗体所结合表位与如3G4等给定抗体相同或基本上或本质上相同，或者与给定抗体有效竞争结合某抗原。
[0047]例如，在待检验的试验抗体获自不同来源动物或甚至来源于不同种型的情况下，可以应用一种简单的竞争检测法，其中对照抗体(3G4)和试验抗体被混合在一起(或预吸附)并施用至氨基磷脂或阴离子磷脂抗原组合物上，优选PS。“氨基磷脂或阴离子磷脂抗原组合物”指包含本文所述3G4结合抗原的任何组合物，如表4中所述的那些。因此，基于ELISA和蛋白质印迹的方法适用于这样的简单竞争试验。
[0048]在某些实施方案中，在施用于抗原组合物之前，将要或预先混合对照抗体(3G4)和不同量的试验抗体(如，1: 10或1: 100) —段时间。在另一实施方案中，对照抗体和不同量的试验抗体可以只在暴露于抗原组合物的期间混合。在任何情况下，通过使用物种或同种型的二抗，都将能只探测被结合的对照抗体，它的结合由于存在基本上识别同一表位的试验抗体而减少。
[0049]在进行对照抗体和任何试验抗体(无论是何物种或同种型)之间的抗体竞争试验时，可以首先用诸如生物素或酶(或甚至放射性)标记等可检测标记物来标记对照抗体(3G4)，使其随后能够被识别。在这些情况下，应该将被标记的对照抗体与待检测的试验抗体以各种比率(如1: 10、1: 100或1: 1000)预混合或保温，并且(任选在一段适当时间后)随后检测被标记的对照抗体的反应性，将其与保温中不存在潜在竞争性试验抗体情况下的对照值进行比较。
[0050]检测法还可以是基于抗体杂交的一系列免疫学检测法中的任一种，对照抗体将通过探测它们的标记物的方式被检测，如，在生物素化抗体的情况下用链霉亲和素，或者就酶标记物而言使用有关的生色底物(如，就过氧化物酶而言使用3，3’ 5，5’ -N四甲联苯胺(TMB)底物)或通过简单地检测放射性标记。正如被结合的标记物的减少所证实的，与对照抗体结合同一表位的抗体将能够有效竞争结合，并因此显著减少了对照抗体的结合。
[0051]在不存在完全无关抗体的情况下(已标记)对照抗体的反应性将是对照最高值。通过将被标记(3G4)的抗体与完全同一类型的(3G4)未标记抗体一起保温将获得对照最低值，这种情况下将发生竞争从而减少被标记抗体的结合。在试验组的检测中，试验抗体存在时被标记抗体的反应性的显著降低是识别同一表位的试验抗体(即与被标记(3G4)抗体“交叉反应”的抗体)的指示。
[0052]显著的减少是“可重复性的”，即观察到始终如一的结合减少。“显著的减少”就本申请而言被解释为在约1: 10和约1: 1000之间的任何比率条件下至少约70%、约75%或约80%的可重现性减少(在ELISA中，与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的减少)。 具有更严格交叉封闭活性的抗体在约1: 10和约1: 1000之间的任何比率条件下将展示至少约82%、约85%、约88%、约90%、约92%或约95%上下的可重现性减少(在ELISA或其它适当的检测中，与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的减少)。尽管对于进行本发明而言一点也不需要完全或近似完全的交叉封闭性，如在3G4与一种或多种氨基磷脂或阴离子磷脂的结合中展示约97%或96%左右的可重现性减少，但它当然也不排除在本发明之外。
[0053]就第二代抗体的总体而言，竞争的测定可以参照至少结合磷脂酰丝氨酸的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰丝氨酸的结合；参照至少结合磷脂酸的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酸的结合；参照至少结合磷脂酰肌醇的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰肌醇的结合；参照至少结合磷脂酰甘油的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰甘油的结合；参照至少结合心磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与心磷脂的结合；以及任选地参照至少结合磷脂酰乙醇胺的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争与磷脂酰乙醇胺的结合。
[0054]在某些实施方案中，第二代抗体的测定可以参照可结合至少第一和第二氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一和第二氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二和第三氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二和第三氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二、第三和第四氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二、第三和第四氨基磷脂或阴离子磷脂；参照可结合至少第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或阴离子磷脂的抗体进行，其中的第二代抗体有效竞争结合此第一、第二、第三、第四和第五氨基磷脂或阴离子磷脂。
[0055]在另外的实施方案中，第二代抗体可表征为与至少一种氨基磷脂或阴离子磷脂呈现显著结合、与含胆碱的中性磷脂无可检测到的结合且与本发明的单克隆抗体、优选3G4(ATCC 4545)有效竞争的抗体。
[0056]在具体的实施方案中，抗体展示出与阴离子磷脂PS、PA、P1、PG和CL有显著结合；磷脂结合特征为PS = PA = PI = PG > CL >> PE，其中>表示与所说磷脂的结合有至少2倍的差异，而>>则表示与所说磷脂的结合有至少10倍的差异；表现出无可检测到的与磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂的结合；且与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)有效竞争结合各阴离子磷脂 PS、PA、P1、PG 和 CL。
[0057]优选的，第二代抗体将具有前述特征，并且还展示出与活化、分裂、受伤、凋亡或病毒感染细胞表面存在的至少一种阴离子磷脂的显著结合。更优选的，抗体还显著抑制正在分裂中的内皮细胞的增殖却并未明显改变静止细胞，且更优选地没有显著的狼疮抗凝物活性。
[0058]就其功能而言，第二代抗体将优选抑制血管发生，具有抗肿瘤作用和抗病毒作用，优选在体内，且更优选的，在发挥这些作用的同时不会在动物或患者体内引起显著的血栓形成并发症。因此，优选的抗体具有抗血管发生、抗肿瘤血管、抗肿瘤和抗病毒剂的联合特性。
[0059]本发明以杂交瘤ATCC 4545产生的单克隆抗体3G4或所说单克隆抗体的抗原结合片段为例进行了说明。产生可与单克隆抗体3G4(ATCC 4545)结合基本上相同的表位的单克隆抗体的杂交瘤是本发明的另一方面。
[0060]除非另外特别提及或从科学术语学的角度更清楚的说明，在以下组合物、免疫缀合物、药物、组合、混合物(cocktail)、药剂盒、第一和第二种医药用途以及按照本发明的所有方法的有关描述中，术语“抗体”和“免疫缀合物”或其抗原结合区在本文中是指一系列抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体以及特异的3G4交叉反应性抗体。
[0061]术语“抗体”和“免疫球蛋白”用于此处时，泛指任何免疫学结合剂，包括多克隆和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，抗体被归为五种主要类型之一:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的某些进一步被划分为亚型或同种型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。相应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、Y和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
[0062]一般而言，本发明中所使用的是抗体而非抗原结合区时，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理学条件下最常见的抗体，还因为它们最容易在实验室环境中制备。根据它们恒定结构域的氨基酸序列，将哺乳动物抗体的“轻链”归为两种明显不同的类型之一:kappa( κ )和IambdaO )。在本发明抗体中基本上没有对使用κ或λ轻链的偏好。
[0063]一般情况下优选使用单克隆抗体(MAbs)或其衍生物。MAbs被认识到具有某些优点，如，可再现性和大规模的生产量，这样就使它们适于临床治疗。因此本发明提供了小鼠、人、猴子、大鼠、仓鼠、兔和甚至青蛙或鸡来源的单克隆抗体。小鼠、人来源或人源化的单克隆抗体通常将是优选的。
[0064]正如本领域技术人员将理解的，术语“抗体”所涵盖的免疫学结合剂延伸到来自所有物种的所有抗体和其抗原结合片段，包括二聚、三聚和多聚抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；人来源或人源化抗体；重组、基因工程产生和骆驼源化(camelised)抗体及其片段。
[0065]术语“抗体”因此被用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，且此术语包括诸如Fab’、Fab、F(ab’ )2等抗体片段、单一结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)、线性抗体、二体(diabodies)、骆驼源化抗体等。制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的有关技术在本领域中是众所周知的(参阅Kabat等，1991，专门收编于此作为参考)。具体而言，有关二体的描述另外参阅EP 404097和WO 93/11161，分别专门收编于此作为参考；而线性抗体则另外描述于Zapata等人(1995)的文献中，该文献专门收编于此作为参考。
[0066]在某些实施方案中，本发明的组合物包含至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂的抗体，所说抗体含至少第一可变区，该第一可变区包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:4的氨基酸序列至少具有约75%、更优选至少约80%、更优选至少约85%、更优选至少约90%、最优选至少约95%左右同一性的氨基酸序列区；其中所说的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂的抗体至少基本上保持了本发明抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的生物学特性，如同3G4抗体所示范的一样。
[0067]关于本发明这些和其它抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体序列的同一性或同源性在此定义为，在将序列比对并且(在需要时)导入缺口以达到最大序列相同性百分比时，候选序列中与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的序列、或者与本发明的其它抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体序列相同的氨基酸残基的百分率。保持用于序列比较的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体基本上相同或甚至更有效的生物学特性是尤其重要的。这样的比较是容易进行的，如可利用本文所述的各种检测法中的一种或多种方法进行。
[0068]在某些优选的实施方案中，本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体包含至少第一可变区，该第一可变区包含具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4氨基酸序列的氨基酸序列区，例如包含由SEQ ID NO:1或 SEQ ID NO:3所示核酸序列编码的氨基酸序列的可变区。这些序列是含重链和轻链可变区⑶R1-3 (互补性决定区)的3G4S cFv的Vh和V κ序列。
[0069]在其它优选的实施方案中，提供了与诸如3G4(ATCC 4545)等最初的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体相比具有增强了的或更优越的特性的第二代抗体。
[0070]在某些实施方案中，所应用的抗体将是“人源化的”、部分人源或人来源的抗体。“人源化”抗体通常是来自小鼠或其它非人物种的嵌合单克隆抗体，其中携带人的恒定和/或可变区结构域(“部分人来源的嵌合抗体”)。用于本发明中的各种人源化单克隆抗体将是嵌合抗体，其中小鼠、大鼠或其它非人单克隆抗体的至少第一抗原结合区或互补性决定区(CDR)被有效连接或“移植”到人抗体恒定区或“框架”上。
[0071]本文所用的“人源化”单克隆抗体还可以是来自非人物种的单克隆抗体，其中一个或多个选定的氨基酸已被人抗体中更经常观察到的氨基酸所替换。通过使用常规重组技术，尤其是定位诱变，可以方便的完成这一步。
[0072]还可制备完全来源于人的抗体，而非“人源化”的抗体，并应用于本发明中。所说的人源抗体可以通过以下方式获自健康的受试者，即，简单地从人受试者中获得混合的外周血淋巴细胞群，其中包括抗原呈递和抗体产生细胞，并通过与免疫学有效量的氨基磷脂或阴离子磷脂样品混合而刺激体外细胞群。该人抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞一旦获得就可用于杂交瘤和/或重组抗体的生产中。
[0073]另外用于单克隆抗体生产的技术包括用免疫学有效量的氨基磷脂或阴离子磷脂样品免疫包含人抗体文库的转基因动物，优选转基因小鼠。这还产生了人抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞，以供进一步用于杂交瘤和/或重组抗体的生产中，其优势在于，脾细胞(而非外周血细胞)可方便的获自转基因动物或小鼠。
[0074]按照本发明的抗体可以通过选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体而方便的制备得到。适当的制备过程和方法包括:
[0075](a)制备候选的抗体生产细胞；并
[0076](b)从候选的抗体生产细胞中选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。
[0077]制备适当抗体生产细胞并从中获得抗体的一种方法可以在给定患者体内原位进行。即，简单地向患者提供免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂样品将导致合适的抗体产生。因此，虽然抗体仍然“获自”抗体生产细胞，但它不必从宿主中分离并随后再提供给患者，而能够自发的定位于肿瘤血管结构并发挥其生物学抗肿瘤作用。不过，这样的实施方案并非目前优选的。
[0078]还可通过在体外用氨基磷脂或阴离子磷脂刺激外周血淋巴细胞而获得适当的抗体生产细胞，并随后分离和/或纯化抗体。
[0079]其它方法包括将包含至少第一免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂组分的免疫组合物施用于动物并从被免疫的动物中选择与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。这些方法通常包括:
[0080](a)通过将含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的至少一剂、任选一剂以上的组合物施用于动物来免疫动物；并
[0081](b)从被免疫的动物中获取适当的抗体生产细胞，诸如产生与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体的抗体生产细胞。
[0082]本文中，优选的“含免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的组合物”是含活化内皮细胞的组合物。“活化内皮细胞”优选制备如下:在至少第一条件下放置内皮细胞，或将内皮细胞与至少第一因子接触，该条件/因子可活化内皮细胞以及/或模拟肿瘤环境，持续时间是足以基本上保持细胞活力并有效刺激至少一种阴离子磷脂在内皮细胞表面表达的时间。
[0083]有效制备活化内皮细胞的“条件”实例有低氧和/或酸性的环境。有效制备活化内皮细胞的因子的例子有有效浓度的H2O2、凝血酶、炎性细胞因子如IL-1 α、IL-1 β、干扰素或TNF α，以及总体上模拟肿瘤环境的条件和/或因子的组合。
[0084]无论免疫方法的特性或免疫动物的类型是什么，合适的抗体生产细胞可获自免疫动物，并优选进一步进行人工处理。“被免疫的动物”用于此处时，除非另外特别提及，是非人动物。尽管任何抗体生产细胞都可使用，最优选将脾细胞作为抗体生产细胞的来源。抗体生产细胞可用于制备型方法中，其中包括:
[0085](a)将适当的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞与永生化细胞融合以制备产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤；并
[0086](b)从杂交瘤中获取本发明的适当抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。
[0087]“适当”的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞、杂交瘤和抗体是产生抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或以此形式存在的那些细胞或杂交瘤或抗体，优选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗体。
[0088]基于杂交瘤的单克隆抗体制备方法由此包括含以下步骤的那些方法:
[0089](a)将含免疫学有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂的至少一剂、任选多剂组合物施用于动物来免疫动物，优选含活化内皮细胞的组合物；
[0090](b)从被免疫动物中制备单克隆抗体生产杂交瘤的集合；
[0091](c)从集合中选择产生本发明的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体的至少第一杂交瘤，所述抗体任选是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应或竞争的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体；并
[0092](d)培养该至少第一抗体生产杂交瘤，以提供该至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体；并优选
[0093](e)从人工培养的至少第一杂交瘤中获取所述至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体。
[0094]在鉴定与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)实质性交叉反应的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体时，选择步骤可以包括:
[0095](a)将氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS样品，与有效量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)和候选抗体接触；并
[0096](b)测定候选抗体实质性减少3G4抗体与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)样品结合的能力；其中候选抗体实质性减少3G4抗体与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)样品结合的能力是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的指示。
[0097]选择步骤可进一步包括:
[0098](a)将第一氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS，与有效结合量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)接触并测定与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)结合的3G4的量；
[0099](b)将第二氨基磷脂或阴离子磷脂样品，优选PS，与有效结合量的单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)以及有效竞争量的候选抗体接触，并测定在候选抗体存在的条件下与氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS结合的3G4的量；并
[0100](C)通过选择减少与氨基磷脂或阴离子磷脂结合的3G4的量的候选抗体来鉴定与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)结合基本上相同的表位的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，所说的磷脂优选PS，所说的3G4结合减少量优选至少约80%。
[0101]用于本文中时，所有的标准选择均优选在无血清的条件下进行，以避免产生的抗体可能酷似患者的病态抗体的缺点，所说的病态抗体能与结合蛋白质的氨基磷脂或阴离子磷脂结合。
[0102]将非人动物用于免疫接种时，从这样的杂交瘤中获取的单克隆抗体常常具有非人类型的组成。正如本领域技术熟练人员已知和本文进一步公布的内容一样，所说的抗体可以任选的进行人源化处理、移植或突变。或者，可以使用含有人抗体基因文库的转基因动物，诸如小鼠等。这些动物的免疫将因此直接导致适当人抗体的产生。
[0103]产生适当的抗体生产细胞，最优选杂交瘤后，无论生产人或非人的抗体，都可以克隆编码单克隆抗体的核酸以制备“重组”单克隆抗体。任何重组克隆技术都可利用，包括利用PCR?起动编码抗体的核酸序列的合成。为此，还有更多的合适单克隆抗体制备方法，包括按如下步骤利用抗体生产细胞的方法:
[0104](a)从适当的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体生产细胞，优选杂交瘤中获取至少第一适当的编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的核酸分子或片段；并
[0105](b)在重组宿主细胞中表达所说的核酸分子或片段，以便获得本发明的重组抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂单克隆抗体。
[0106]不过，还有其它的有效重组技术可供利用，它们适于制备重组单克隆抗体的。这些重组技术包括基于噬菌粒文库的单克隆抗体制备方法，含以下步骤:
[0107](a)通过将至少一剂、任选多剂组合物施用于动物来免疫动物，所说的组合物含有免疫有效量的免疫原性氨基磷脂或阴离子磷脂，优选含活化内皮细胞的组合物；
[0108](b)制备免疫球蛋白噬菌粒组合文库，该文库表达分离自免疫动物(优选来源于脾)的抗体生产细胞的RNA ；
[0109](C)从噬菌粒文库中选择表达至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的至少第一克隆，任选所述抗体可与单克隆抗体3G4(ATCCPTA 4545)实质性交叉反应或竞争；
[0110](d)从至少第一选定克隆中获得编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的核酸，并在重组宿主细胞中表达此核酸，以提供至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体；并优选的
[0111](e)获得从由所说的至少第一选定克隆中获得的核酸表达的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。
[0112] 此外，在这些基于噬菌粒文库的技术中，可以应用携带人抗体基因文库的转基因动物，从而产生重组的人单克隆抗体。
[0113]无论第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体核酸片段的制备方式如何，更多的合适抗体核酸片段都可用标准的分子生物学技术来方便的制备。为了证实任何变体、突变体或第二代抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体核酸片段适用于本发明，将测试核酸片段以证实本发明的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的表达。优选的，还将测试变体、突变体或第二代核酸片段以证实在标准条件下，更优选标准严谨杂交条件下的杂交。例示性的合适杂交条件包括在大约7%十二烷基硫酸钠(SDS)、大约0.5MNaP04、大约ImM EDTA中50°C左右杂交；然后用大约1% SDS在42 °C左右漂洗。
[0114]就多种重组单克隆抗体而言，无论是人源的还是非人源的，都是容易制备的，本发明的任何处理方法都可通过向动物提供至少第一核酸片段而实施，所说的核酸片段在患者体内表达生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体。“表达抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂、3G4样或基于3G4的抗体的核酸片段”通常至少以表达构建物的形式出现，且可以以包含于病毒或重组宿主细胞中的表达构建物的形式出现。本发明优选的基因治疗载体通常将是病毒载体，诸如包含于重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、巨细胞病毒(CMV)等病毒中的病毒载体。
[0115]细胞不透性耐久霉素衍生物:本发明另外还提供了基本上细胞不透性的磷脂酰乙醇胺(PE)结合肽构建物和衍生物，它包含已被修饰的至少第一 PE结合肽从而形成基本上细胞不可渗透的PE结合构建物。
[0116]优选的，本发明提供了在药用可接受载体中包含生物学或治疗学有效量的至少第一基本上细胞不可渗透性PE结合构建物的药物组合物，它包含已被修饰的至少第一 PE结合肽从而形成基本上细胞不透性PE结合构建物。因此，基本上细胞不透性PE结合构建物是用于制药学、药理学和治疗学，即医学用途中的构建物，优选用于治疗病毒感染。在某些实施方案中，本发明提供了与生物素连接的除肉桂霉素之外的基本上细胞不透性PE结合构建物。
[0117]更优选的，本发明的基本上细胞不透性PE结合肽衍生物是基本上细胞不透性耐久霉素肽衍生物和其药物组合物。耐久霉素肽通常通过有效连接至少第一细胞不透性基团而被修饰，从而形成基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。细胞不透性基团的有效连接可通过SEQ ID NO:9中的第二位氨基酸赖氨酸残基进行。
[0118]细胞不透性基团在生理学pH下可以携带阳性或阴性电荷或者可以是极性的。典型的基团包括硫酸根、磺酸根、磷酸根、羧基、苯酚、季铵离子和胺基团。含有连接了生物素的耐久霉素的药物组合物是本发明的一个具体实施例。
[0119]基本上细胞不透性的耐久霉素还可与糖、寡糖或多糖、氨基酸、肽、多肽、蛋白质或多元醇基团有效连接。某些细胞不透性耐久霉素是那些与诸如中性亲和素(neutravidin)、链霉亲和素、白蛋白或惰性免疫球蛋白载体蛋白等惰性载体蛋白有效连接的耐久霉素，其中尤其优选与人IgG(HIgG)连接的耐久霉素。细胞不透性耐久霉素的其它例子包括与靶向剂(优选结合肿瘤细胞、肿瘤血管结构或肿瘤基质或病毒感染细胞的靶向剂)连接的耐久霉素。与肿瘤细胞、肿瘤血管结构或肿瘤基质成分结合的靶向剂的例子参阅美国专利6093399,6004555,5877289和6036955，各自特别收编于此作为参考。
[0120]肿瘤治疗:本发明进一步提供了含至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物的组合物，任选该抗体与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)基本上结合相同的表位，或者含基本上细胞不透性PE结合肽衍生物、优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的组合物。这些组合物是优选的药用可接受组合物，包括为诸如静脉内注射等肠胃外投药而配制的组合物，或为了以脂质体或气雾剂形式施用而配制的组合物。
[0121 ] 本发明提供了包括3G4交叉反应的、3G4样的或基于3G4的抗体在内的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体和基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的许多制备方法和用途。就所有的方法而言，除非特别提及，术语“一个(种)”用于指所述方法中的“至少一个(种)”、“至少第一种(个)”、“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”步骤。这与治疗方法中的施用步骤尤其有关。因此，本发明不仅可以应用不同的剂量，还可以使用不同数目的剂量，如注射或吸入，可多达并包括多种注射或吸入。在施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或免疫缀合物或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物之前、之后或期间都可以使用组合疗法。
[0122]本发明还提供了具有重要生物学意义的各种有用的体外使用方法和用途。首先提供的是结合氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS或PE的方法和用途，这通常包括将含氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS或PE的组合物接触至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体，或接触基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。“接触”是在有效允许结合复合物形成的条件下进行的，并对由此形成的任何复合物进行检测。检测方法和用途可用于生物学样品，如用于诊断细胞凋亡、肿瘤和病毒感染细胞，另外还提供了基于此的诊断药剂盒。
[0123]本发明还提供了增殖抑制方法和用途，它们优选使用本发明的抗体、抗原结合片段和免疫缀合物。抑制内皮细胞增殖和/或迁移的方法通常包括在有效抑制内皮细胞增殖和/或迁移的条件下使含内皮细胞群在内的细胞群或组织接触含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体(任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体)或其抗原结合片段的组合物。
[0124]前述方法和用途可在体外和体内进行，在后一种情况下，其中组织或细胞位于动物内，而抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体被施用于动物。在两种情况下，所说的方法和用途都可成为用于抑制血管发生的方法和用途，包括在有效抑制血管发生的条件下使含有潜在生血管性血管的组织或血管群接触含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段的抗血管发生性组合物，任选所述抗体与单克隆抗体3G4 (ATCCPTA 4545)基本上结合相同的表位。
[0125]在潜在生血管性血管群离体维持的情况下，本发明在药物开发项目中也具有效用。附带可靠阳性和阴性对照的体外筛选试验可用作药物开发的第一个步骤来抑制或促进血管发生，以及用于阐述有关血管发生过程的更多信息。在潜在生血管性血管群位于动物或患者体内的情况下，抗血管性发生组合物作为一种疗法施用于动物。
[0126]针对已经患上或有危险患上特征为不希望有的、不适当的、异常的、过多的和/或病态的血管形成的任何疾病或病症的动物和患者，可提供抗血管发生和抗血管疗法。本领域普通技术人员众所周知，因为异常的血管发生广泛的存在于疾病和病症中，一种给定的抗血管发生疗法一旦显示出在任何可接受模型系统中是有效的，就可用于治疗整个范围内与血管发生相关的疾病和病症。
[0127]本发明的方法和用途特别意图用于已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者中:任何形式的血管化肿瘤；黄斑变性，包括与年龄相关的黄斑变性；关节炎，包括类风湿性关节炎；动脉粥样硬化症和动脉粥样斑块；糖尿病性视网膜病和其它的视网膜病；甲状腺增生，包括格雷夫斯氏病；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癣。
[0128]本发明的方法和用途还意图用于已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者中:动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤和血管再狭窄，包括血管成形术后的再狭窄。这些治疗方法和用途的其它预期目标是已经患上或有危险患上以下疾病的动物和患者:血管纤维瘤、皮炎、子宫内膜异位症、血友病性关节、肥厚性瘢痕、炎性疾病和病症、化脓性肉芽肿、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。
[0129]如同特别收编于此作为参考的美国专利5712291中所述的，前述被治疗疾病类型中的各类都决非对可用本发明治疗的疾病种类的穷举。为了某些特殊的目的将美国专利5712291收编于此作为参考,所说的目的包括:识别可用抗血管形成疗法有效治疗的许多其它疾病；显示一旦确定类型的抑制血管发生的化合物已公布并申请专利，则所有血管形成疾病的治疗都代表了一个统一的概念(在本案例中，是抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体)；以及通过只来自单一模型系统的数据显示可实现所有血管形成性疾病的治疗。
[0130]除了血管形成性和血管类疾病的治疗外，本发明重要的统一的方面是用于治疗已经患有或有危险患癌症的动物和患者的组合物和方法。所有的癌症治疗方法和用途包括施加或使用至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体，或者施加或使用基本上细胞不透性的PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性的耐久霉素衍生物。以治疗有效量将所说的构建物施用于患癌症的动物或患者。
[0131]本发明的癌症治疗方法，即使是利用抗体的疗法，也不是单纯依赖于发挥抗血管和/或抗血管形成作用的。本发明的癌症治疗方法和用途适于治疗所有形式的癌症，包括已经患有或有危险患血管性实体瘤、转移性肿瘤或来自原发肿瘤的转移性病灶的动物和患者。
[0132]未缀合的或“裸露的抗体”及其片段以及该抗体或其抗原结合片段与治疗剂有效连接的免疫缀合物都可用于本发明的抗癌治疗中。因此，除非另外特别提及或以科学术语解释的更清楚，术语“抗体及其片段”用于此处时，是指“未缀合的或裸露的”抗体或片段，它未与另一药剂连接，具体而言是未与治疗或诊断剂连接。这些定义并未排除抗体的修饰，诸如，举例说来，为了提高抗体的生物学半寿期、亲合力、亲和性或其它特性而进行的修饰，或者抗体与其它效应子的组合。
[0133]在以免疫缀合物为基础治疗癌症的方法中，所述抗体或其抗原结合片段与一系列生物学、治疗性的和/或所谓的第二抗癌剂(抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体本身，是第一抗血管发生剂)中的任意一种或多种有效连接，后者可以具有直接或间接的抗癌作用。
[0134]因此，本发明另外还提供了用于递送选定的治疗剂或诊断剂至肿瘤的方法。这样的实施方案包括向患肿瘤的动物或患者施用至少含第一免疫缀合物的生物学有效量的组合物，在所说的免疫缀合物中诊断剂或治疗剂与抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段有效连接，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体。
[0135]因此本发明的组合物以及方法和用途包括含有与至少第一生物学、治疗或诊断剂有效连接的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体的组合物，所说抗体任选是与抗体3G4(ATCCPTA 4545)基本上结合相同的表位的抗体。抗体优选与放射治疗剂、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗细胞的细胞毒性剂或细胞因子(或抗病毒药物，如下所述)连接。
[0136]用于连接的某些优选药剂是体内诊断剂，如，使缀合物可作为代用标记用于化学治疗的诊断剂。
[0137]优选用于抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的治疗用缀合物中的药剂是补足或增强抗体效力的药剂和/或为特殊肿瘤类型或患者选择的药剂。“补足或增强抗体效力的治疗剂”包括放射治疗剂、血管渗透性增强剂、某些细胞因子、抗血管发生药剂、细胞凋亡诱导剂和抗微管蛋白药物，其中的任意一种或多种治疗剂均可使用。
[0138]目前优选的药剂是细胞毒性剂gelonin ;细胞因子，诸如TNFa、IL-12和LEC(肝表达的趋化因子)；具有抗血管发生作用的抗癌剂，如表E中所示；诱导细胞凋亡的抗癌剂，如表F中所示；和来自考布他汀家族的抗微管蛋白药物。特别优选的药剂是多西他赛。
[0139]本发明的癌症治疗组合物和方法还可与其它疗法和诊断法联合使用。“联合”一词就与治疗剂联合的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂或基于3G4的抗体而言，还包括联合的组合物、药物、混合物、药剂盒、方法，其中的治疗剂是以前体药物的形式出现的。
[0140]联合的癌症治疗方法是指这样的方法，即，其中将至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)基本上结合相同表位的抗体，或者基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物，与治疗有效量的至少第二治疗剂或抗癌剂联合施用于患癌症的动物或患者。
[0141]本发明进一步提供了组合物、药物组合物、治疗药剂盒和药用混合物，其中，任选地在至少第一组合物或容器中，含生物学有效量的至少第一抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA4545)基本上结合相同表位的抗体，或其抗原结合片段或免疫缀合物，或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物；和生物学有效量的至少第二生物学药剂、组分或系统，优选至少第二治疗剂或抗癌剂。
[0142]“至少第二生物学药剂、组分或系统”经常会是治疗或诊断剂、组分或系统，但也可以不是如此。例如，至少第二生物学药剂、组分或系统可以包含用于修饰抗体的组分和/或用于将其它药剂与抗体连接的组分。某些优选的第二生物学药剂、组分或系统是前体药物或用于制备和使用前体药物的组分，包括用于制备前体药物本身的组分和用于改造本发明的抗体使其在所说的前体药物或ADEPT实施方案中发挥功能的组分。
[0143]在待治疗疾病是癌症的情况下，“至少第二治疗或抗癌剂”将包含于治疗药剂盒或混合物中。术语“至少第二抗癌剂”是参考作为第一抗癌剂的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、3G4构建物或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物(优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物)而选择的。本发明的抗体因此可以联合化学治疗剂、放射治疗剂、细胞因子、抗血管发生剂、细胞凋亡诱导剂或抗癌免疫毒素或凝血配体(coaguligands)。“化学治疗剂”还包括基因、载体、反义构建物和核酶。
[0144]目前优选的第二抗癌剂是具有抗血管发生作用的抗癌剂，如表E所示；诱导细胞凋亡的抗癌剂，如表F中所示；和来自考布他汀家族的抗微管蛋白药物。特别优选的药剂是多西他赛。
[0145]就本发明的组合物、药剂盒和/或药物而言，联合有效量的治疗剂可包含于单一的容器或容器装置中，或包含于不同的容器或容器装置中。混合物通常被混合在一起以便联合使用。常常优选按静脉注射配制的药剂。还可包括成像组分。药剂盒中还可包括使用该至少第一抗体和所包括的一种或多种其它生物学药剂的说明书。
[0146]一般而言，该至少第二抗癌剂可与抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物基本上同时施用于动物或患者，例如来自单一药物组合物或来自紧接着一起施用的两种药物组合物。
[0147]或者，在施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物后顺次的时间点将至少第二抗癌剂施用于动物或患者。“在顺次的时间点”用于此处是指“错开的时间”，这样至少第二抗癌剂在与施用抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物不同的时间施用给动物或患者。两种药剂的给药相隔有效的时间，以便使两种药剂都能发挥它们各自的疗效，即，它们以“生物学有效的时间间隔”进行施用。至少第二抗癌剂可在抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性耐久霉素衍生物施用之前或之后间隔生物学有效时间施用于动物或患者。
[0148]还可进行肿瘤成像，优选用可检测标记物标记的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物进行。依照本发明的成像可以探测凋亡前和凋亡的细胞，因此它可以在治疗后用作替代标志。或者，因为所形成的图像将预示着待使用治疗剂的结合位点，所以可在治疗前进行成像。因此癌症治疗可通过如下步骤进行:
[0149](a)形成肿瘤图像，即将诊断最少量的至少第一可检测标记的肿瘤结合剂施用于患肿瘤的动物或患者，优选抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物，其中含有与肿瘤结合剂或抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体有效连接的诊断剂，从而形成肿瘤的可检测图像；并
[0150](b)随后对同一动物或患者施用治疗最适量的至少第一裸露的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或3G4抗体或利用了所说抗体的治疗剂-抗体构建物，从而引起抗肿瘤作用。
[0151]为此提供了成像和治疗制剂或药物，它们通常包含:
[0152](a)含诊断有效量的可检测标记的肿瘤结合剂的第一药物组合物，优选抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体构建物，组合物中包含与肿瘤结合剂或抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的抗体有效连接的可检测剂；和
[0153](b)含治疗有效量的至少一种裸露抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或3G4抗体或利用所说抗体的治疗剂-抗体构建物的第二药物组合物。
[0154]治疗病毒感染:本发明尤其重要和不寻常的进展是用于治疗或预防病毒感染的有关组合物、联合、药剂盒、方法、用途和药物。本发明的抗病毒疗法涉及本发明前述和其它治疗剂中的任一种或多种的施加或使用。
[0155]首先，如同上述针对组合物和癌症治疗所述的，本发明的抗病毒组合物和治疗方法涉及至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或者基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物的施加或使用。在基本上细胞不透性PE结合肽衍生物中，优选使用的是基本上细胞不透性耐久霉素衍生物，诸如与生物素连接的耐久霉素或与HIgG连接的耐久霉素。
[0156]由于发现了本发明的抗体和肽与病毒感染之间存在着不寻常的关系，本发明进一步提供了一系列新的治疗剂用于治疗病毒感染。具体而言，本发明提供了抗氨基磷脂或阴离子磷脂(尤其是PS和PE)的抗体，它们与至少第一抗病毒剂有效连接。本发明另外还提供了基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素肽衍生物，其与至少第一抗病毒剂有效连接。用于连接本发明抗体和肽的适当抗病毒剂包括表G中所列举的类型。
[0157]因此，总而言之，本发明的抗病毒组合物和治疗方法涉及对受病毒感染的动物或患者施用含治疗有效量的至少第一纯化的抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或其抗原结合片段或抗病毒免疫缀合物的组合物，所述抗体任选是与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或者是施用含治疗有效量的基本上细胞不透性PE结合肽衍生物(优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物)或其抗病毒免疫缀合物的组合物。
[0158]本发明的抗病毒治疗方法适于治疗动物和人、甚至是植物中的所有病毒。本发明的治疗剂可抑制病毒入侵，但优选抑制来自受感染宿主细胞的病毒的复制、流出(egress)和扩散。如表H中所示，本发明适于治疗感染脊椎动物，尤其是人的所有病毒，尤其是在人体内呈致病性的病毒。可用本发明治疗的病毒感染和相关疾病包括表J中所列举的病毒和疾病，举例说来就是治疗CMV、RSV和沙粒病毒感染，以及肝炎、流行性感冒、肺炎、拉沙热和AIDS。
[0159]本发明的抗病毒治疗组合物和方法还可与其它疗法和诊断法联合使用。这些“联合的”使用是将独立的抗病毒剂在联合组合物、药物、混合物、药剂盒和治疗方法中联合起来施用。
[0160]前述癌症和抗病毒治疗方法和用途常常包括将药用有效量的组合物系统性施用于动物或患者，如通过穿皮肤、肌肉内、静脉内注射等。对于治疗病毒感染，尤其是呼吸性病毒感染而言，优选将组合物递送至肺，这可用气雾剂来达到目的。无论如何，可以使治疗剂定位于肿瘤或病毒感染位置的任何施药途径都将是可接受的。因此，其它适当的递送途径包括口服、直肠投药、鼻饲、局部用药和阴道用药。对于治疗关节炎的用途和方法来说，例如可以采用滑膜内施药，如美国专利5753230中针对其它的免疫学药剂所述的，该文献特别收编于此作为参考。对于与眼睛相关的疾病来说，应考虑眼用制剂和施药方式。
[0161]“施用”一词用于此处是指，以有效发挥其治疗作用的一定量和一定的持续时间提供或递送抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体或基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素衍生物。在某种程度上，由于它的简单性和可重复性，通常优选蛋白质性治疗剂的被动施药方式。
[0162]无论如何，术语“施用”在此处用于指递送治疗剂的任何和所有的方式。“施用”的含义因此包括以有效方式提供产生抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的抗体或耐久霉素衍生物治疗剂的细胞。在这样的实施方案中，可能期望将所说细胞制备或包装于选择性可渗透膜、结构或可移植装置中，通常是可通过移除来终止治疗的装置。从外部施药仍将是一般优选的方式，因为它代表了可以使用药量被严密监测和调控的非侵入型方法。
[0163]本发明的治疗方法和用途还延伸到以能有效导致其体内表达的方式提供编码抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4或耐久霉素衍生物治疗剂的核酸。任何基因治疗技术都可应用，诸如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的离体操作，等等。脂质体和隐蔽的脂质体将优选用于某些实施方案中。
[0164]本发明的药物组合物和治疗方法中应用了“治疗有效量的”抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体，任选与单克隆抗体3G4(ATCC PTA 4545)基本上结合相同表位的抗体，或这些抗体的抗原结合片段或免疫缀合物，或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选基本上细胞不透性耐久霉素衍生物。“治疗效果”和由此而来的“治疗有效量”对于癌症治疗和抗病毒治疗来说是用不同的参数检测的。
[0165]在癌症治疗中，要求药剂的量在施用于动物或患者后可以有效的特异性杀死至少一部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞；特异性诱导至少一部分肿瘤细胞、肿瘤或肿瘤内血管内皮细胞中的细胞凋亡；特异性促进至少一部分肿瘤或肿瘤内血管中的凝血；特异性堵塞或破坏肿瘤的至少一部分血液输送管道；特异性诱导至少一部分肿瘤内的坏死；和/或引起肿瘤的衰退或缓解。
[0166]在治疗病毒感染和相关疾病中，药剂的量是可以有效抑制病毒感染进行中所需的一种或多种活动，诸如病毒入侵，和优选的，来自受感染宿主细胞的病毒复制、进出和扩散。所说的量还可以以阻碍病毒复制、扩散和进行感染的形式杀死或去除至少一部分受病毒感染的细胞。总而言之，要求药剂的量是在施用于动物或患者时能有效减少、显著减少或消灭病毒感染的量。
[0167]术语“优先地”和“特异性地”用于此处时是指抗氨基磷脂或抗阴离子磷脂抗体、基于3G4的治疗剂或基本上细胞不透性PE结合肽衍生物，优选耐久霉素衍生物，基本上局限于在发病部位达到抗癌或抗病毒效果，且基本上不会在动物或患者正常健康组织中引起凝血、破坏和/或组织坏死。健康细胞和组织的结构和功能基本上保持不受本发明实施的损害。
[0168]附图简述
[0169]以下图表组成了本说明书的一部分，用于进一步证明本发明的某些方面。本发明可以参照这些图表中的一个或多个并结合本文所提供的具体实施方案的详述而得到更好的理解。本专利的美国文件包含至少一幅彩图。如果需要并付必需的费用，带彩图的本专利复印件将由专利商标局提供。
[0170]图1.抗PS抗体(3SB)对小鼠内人何杰金氏淋巴瘤、3LL小鼠肺癌和B16小鼠黑素瘤中血管内皮细胞的定位。对患肿瘤的SCID小鼠静脉内注射20yg抗PS(3SB)或抗CL(Dll)小鼠IgM。I小时后用盐水灌注血液循环系统。I小时后处死小鼠，收获肿瘤和器官并速冻。用山羊抗小鼠IgM-过氧化物酶缀合物检测冰冻切片上的小鼠IgM。在所有肿瘤中抗PS抗体都特异地定位于血管处(箭头所指)。在注射对照样品抗CL IgM的小鼠中未观察到其定位。
[0171]图2A和图2B.9D2抗体和膜联蛋白V与吸附于塑料制品上的磷脂的结合。磷脂被吸附于微量滴定板的塑料上。用10%的血清封闭后，在存在10%血清的条件下加入6.66nM-0.005nM浓度范围的9D2抗体(图2A)或膜联蛋白(图2B)。洗涤平板后，分别用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜联蛋白V IgG及随后加入的抗兔HRP检测被结合的9D2抗体和膜联蛋白V。
[0172]图3.竞争性磷脂脂质体抑制9D2抗体和膜联蛋白V与经过氧化氢处理过的内皮细胞上的阴离子磷脂的结合。9D2抗体和膜联蛋白V(6.66nM)与含10%血清的各种磷脂脂质体(200 μ g/ml)DPBS缓冲液预保温。分别用山羊抗大鼠IgM-HRP和兔抗膜联蛋白V IgG及随后加入的抗兔HRP检测被结合的9D2抗体和膜联蛋白V。测定存在或缺乏竞争性脂质体条件下的结合。三份平行试样测定值的标准偏差小于平均值的10%。
[0173]图4.生物素化9D2抗体和膜联蛋白V在小鼠中同位MDA-MB-231人乳癌内血管内皮细胞和肿瘤细胞中的定位。对在乳房脂垫处有MDA-MB-231肿瘤的Nu/Nu小鼠静脉内注射50μ g生物素化的9D2抗体或100 μ g生物素化的膜联蛋白V。I小时后，用盐水灌注它们的血液循环系统。切除肿瘤和器官并速冻。用链霉亲和素-HRP缀合物检测冰冻切片上被定位的9D2和膜联蛋白V。将来自用盐水或对照大鼠IgM注射的小鼠的肿瘤切片作为阴性对照。
[0174]图5.低氧和炎性细胞因子对PS暴露的联合作用。在含氧量正常的(白色柱)和低氧的(灰色柱)条件下用IL-1 α和TNF α处理bEnd.3细胞24小时。在这些条件下细胞单层保持完整并存活。通过检测1251-膜联蛋白V的结合测定PS的外在化。PS的暴露水平表示为在用放线菌素D和TNF α联合处理的细胞中的百分数。
[0175]图6Α和图6Β.抗PS抗体(3SB)在有同基因和异基因肿瘤的动物中的抗肿瘤作用。将IXlO7个细胞的小鼠结直肠癌Colo26(图6A)或人何杰金氏淋巴瘤L540 (图6B)分别皮下注射入BALB/c小鼠(图6A)或雄性CB17SCID小鼠(图6B)的右侧。待肿瘤长至大小约0.6-0.9cm3后，对小鼠(每组4只)腹膜内注射20μ g裸露的抗PS抗体(空心正方形)或盐水(空心圆)。每隔48小时重复类似处理3次。每天监测动物的肿瘤大小和体重。当肿瘤长至2cm3时处死小鼠，或者如果肿瘤出现坏死或溃疡的征兆时也可提前处死。对照小鼠IgM给出了与盐水类似的结果。
[0176]图7.9D2抗体在携带L540人何杰金氏淋巴瘤的小鼠中的抗肿瘤作用。与对照(空心正方形)相反，对携带肿瘤的小鼠组腹膜内注射100 μ g 9D2抗体(实心圆圈)，每周3次。每周两次用卡钳测量肿瘤大小。以肿瘤体积对肿瘤细胞注射后的天数作图。括弧内的数字表明肿瘤衰退的小鼠数目/每组小鼠的总数目。
[0177]图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图8F和图8G.在有同基因和异基因肿瘤的动物中抗PS抗体3G4的抗肿瘤作用。将小鼠Meth A肿瘤细胞(图8A)、人MDA-MB-231乳癌细胞(图8B和图8E)、人何杰金氏淋巴瘤L540细胞(图8C和图8D)以及MDA-MB-231癌细胞(图8F和图8G)注射入小鼠。处理前使肿瘤长到所示的大小。人何杰金氏淋巴瘤细胞可被允许长至形成大肿瘤。每组小鼠每周3次腹膜内注射10yg 3G4抗体，与对照相反(3G4在图8A、图8B和图8C中被指出 ，而在图8D、图8E和图8F中则用空心圆圈表示)。每周监测动物肿瘤尺寸两次。将肿瘤体积对肿瘤接种后的天数(图8A)或对处理天数(图8B和图8C)作图，共20-30天(图8A、图8B和图8C;括弧内的数字表明肿瘤衰退的小鼠数目/每组小鼠的总数目)或60天(图8D、图8E和图8F)。3G4抗体和嵌合的3G4抗体(ch3G4)用于处理MDA-MB-231癌细胞，与对照相反(图8G)。
[0178]图9A和图9B.3G4抗体对体外CMA复制的抑制。用3G4处理被CMV感染的HHF-R2细胞(最上方的两个图)。对照孔未经处理(下方的两个图)或用同种型匹配的对照IgG3抗体GV39G处理(中间的两个图)。在不同的时间点观察细胞:第3天(左边的柱)和第9天(右边的柱)。被感染细胞在荧光显微镜下呈现绿色。抗体施用浓度为100 μ g/ml (图9A)和 50 μ g/ml (图 9B)。
[0179]图10.体外CMV复制的浓度依赖型抑制。用不同浓度的3G4处理被CMV感染的HHF-R2细胞(上方的组图)。对照孔未经处理(下方的图)或用同种型匹配的对照1863抗体GV39G处理(中间的组图)。在第9天观察细胞。被感染细胞在荧光显微镜下呈现绿色。
[0180]图11A、图1IB和图11C.经抗体处理的细胞中CMV病毒负载量和病毒复制周期晚期复制抑制的定量。以0.01pfu/细胞的低感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，并用指定浓度的3G4抗体、对照抗体GV39G或对照抗秋水仙碱抗体C44 (图1lA ;未处理，未处理对照)处理。以3pfu/细胞的高感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，并用50 μ g/ml或100 μ g/ml的3G4抗体或对照抗体GV39G(图11B)处理。以高感染复数用CMV感染人成纤维细胞单层，在感染后的指定时间点加入3G4抗体或对照抗体GV39G(图11C)。在图11A、图1lB和图1lC各图中，用标准噬斑检测法对细胞内和上清液中的病毒水平进行定量。
[0181]图12.3G4UB9和3SB抗体对RSV体外复制的抑制作用。用3G4UB9和3SB处理受RSV感染的A-549细胞，以未处理细胞作为对照。用1B9(绿色)和3SB (红色)处理导致病毒复制呈现对数减少(与蓝色的对照相比较)。3G4的更显著的抗病毒效果用粉色显
/Jn ο
[0182]图13A、图 13B、图 13C、图 13D、图 13E、图 13F、图 13G、图 13H、图 131、图 13J、图 13K、图13L、图13M、图13N、图130、图13P、图13Q和图13R。耐久霉素衍生物的结构。描绘了来自实施例XV的实例性耐久霉素衍生物的化学结构。在图13A至图130的各化合物中，已将PE结合肽耐久霉素与细胞不透性基团连接以便防止构建物发挥显著的、非特异的毒性作用。耐久霉素母体环肽的示意性结构如图13P中所示。线性序列用SEQ ID N0:9表示，而序列中被修饰氨基酸的结构如图13Q中所描述的。图13R描绘了示范性的耐久霉素抗病毒构建物，其中的耐久霉素与西多福韦连接。
[0183]图14A、图14B、图14C和图14D。耐久霉素衍生物的结合特异性。按实施例XV中所述制备耐久霉素衍生物并按实施例XV中所述用ELISA和竞争性ELISA测定它们的特异性。图14A，耐久霉素衍生物对一组磷脂的磷脂结合概况，显示了对PE的特异性；图14B，血清对PE结合无显著的影响；图14C和图14D，来自竞争性ELISA，证实了耐久霉素衍生物对PE的特异性。
[0184]图15。耐久霉素衍生物对CMV体外复制的抑制作用。用耐久霉素衍生物(DLB)4NA和(DM)nHIgG处理被CMV感染的HHF-R2细胞。对照孔未处理。在不同的时间点观察细胞:第4天(左图)和第6天(右图)。被感染的细胞在荧光显微镜下呈现绿色。(DLB)4NA和(DM)nHIgG抑制来自逐个感染细胞的病毒扩散。
[0185]图16。抗PS抗体对分裂内皮细胞的选择性抑制作用。如实施例XVIII中所述检测抗PS抗体3SB、9D2和3G4在体外对内皮细胞的抑制作用。与对静止(汇合)细胞的作用相反，3SB、9D2和3G4抗体中的每一种都展示了对于分裂中的(亚汇合)内皮细胞的选择性抑制作用。9D2和3G4抗体均具有比3SB更强的抑制作用。
[0186]图17A和图17B。在患肿瘤的小鼠中3G4抗体的抗血管发生和血管靶向作用。用10yg/剂的3G4抗体(处理组，右边的组图)或相同剂量的同种型匹配对照抗体(对照组，左边的组图)每周 3次处理患MDA-MB-231同位肿瘤的裸鼠。处理结束后,灌注动物并将肿瘤速冻，切片并用小鼠血管结构的泛内皮标记-抗小鼠CD31抗体(大鼠，抗小鼠CD31)染色(图17A)，或者包埋于石蜡中并用H&E染色(图17B)。比较来自对照和被处理动物的肿瘤切片，显示了 3G4的施用导致了抗血管发生(图17A)和血管靶向(图17B)效果。
[0187]图18A和图18B。3G4抗体互补决定区(⑶Rs)的DNA和氨基酸序列。展现了重链(图 18A ；SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2)和轻链(图 18B ；SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4)的DNA和氨基酸序列，且显示了 DNA序列中的限制性位点。前导序列与成熟蛋白质区别开来，它的起始在图18A和图18B中分别以第一个箭头指示。给出了移植包含人恒定区的各可变序列的典型方法，其中相应人恒定区序列(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)的第一部分在图18A和图18B中分别用第二个箭头指示。
[0188]图19A和图19B。IgG抗PS抗体3G4和IgM抗PS抗体3SB与PS结合的比较。用高达3.375nM的抗体浓度通过ELISA测定IgM抗体3SB ( ?)以及两个IgG抗体-3G4 ( ▲)和3Β10(.)与PS的结合(图19Α)。还分别展示了 3SB(^)、3G4(AJ和3Β10(.)抗体在浓度高至0.06ηΜ时与PS的结合(图19Β)。
[0189]图20。用竞争性磷脂脂质体抑制3G4抗体与固定化PS的结合。将3G4抗体(0.1 μ g/ml)与从纯磷脂(PS-L、PE-L、P1-L、PC-L、CL-UPA-L 和 PG-L)制备而来的各种脂质体或单独的缓冲液(对照)一起预保温30分钟。然后将混合物加入被PS包被的ELISA平板中，漂洗并用二抗和OPD检测被结合的抗体。图中显示了在所列举脂质体存在条件下的结合，并与无任何脂质体存在条件下3G4抗体的结合进行了比较。
[0190]图21。嵌合3G4与磷脂的结合。按实施例XIX中所述制备嵌合3G4抗体(ch3G4)。磷脂(PS、P1、PE、PC、SM、CL、PG和PA)吸附于微量滴定板的塑料上。封闭后，以所示浓度添加嵌合3G4抗体。漂洗平板并通过二抗结合和呈色检测被结合的嵌合3G4抗体。
[0191]图22。嵌合3G4在体内对肿瘤血管内皮的定位。将生物素化的ch3G4(上方的组图)和对照IgG(下方的组图)施用于患MD-MBA-435S肿瘤的小鼠。肿瘤切片用Cy3缀合的链霉亲和素染色来检测生物素化的抗体(左边的组图)。用MECA 32抗体以及随后加入的FITC标记的抗大鼠IgG 二抗染色来检测血管内皮(中间的组图)。将红色和绿色的图形合并(右边的组图)，其中肿瘤血管内皮上结合的生物素化蛋白质呈现黄色。通过叠合图像上的黄色显示了被定位的3G4抗体和血管内皮MECA32标记物的重合染色结果(上方右图)。
[0192]图23。3G4增强了 PS阳性细胞的巨噬细胞吞噬作用。用绿色荧光染料CFDA标记HL-60肿瘤细胞，并用200 μ M H2O2诱导PS暴露。收获处理过的细胞并用5 μ g/ml 3G4或同种型匹配对照抗体(BBG3)调理I小时。然后将靶细胞加入巨噬细胞中，后者是从小鼠骨髓中分离的并在容器内的载玻片上于含5ng/ml GM-CSF的培养基中培养35天。2小时后，固定载玻片并在荧光显微镜下对胞噬作用进行直观计数。结果表示为发生胞噬作用的巨噬细胞的百分数(已吞噬了至少一个肿瘤细胞的巨噬细胞)。
[0193]图24A和图24B。多西他赛诱导内皮细胞上PS的暴露。用1nM多西他赛处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HMVEC) 24小时。收获细胞，用PBS漂洗，并与lOμg/ml 3G4—起在冰上放置30分钟。然后将细胞洗两次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，并将细胞再在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞，并用FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson, San Jose, CA)通过CellQuest搜索软件进行FACS分析。与未处理的细胞相比，处理过的HUVEC (图24A)和HMVEC (图24B)均显示了与3G4结合的显著增加。
[0194]图25A、图25B和图25C。用多西他赛诱导肿瘤细胞上PS的暴露。用1nM多西他赛处理小鼠路易斯肺癌(lewis lung carcinoma) 3LL、小鼠结肠癌Colo26和人乳癌MDA-MB-435细胞24小时。收获细胞，用PBS漂洗，并与10 μ g/ml 3G4 一起在冰上放置30分钟。然后将细胞洗两次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG并将细胞再在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞，并用FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson, San Jose, CA)通过CellQuest搜索软件进行FACS分析。与未处理的细胞相比，处理过的3LL(图25A)、Colo26(图25B)和MDA-MB-435 (图25C)均显示了与3G4结合的显著增加。
[0195]图26.用多西他赛诱导人乳癌MDA-MB-231细胞上PS的暴露。用1nM多西他赛处理人乳癌MDA-MB-231细胞24小时。收获细胞，用PBS漂洗并与嵌合3G4(ch3G4)或对照-人IgG —起在冰上放置30分钟。然后漂洗细胞两次，如上所述，加入FITC标记的抗IgG并通过FACS分析细胞。与对照-人IgG相比，ch3G4的结合有显著的增加。
[0196]图27.用抗PS抗体处理增加了受mCMV感染的小鼠的成活率。按实施例XXI中所述，用mCMV感染Balb/C小鼠并用3G4或ch3G4处理小鼠。感染90天后监测小鼠的成活率。
[0197]图28.用耐久霉素-生物素衍生物DLB处理增加了受CMV感染的小鼠的成活率。按实施例XXII中所述，用mCMV感染Balb/C小鼠并用DLB处理小鼠。感染90天后监测小鼠的成活率。
[0198] 图29A和图29B。嵌合3G4与被牛痘病毒感染的细胞的结合。用牛痘病毒感染U937细胞并在感染后的第2天用嵌合3G4抗体(ch3G4)或对照人IgG (HIgG)染色。图29A，未感染的U-937细胞。图29B，被牛痘病毒感染的U937细胞。图29A和图29B中的峰是:左峰(红色)，只加二抗的对照；中间峰(蓝色)，对照HIgG ;右峰(绿色)，ch3G4。
[0199]图30A、图30B、图30C和图30D。用3G4抗体抑制Pichinde病毒的体外复制。用Pichinde病毒以0.01pfu/个细胞的感染复数感染Vero细胞。用100 μ g/ml 3G4(图30A)或同种型匹配对照抗体GV39G(图30B)处理被感染的细胞。在感染后第2天，用胰蛋白酶收获细胞并使其粘附于载玻片上。用丙酮固定细胞，并用抗PIC兔多克隆血清以及随后加入的山羊抗兔生物素缀合二抗染色。被感染的细胞染色呈红褐色。单独施加二抗的样品未被染色(图30C)。经3G4处理细胞中被感染细胞占对照处理细胞中被感染细胞的百分数也显示于图中(图30D)。
[0200]图31。耐久霉素-人IgG(HIgG)缀合物抑制体内MethA肿瘤的生长。按实施例XXV中所述，用耐久霉素-HIgG缀合物(D-SIAB) nHIgG(其中用SIAB接头将耐久霉素与HIgG缀合)或者用对照HIgG处理具有MethA肿瘤细胞的BALB/c小鼠。
[0201]图32.耐久霉素缀合物无细胞毒性。用MTT检测法检测天然耐久霉素化合物和生物素化耐久霉素构建物DLB对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性作用。
[0202]图33。耐久霉素-抗体缀合物增强了巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。通过将耐久霉素与一种小鼠IgG2a抗体C44连接产生耐久霉素-C44 (DuC44)，构建出耐久霉素抗体缀合物。在DuC44、对照小鼠抗体BBG3和3G4抗体存在的条件下将凋亡的HL-60细胞与小鼠骨髓来源的巨噬细胞一起保温。吞噬作用以摄取呈阳性的吞噬细胞的百分数方式评估。数据是平均值土 S.E.。
[0203]例证性的实施方案的描述
[0204]实体瘤和癌在人类所有癌症中所占比例超过90%。虽然在淋巴瘤和白血病的治疗中已经研究了单克隆抗体和免疫毒素的应用(Vitetta等，1991)，但是这些药剂在抗癌和其它实体瘤的临床试验中无效的结果令人失望(Abrams和Oldham, 1985)。基于抗体的治疗无效的首要原因是大分子不容易转运进入实体瘤。甚至一旦进入了肿瘤块内，由于肿瘤细胞间存在紧密连接、纤维基质、间质压力梯度和结合位点屏障，这些分子也不能均匀分布(Denekamp, 1990 ；Dvorak 等人，1991)。
[0205]在开发用于治疗实体瘤的新策略的过程中，涉及靶向肿瘤血管结构而非肿瘤细胞的方法具有明显优势。有效破坏或阻断肿瘤血管，则阻止了经过肿瘤的血流并导致雪崩式的肿瘤细胞死亡。抗体-毒素和抗体-凝血剂构建物，例如选择性破坏和/或堵塞肿瘤血管的VTA，早已有效用于特异性靶向并破坏肿瘤血管结构，导致肿瘤坏死(Burrows等人，1992 ;Burrows 和 Thorpe，1993 ；W0 93/17715 ；W0 96/01653 ;Huang 等，1997 ;分别收编于此作为参考)。
[0206]VTAs在实体瘤的已有血管上发挥其主要的作用，而不同于阻止新血管形成的抗血管发生药剂。VTAs相比于其它癌症治疗剂有许多优越之处。首先，仅仅一条血管为成百上千的肿瘤细胞提供营养并促进代谢废物的去除，只要在某一点被破坏就会阻断上下游的血流。因此VTAs对于已建立的肿瘤尤其有效。其次，无需杀死内皮细胞，尽管这是一个有效的机制。血液凝结的形成或局部引发的变化就足够了。第三，内皮细胞与血流相邻，保证了足够的药物递送。第四，靶目标是不太可能具有造成药物抗性的遗传突变的正常二倍体细胞。第五，生物学活性的代用标记，即血流，是可检测的。
[0207]第六，对血管功能的短暂影响可能足以产生显著的抗肿瘤效用。研究表明，在局部缺血2小时内体内99%以上的肿瘤细胞能被杀死。最后，与血管发生抑制剂不一样，VTAs只需间歇施用以便协同加强常规疗法的作用，而无需几个月或几年的长期施用。
[0208]在以下专利中有对细胞毒性VTAs的描述:美国专利号5，660，827 ；5, 776,427 ；5，855，866 ;5，863，538 ;5，965，132 ;6，004，554 ;6，051，230 ;6，261，535 和 6，451，312，分别收编于此作为参考。其中的抗体、生长因子或其它的结合配基用于特异递送凝血剂至肿瘤血管结构，这样的药剂被称为“凝血配体”。凝血配体VTAs参阅以下专利:美国专利号6，093，399 ;6，004，555 ;5，877，289 和 6，036，955，分别收编于此作为参考。
[0209]目前优选用于凝血配体的凝血剂是截短的组织因子(tTF) (Huang等人，1997 ；WO 96/01653 ;美国专利号5，877，289)。TF是血液凝结的主要起始因子(Ruf等，1991 ;Edgington等，1991)。在损伤位点，血液中的因子VII/VIIa开始接触并结合血管周围组织内细胞上的TF。存在磷脂表面时，TF=VIIa复合物激活因子IX和X。这继而导致凝血酶、纤维蛋白、和最终血块的形成(Ruf和Edgington, 1994)。
[0210]缺失胞质和跨膜结构域的重组、截短形式的组织因子(tTF)是诱发凝血能力比天然TF低约5个数量级的可溶性蛋白质(Stone等，1995 ;Huang等，1997)。这是因为TF需要联合磷脂与VIIa形成复合物，从而有效激活IXa或Xa。不过，当tTF通过靶向抗体或药剂的方式递送至肿瘤血管内皮时，它重新接近脂质表面并恢复血栓形成活性(Huang等，1997 ;美国专利号 6，093，399，6，004，555，5，877，289 和 6，036，955)。由此形成了选择性地在肿瘤血管引起血栓的凝血配体。
[0211]截短的TF具有几个优势，使其被推荐用于血管靶向凝血配体中:人tTF易于获取，且人蛋白质对人体只具有可忽略的或微弱的免疫原性；人tTF在包括小鼠在内的实验动物中是完有功能的；且靶向tTF具有高潜能，因为它可引发凝血蛋白质级联反应的激活，产生大大增强了的效应(美国专利号 6，093，399，6，004，555，5，877，289 和 6，036，955)。
[0212]已经描述了在肿瘤内皮上可供利用、但在正常内皮上基本上不存在的多种合适的革巴分子。例如，可以利用被表达的革巴，诸如endoglin、E-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、ICAM-1、PSMA, TIE、与LAM-1反应的配体、VEGF/VPF受体、FGF受体、α ν β 3整联蛋白、ple1tropin、或内皮唾液酸蛋白(美国专利号5，855, 866 ；5, 877, 289 ；Burrows等人，1992 ；Burrows 和 Thorpe, 1993 ；Huang 等人，1997 ；Liu 等，1997 ；Ohizumi 等，1997 ;分别收编于此作为参考)。
[0213]吸附的靶是另一组合适的靶，诸如VEGF、FGF、TGF^、HGF、PF4、PDGF, --ΜΡ、结合TIE的配体、或肿瘤相关性纤连蛋白异构体(美国专利号5，877，289，5，965，132，6，051，230和6，004，555)。纤连蛋白异构体是可结合受体整联蛋白家族的配体。肿瘤相关性纤连蛋白异构体是肿瘤血管结构和肿瘤基质二者的可祀向成分。单克隆抗体BC-1 (Carnemolla等，
1989)特异结合肿瘤相关性纤连蛋白异构体。
[0214]如美国专利号5，776，427，5，863，538和6，036，955所述，通过天然的肿瘤环境或人为干预后可诱导的其它靶目标也是可靶向的实体。当与正常组织的预先抑制和肿瘤血管诱导结合使用时，也可以采用MHC II类抗原作为靶目标(美国专利号5，776，427，5，863，538，6，004，554 和 6，036，955)。
[0215]目前优选用于临床的一个靶目标是血管内皮粘附分子-1(VCAM-1)(美国专利号5，855，866,5, 877，289,6, 051，230,6, 004，555 和 6，093，399)。VCAM-1 是由炎性细胞因子IL-1 a、IL-4(Thornhill等，1990)和TNFa (Munro，1993)诱导的细胞粘附分子，它在体内的作用是向急性发炎部位补充白细胞(BeviIacqua, 1993)。
[0216]VCAM-1存在于许多人类恶性肿瘤的血管内皮细胞中，包括成神经细胞瘤(Patey等，1996)、肾癌(Droz 等，1994)、非小细胞肺癌(Staal -van den Brekel 等，1996)、淋巴肉芽肿病(何杰金氏病)(Patey等，1996)和血管肉瘤(Kuzu等，1993)，还存在于良性肿瘤血管内皮细胞上，诸如痣(Patey等，1996)和血管瘤(Kuzu等，1993)。VCAM-1在人体中的组成性表达仅限于甲状腺、胸腺和肾的一些血管(Kuzu等，1993 ；Brui jn和Dinklo, 1993),而在小鼠内则限于心脏和肺的血管(Fries等，1993)。
[0217]本文给出的某些数据甚至进一步补充了美国专利5，855，866，5，877，289，6，051，230，6，004，555和6，093，399中所提供的数据，并证明了抗-VCAM-1.tTF凝血配体的施用选择性地诱导了血栓症和肿瘤梗死。所展示的结果是以带L540人何杰金淋巴瘤的小鼠为材料得到的。当作为异种移植物生长于SCID小鼠中时，就炎性细胞因子的表达以及其血管结构上VCAM-1和其它内皮细胞活化分子的存在而言,该肿瘤显不与人类疾病非常类似(Diehl 等，1985)。
[0218]利用共价连接的抗-VCAM-1.tTF凝血配体(其中tTF直接与抗-VCAM-1抗体直接连接)，本文显示了凝血配体选择性地定位于肿瘤血管处，诱导那些血管的血栓形成，在携带L540何杰金实体瘤的小鼠中引起了整个肿瘤发生坏死并延缓了肿瘤的生长。肿瘤通常需要直径至少约0.3cm才能对凝血配体产生反应，因为在较小的肿瘤上没有VCAM-1。估计可能是因为在小肿瘤中，肿瘤细胞或浸润肿瘤的宿主细胞分泌的细胞因子水平对于VCAM-1 的诱导来说太低了。这与美国专利 5，855，866，5，877，289，6，051，230，6，004，555 和6，093，399中的研究结果是一致的，其中的发明显示出在较大的实体瘤中最有效。
[0219]尽管最初更多的是在肿瘤周边观察到VCAM-1染色，凝血配体明显地结合并堵塞输送血液的血管一因为它能减少所有肿瘤区的血流。此外，有一
【发明者】还考虑到由于最初施加凝血配体所引起的凝血酶的产生有可能导致中枢血管上进一步的VCAM-1诱导作用(Sluiter等，1993)，从而产生扩大的信号并导致对肿瘤内区域的明显破坏。这种类型的凝血配体诱导的其它可靶向标记物的表达以及由此产生的信号放大在美国专利6，036，955中有所描述。
[0220]正如本文所显示的，尽管通过施加抗VCAM-1凝血配体观察到其定位于小鼠心脏和肺中表达VCAM-1的血管上，但此构建物并未在这样的非肿瘤部位诱发血栓形成。而且，抗VCAM-1凝血配体对小鼠的毒性并不比具有无关特异性的对照凝血配体更大，再次表明了 VCAM-1在心脏和肺血管上的组成性表达不会产生毒性。由于VCAM-1是人类肿瘤血管内皮中天然存在的标记物，此结果对于当前凝血配体疗法的临床进展尤为重要。另一方面，此现象还为
【发明者】提供了独一无二的视野，导致了完全不同的破坏肿瘤血管结构的方法。
[0221]A.利用裸露的抗氨基磷脂抗体治疗肿瘤
[0222]
【发明者】试图了解抗VCAM-1凝血配体能结合组成性表达于心脏和肺血管上的VCAM-1却不会在那些血管中引起血栓形成这一现象背后的机制。对于此只凭经验观察到的现象有许多科学的可能性解释，通常与肿瘤环境中的前血检形成特性以及心脏和肺中任何血纤维蛋白溶解诱因相关。
[0223]一般而言，在凝血系统(纤维蛋白沉积)和纤溶系统(纤维蛋白被酶降解)之间存在着生物学平衡。不过，在恶性病，尤其是肿瘤中，此平衡被破坏，导致了凝血的异常激活(血凝过快或“前血栓形成状态”)。尽管进行了大量的研究，直到最近才了解了肿瘤环境中前血栓形成状态的明确分子机制。
[0224]在详细分析许多可能后，
【发明者】推断抗VCAM-1凝血配体之所以不会在正常组织血管内引起血栓形成是由于这些血管内腔表面缺乏氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸(PS)。因此，为了证实这一理论，不仅需要证明在这些正常血管上无磷脂酰丝氨酸，还需要证实它们存在于肿瘤相关血管的内腔侧面上。
[0225]因此，
【发明者】用免疫组织化学染色来确定静脉内注射入患肿瘤小鼠体内的单克隆抗磷脂酰丝氨酸(抗PS)抗体的分布状态。这些研究显示，在心脏和肺中表达VCAM-1的血管缺乏PS，而在肿瘤中表达VCAM-1的血管也表达PS。
【发明者】还发现结合PS的膜联蛋白V在体外和体内均阻断抗VCAM-1.tTF凝血配体的作用，这进一步证实了在凝血配体的作用中需要表面PS的表达。
[0226]因此，至少在某种程度上，抗VCAM-1凝血配体在正常心脏和肺血管上无血栓形成作用的原因可以解释为:由于缺乏氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸，意味着正常血管上没有凝血复合物组装所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情况下，抗VCAM-1 -tTF与表达VCAM-1的心脏和肺血管结合，但不会诱发血栓形成。相反，在肿瘤中表达VCAM-1的血管显示出同时表达了表面PS。因此，凝血配体与肿瘤血管结合，并局部激活了凝血因子，从而形成了堵塞的血栓。
[0227]除了描述抗VC AM-1凝血配体的肿瘤特异性血栓形成作用外，在肿瘤血管内腔表面上氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸的特异表达还使
【发明者】能够解释早期研究中观察到却不能理解的前血栓形成表型。PS表达在肿瘤血管结构的前血栓形成状态中起了重要的作用。
[0228]在他们发现代表性的氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸特异地表达于肿瘤血管内腔表面而不表达于正常血管中后，
【发明者】推断其它的氨基磷脂也具有作为治疗干预靶目标的可能。
【发明者】因此以靶向于氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺(PE)为基础开发了肿瘤血管系统靶向和治疗方法。
[0229]本发明的
【发明者】研究中尤其令人意外的发现是施用未缀合的抗氨基磷脂抗体对于肿瘤治疗是有效的。由此，通过使用可与氨基磷脂结合的未缀合或“裸露的”抗体，为肿瘤治疗提供了新的重要的途径。这些肿瘤血管结构靶向和治疗方法参阅收编于此作为参考的美国专利6，406，693。尽管在本领域公认的动物模型中的抗肿瘤作用在美国专利6，406，693中得到了证明并在本文中进一步扩展，但是由美国专利6，406，693之前的研究并不能预测到氨基磷脂用作安全有效的肿瘤血管结构可靶向标记物的能力。
[0230]一旦氨基磷脂作为肿瘤血管结构特异标记物的发现得到证实，
【发明者】开始开发一系列靶向氨基磷脂的免疫毒素和凝血配体用于肿瘤治疗中。正如美国专利6，406，693中所解释的，这导致了裸露抗氨基磷脂抗体用于肿瘤治疗的意外发现。在有关将毒素或凝血剂递送至肿瘤血管结构时利用氨基磷脂进行靶向的可能性研究中，
【发明者】意外的发现在未附加任何效应子的情况下裸露的抗PS抗体对体内肿瘤血管具有破坏作用。抗氨基磷脂抗体既特异定位于肿瘤血管系统又发挥伴随的破坏作用从而导致肿瘤坏死的能力是根本未曾预料到的。
[0231]在其它实施方案中，本发明提供了不寻常且改进了的“第二代”抗PS抗体在肿瘤疗法中作为裸露抗体。本文公布了一组第二代抗PS抗体，其中单克隆抗体9D2和3G4 (ATCC4545)是目前优选的，本文还与此一起公布了产生和选择具有所说优越特性的更多抗体的特殊免疫接种和筛选技术。本文还显示了抗PS抗体对肿瘤血管的损害至少在某种程度上是通过宿主效应物介导的。正如本文所讲述的，由本发明
【发明者】的这些和其它了解可以优化裸露抗体疗法，包括单独使用和与本文所教导的其它抗癌剂结合使用的情况。
[0232]B.利用抗阴离子磷脂抗体治疗肿瘤
[0233]美国专利6，406，693说明了氨基磷脂-磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺通常与不同细胞中质膜双层的内表面分离(Gaffet等，1995 Julien等，1995),这种脂质分离产生了不对称的跨双层。尽管膜不对称性的存在已被讨论相当一段时间了，但对其存在的原因和产生及调控的机制仍了解甚少(Williamson和Schlegel, 1994),尤其是在除了血小板之外的细胞中。
[0234]
【发明者】在较早的时候证实了 PS移位至肿瘤血管内皮细胞表面，并且至少在显著的程度上，这种现象的发生与细胞凋亡或其它细胞死亡机制无关(美国专利号6，406，693)。因此，在肿瘤环境中PS的表面表达不是细胞死亡的结果，也不是由它引起了即时的细胞毁坏。尽管在各种实体瘤中完整血管内皮细胞上始终可以检测到PS的暴露，肿瘤血管内皮却不是真正凋亡的，而是形态学上完好的(尽管不同于正常组织中的情形)，而且是代谢活跃的。这对于基于PS靶向的治疗方法来说是重要的，意味着PS向肿瘤血管内皮细胞外膜的移位对于PS用作成功治疗(利用裸露的抗体或治疗性缀合物)的可靶向实体是足够稳定的。
[0235]尽管在美国专利6，406，693 (和6，312，694，见下文)中有重要的发现，但基于磷脂的肿瘤血管内皮细胞靶向这一推测只局限于氨基磷脂的靶向，如PS和PE。通过开发对不同磷脂和氨基磷脂具有强特异性的生物学方法，本发明的
【发明者】目前已确定了在肿瘤血管内皮细胞上不可思议地上调了的新的磷脂范围。这些是阴离子磷脂，本文中显示出它们也是肿瘤血管系统的特异且稳定的标记，使利用可与阴离子磷脂结合的裸露抗体和免疫缀合物二者进行治疗干预成为可能。
[0236]阴离子磷脂正常条件下在静息哺乳动物细胞表面基本上是不存在的。磷脂酰丝氨酸这种最丰富的质膜阴离子磷脂，正常条件下在大部分细胞类型中被紧密隔离于质膜内表面(Williamson 和 Schlegel, 1994 ；ZwaaI 和 Schroit, 1997)。憐脂酸肌醇(PI)是另一种主要的阴离子磷脂，也主要位于质膜的内表面(Calderon和DeVires，1997)。次要的阴离子磷脂-磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)只在一些细胞类型中检测到，但它们也表现出主要位于质膜的内表面(Hinkovska-Galcheva等，1989)。另一种阴离子磷脂_心磷脂存在于线粒体膜上而非质膜上(Daum, 1985)。
[0237]中性磷脂也不对称地分布于质膜内。中性磷脂-磷脂酰乙醇胺(PE)主要位于内表面。含胆碱的中性磷脂-磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)主要位于外表面。
[0238] PS和PE的不对称性通过ATP-依赖型转运蛋白-氨基磷脂移位酶(Mg2+ATPase)来维持，该酶催化氨基磷脂从质膜外表面向内表面转运(Seigneuret和Devaux, 1984)。PS和PE不对称性的丧失或崩溃是由于质膜内这些磷脂向外运动所造成的，或者是由于对移位酶的抑制(Bitbol等，1987 ;Comfurius等，1990)、PS转运蛋白的激活和/或变频酶(scramblase)的激活所引起的，变频酶是双向转运所有磷脂的Ca2+依赖型酶(Zhao等，1998)。
[0239]在不同的病理和生理状态下都观察到了 PS不对称性的丧失，包括细胞损伤、程序性细胞死亡和凋亡(Blankenberg等，1998 ；Bombeli等，1997)、细胞衰老(Herrmann和Devaux, 1990)、血小板的活化(Rote 等，1993 ；ZwaaI 等，1989)、受伤(Boyle 等，1996)和恶性转化(Sugimura等，1994)。PS的暴露还在成肌细胞(Sess1ns和Horwitz, 1981)和营养细胞(Adler等，1995)的胞间融合、细胞迁移(Vogt等，1996)和细胞脱粒(Demo等，1999)中起着一定的作用。内皮细胞对由凝血酶(Qu等，1996)、|丐离子载体或佛波酯(Julien等，1997)、高脂血症(Lupu等，1993)和非溶胞浓度的补体蛋白质C5b_9 (Christiansen等，1997)所诱导的Ca2+流量增加产生反应而将PS外在化。在无外源激活剂或细胞损伤的情况下在恶性细胞内也观察到自发的PS暴露(Utsugi等，1991)。
[0240]膜PS暴露后产生几个主要的后果。有吞噬作用的巨噬细胞识别、附着和消灭PS阳性的衰老和凋亡细胞(McEvoy等，1986 ；Tait和Smith, 1999)。PS还介导T淋巴细胞与凝血酶活化的内皮细胞附着(Qu等，1996)。补体系统被PS激活并促成PS阳性细胞的裂解(Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通过为凝血复合物的装配和活化提供带负电荷的脂类表面而促使前凝血剂移动至内皮上(Williamson和Schlegel, 1994 ；Bombeli等，
1997)。长期以来已对肿瘤内皮的前血栓形成特征有所认识(Donati和Falanga，2001)。
[0241]尽管科学文献集中于PS上，并且
【发明者】的早期工作局限于诸如PS和PE等氨基磷月旨(美国专利号6，406，693和6，312，694)，本发明的
【发明者】猜测在肿瘤血管结构上可能有更宽范围的磷脂变得暴露。由于肿瘤微环境的应激状态增加，
【发明者】推断在肿瘤血管结构中许多阴离子磷脂可能上调，从而为治疗性干预提供了潜在的新机会。
[0242]
【发明者】认识到肿瘤内皮的损伤和活化是由以下物质引起的:1)肿瘤来源的细胞因子，诸如白介素-1和肿瘤坏死因子，它们激活内皮并诱导细胞粘附分子的表达(Shaughnessy等，1989 ;0rr等,2000) ；2)由粘附于内皮上的白细胞产生的活性氧类型(ROS) (Orr 等，2000);和 3)作为代谢副产物(Shaughnessy 等，1989 ；Soares 等，1994)或由于暴露于复氧后的低氧血中(Zulueta等，1995)由肿瘤细胞自身产生的R0S。这些观察结果暗示可能由肿瘤内皮中的这些应激产生Ca2+流量，接着通过变频酶的活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS和PE的暴露。
[0243]另一方面，
【发明者】进一步推断不只是氨基磷脂PS和PE，阴离子磷脂在肿瘤血管结构中也会上调。为了检测细胞表面阴离子磷脂，
【发明者】创造了新的单克隆抗体9D2，它与阴离子磷脂而非中性磷脂反应。9D2因此与普通的氨基磷脂结合剂区别开来，因为它与阴离子氨基磷脂PS结合，而不与中性氨基磷脂PE结合。9D2抗体还比天然配体膜联蛋白V更特异于阴离子磷脂，其中膜联蛋白V除了与阴离子磷脂结合外还强烈结合PE(Blankenberg等，
1998)。
[0244]正如本申请所详述的，
【发明者】发现9D2和膜联蛋白V在静脉内注射入带各种类型实体瘤的小鼠中后特异地定位于肿瘤内皮。此发现证实了
【发明者】的假设，即阴离子磷脂通常在肿瘤血管内皮表面变得暴露，且可用作肿瘤治疗(和成像)的靶分子。本发明因此提供了一系列新方法和基于抗体的组合物，可用于靶向阴离子磷脂和治疗肿瘤，在裸露抗体和细胞毒性药物、细胞因子、凝血剂等的投递中均可如此。除了如美国专利6，406，693和6，312，694中所述靶向于PS之外，本发明目前优选的靶向阴离子磷脂是PI ( 一种主要的阴离子磷脂)、PA和PG，在某些实施方案中还考虑使用靶向CL。
[0245]本发明的主要发现之一是阴离子磷脂暴露于肿瘤内皮的表面(实施例VI)。此现象通过两种选择性结合阴离子磷脂的独立药剂得到证明:单克隆抗体9D2，这是
【发明者】为了证明此点而特别开发的，还有膜联蛋白V。9D2抗体和竞争性抗体是本发明更优选的组分。
[0246]9D2抗体和膜联蛋白以高亲合力和特异性结合吸附于塑料上、作为脂质体或者体外活化或凋亡内皮细胞膜表面上所展示的阴离子磷脂。9D2与PS、PA和CL强结合，但与PI和PG的结合则弱得多。正如过去所发现的，膜联蛋白V除了结合PS、CL、PA、PI和PG之外，还结合 PE (Andree 等，1990 ；Schlaepfer 等，1987 ；Boustead 等，1993 ；Blackwood 和 Ernst,
1990)。9D2抗体对阴离子磷脂的识别在血清存在与否的条件下都是相同的，表明结合不需要血清辅因子。9D2与阴离子磷脂的结合不需要Ca2+离子，而膜联蛋白V的结合则需要Ca2+。
[0247]对PS包被平板的交叉封闭研究显示9D2和膜联蛋白V不会相互阻断与PS的结合。这表明所说的两种药剂识别PS分子上的不同表位，或更有可能识别不同包装形式的PS。膜联蛋白V被认为结合平坦的PS表面,而抗PS抗体则被认为结合六角形包装的PS (Rauch和Janoff, 1990) 0两种形式都可能存在于PS包被的平板上。这些实际的交叉封闭研究(实施例VI)还用于表明，一旦提供一参照抗体(如9D2)，就能方便的鉴定出有效竞争结合阴离子磷脂的抗体，即与参照抗体基本上结合相同表位的抗体。
[0248]本申请还显示，9D2抗体和膜联蛋白V特异性定位于肿瘤血管和体内检测的所有肿瘤的坏死区内和周围的肿瘤细胞(实施例VI)。肿瘤中15-40%的血管具有阴离子磷脂阳性内皮。相反，正常组织中没有血管具有可检测到的外在化阴离子磷脂。
[0249]9D2对肿瘤血管的染色特异性通过以下几点得到证明:1)用对照大鼠IgM则无肿瘤血管的染色；2)用制备自阴离子磷脂的脂质体可以封闭9D2或膜联蛋白V与经H2O2-处理的体外内皮细胞的结合，而制备自中性磷脂的脂质体则不能；3)用去污剂或有机溶剂从肿瘤部分提取走磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜联蛋白都不定位于正常器官的静止内皮上。
[0250]肿瘤血管结构中由9D2或膜联蛋白定位的主要阴离子磷脂有可能是PS，因为它是最丰富的阴离子磷脂，并且它在细胞表面的暴露受环境变化或损伤的调控。不过，其它的阴离子磷脂(如P1、PA、PG)也有可能暴露，尽管它们没有这么丰富。
[0251]尽管用9D2未检测到，但主要的中性磷脂PE仍有可能与PS —起造成在肿瘤血管上可以观察到的膜联蛋白定位。还已知PE暴露于肿瘤内皮上，且PE在质膜中的位置受到与PS相似的方式调节(美国专利6，406，693) JE部分地被氨基磷脂移位酶隔离在质膜的内表面，尽管速度较PS慢(Devaux，1992)，而且它还被变频酶转运到外表面(Zhou等，1997)。象PS 一样，PE在细胞凋亡和细胞活化期间也会暴露(Emoto等，1997 ；Umeda和Emoto，1999)。
[0252]为了检验肿瘤内皮细胞上阴离子磷脂暴露的机制，进行了一系列的研究，其中用已知存在于肿瘤微环境中的各种因子和条件来处理体外内皮细胞(实施例VII)。低氧血后的复氧、酸性和凝血酶使PS在活内皮细胞上的暴露比所有细胞凋亡情况下观察到的提高了 10-22%的水平。炎性细胞因子(TNFa和IL-1)也会微弱但明确的诱发PS暴露。
[0253]这些发现与肿瘤中低氧血/复氧结合炎性因子、凝血酶和酸性会诱导阴离子磷脂暴露于血管内皮的可能性是相一致的。尽管对于实施本发明来说并不需要了解确切的机制，但作为代谢的副产物或对低氧血的响应，肿瘤细胞可能产生ROS (Zulueta等，1995)。肿瘤细胞释放的细胞因子可能诱导了内皮上介导活化巨噬细胞、多形核细胞和血小板与肿瘤内皮的粘附的白细胞粘附分子和进一步的ROS分泌。然后ROS可能通过含巯基转运分子的氧化或脂类的过氧化诱导PS移位(Herrmann和Devaux, 1990),这可能是通过引起Ca2+的流入或细胞内忙备Ca2+的释放而实现的(Wang和Joseph, 2000)。
[0254]PS和其它阴离子磷脂的暴露在某种程度上解释了长久以来认识到的肿瘤内皮的前凝血状态(Donati和Falanga, 2001)。阴离子磷脂提供了凝血因子聚集和装配的表面(Bevers等，1985 ；Dachary-Prigent等，1996)。它还为帮助白细胞浸润入肿瘤的循环巨曬细胞(McEvoy等，1986)、T淋巴细胞(Qu等，1996)和多形核细胞提供了附着位点。
[0255]可结合阴离子磷脂的抗体和其它配体因此可被用于肿瘤血管的靶向、成像和/或治疗。由于以下几个原因，阴离子磷脂作为肿瘤靶十分引人注目:它们是丰富的(每个细胞上存在3xl06个PS分子)；它们位于肿瘤血管的内腔表面，可以直接到达从而便于血液中血管靶向剂的结合；它们存在于各种实体瘤的绝大部分肿瘤内皮细胞上；且它们在正常组织的内皮细胞上基本上没有。
[0256]应用血管靶向剂的药物或凝血剂也显示出在携带大实体瘤的小鼠中非常有效，且有时还有疗效(Huang 等，1997 ;Nilsson 等，2001 ;美国专利 5，660，827，5，776，427，5，855，866，5，863，538，5，965，132，6，004，554，6，051，230，6，261，535，6，093，399，6，004，555，5，877，289和6，036，955)。本发明因此提供了针对阴离子磷脂的裸露抗体和血管靶向剂用于在人类癌症的诊断和治疗中靶向肿瘤血管结构。
[0257]尽管实施本发明不需要对针对阴离子磷脂和氨基磷脂的裸露抗体如何在肿瘤治疗中发挥作用有准确的分子水平的了解，
【发明者】还是考虑了可能造成所观察到的内皮细胞被杀死现象的几种机制。最可能的机制(尤其是对于本文所述的3G4抗体来说)是Fe结构域介导的免疫效应子功能，诸如抗体依赖型细胞毒性(ADCC)、补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体介导的胞噬作用。细胞介导的细胞毒性、补体介导的细胞裂解和/或凋亡、抗体诱导的细胞信号传导和/或对细胞骨架的扰乱也可能涉及在内。
[0258]抗阴离子磷脂和氨基磷脂的完整抗体，尤其是3G4，与血管内皮细胞表面的结合意味着抗体的Fe部分突出入血管的内腔。由于抗体Fe片段激活了补体途径，所观察到的细胞破坏可能是补体指导的细胞裂解的结果。因此抗体结合激活了补体依赖型凝血级联反应，引起多组分复合物的装配并最终产生能透过靶细胞的裂解复合物。“补体激活的ADCC”还可在破坏细胞中起作用，其中补体与抗体包被的靶细胞结合，而具有补体受体的细胞，如嗜中性粒细胞，会裂解靶细胞。
[0259]当裸露或未缀合抗体，包括其抗原结合片段，与阴离子磷脂和氨基磷脂在肿瘤血管内皮细胞表面结合时，它们将在内腔表面形成一抗体包被层。这可以起到吸引诸如细胞毒性T细胞和/或天然杀伤(NK)细胞等免疫效应细胞的作用,然后免疫效应细胞将在血管内皮细胞上发挥细胞介导的细胞毒性功能。
[0260]与阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合还可在肿瘤血管内皮细胞中诱导细胞凋亡。尽管尚无已知的有关与PS的抗体结合真正诱导凋亡的报道(而非有关PS是凋亡产生的标记)，
【发明者】仍考虑这可能是所观察到的抗肿瘤效应的另一可能机制。
[0261]还可能的是肿瘤血管内皮细胞表面上与阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合可能引起细胞内骨架组织的紊乱。由于细胞骨架在膜表面的组织中起着重要的作用，且由于抗体的结合可能扰乱(或进一步扰乱)了膜，抗体与阴离子磷脂和氨基磷脂的结合可能将变化传递至与膜双分子层相互作用的细胞骨架蛋白。已知骨架蛋白的空间结构可控制膜的稳定性和细胞形状，且有可能某些细胞骨架平衡状态的扰乱可能对细胞的完整性具有深远的影响。
[0262]本发明作用的另一机制可能是与内皮细胞表面阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体结合可能通过目前未确定的途径起始信号的转导。抗体结合还可能扰乱已知的信号转导，如通过改变膜受体、信号转导蛋白、膜通道等的构象和/或相互作用。有关细胞破坏(凋亡)的信号可以被引发或模拟，并且/或者保护/内环境稳定的信号可能被抑制。
[0263]尽管存在科学方面的兴趣，但实施本发明无需确定抗阴离子和氨基磷脂的裸露抗体造成血管破坏的确切性质。既然已显示这些类的抗体的施用有利地在体内产生了抗肿瘤效用，这样的疗法就能应用，而不管造成此现象的分子机制是什么。因此，可结合阴离子磷脂和氨基磷脂的裸露抗体的应用代表了肿瘤治疗中的一个重要进展，在制备和成本上都具有优势。
[0264]C.抗阴离子磷脂和氨基磷脂抗体
[0265]由于本发明鉴定出了一类新型肿瘤血管系统标记，即阴离子磷脂，因此，可与一种或多种阴离子磷脂结合的裸露的抗体和免疫缀合物(任选的与氨基磷脂联合)目前可以用于肿瘤诊断和治疗中。
[0266]Cl.多克隆抗体
[0267]本领域众所周知用于制备并鉴定抗体的方法(参阅如《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)冷泉港实验室，1988 ;本文收入作为参考)。为了制备多克隆抗血清，用本文所述含免疫原性阴离子磷脂和/或氨基磷脂(包括用H2O2处理过的细胞和其它药剂)的组合物免疫动物，并由经免疫动物收集抗血清。广泛的动物物种可以用于生产抗血清。用于生产抗血清的动物通常是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、或山羊。因为兔的血量相对较大，所以优选兔用于生产多克隆抗体。
[0268]用于生成多克隆抗体的免疫原组合物的量随免疫原的本质以及用于免疫的动物而变化。多种途径可以用于施用本发明免疫原:包括皮下、肌肉内、真皮内、静脉内、腹膜内、和脾内。可以通过在免疫后多个时间点由经免疫动物取血样来监控多克隆抗体的生成。还可以给予第二次加强注射。重复加强和测效价过程，直至达到合适的效价。当获得期望效价水平时，可以给经免疫动物放血，分离并保存血清。动物还可用于产生单克隆抗体。
[0269]正如本领域众所周知的，特定组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的免疫应答非特异性刺激剂而获得增强。例示性佐剂包括完全弗氏佐剂，其包含杀死的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答非特异性刺激剂；不完全弗氏佐剂；和氢氧化铝佐剂。
[0270] 还可能期望加强宿主的免疫系统，这可以通过将阴离子磷脂和氨基磷脂与载体相联合或偶联来实现。例示性载体是钥孔虫?血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，诸如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、或兔血清清蛋白，也可以作为载体使用。
[0271]正如本领域众所周知的，指定组合物的免疫原性可以变化。然而，产生针对阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体并不特别困难。例如，通过肌肉内注射含磷脂酰丝氨酸的聚丙烯酰胺凝胶和用磷脂酰丝氨酸-细胞色素C囊泡免疫的兔子内可产生高度特异的抗磷脂酰丝氨酸抗体(Maneta-Peyret等，1988 ；1989 ;分别收编于此作为参考)。利用丙烯酰胺植入物增加了抗体的产生(Maneta-Peyret等，1988 ；1989)。以此方式产生的抗磷脂酰丝氨酸抗体能原位检测人血小板上的磷脂酰丝氨酸(Maneta-Peyret等，1988 ；1989)。Inoue、Rote和Rauch的研究小组还开发了抗PS和抗PE抗体(见下文)。
[0272]尽管针对阴离子磷脂和氨基磷脂的抗体的产生可以通过各种方法完成，本文实施例IV中还是描述了某些优选的方法。
[0273]C2.单克隆抗体
[0274]现在本领域还众所周知用于产生单克隆抗体(MAb)的各种方法。大多数标准单克隆抗体生成技术通常由符合制备多克隆抗体的路线开始(《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港实验室，1988 ;本文收入作为参考)。通过用免疫原性阴离子磷脂和/或氨基磷脂组合物免疫动物来起始多克隆抗体应答，当获得期望的效价水平时 ，经免疫动物可以用于生产MAb。优选的，利用本文所述的特殊筛选和选择技术挑选具有所探寻特征的抗体。
[0275]通过使用众所周知的技术，诸如美国专利号4，196，265 (本文收入作为参考)中例示的技术，可很容易制备MAb。这种技术通常涉及用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。以能有效刺激抗体生成细胞的方式施用免疫组合物。优选动物是啮齿类动物，诸如小鼠和大鼠，但是也可以使用兔、绵羊、和蛙的细胞。使用大鼠可能有些好处(Goding，1986，第60-61页；本文收入作为参考)，但是优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为它是最常规使用的且通常具有较高的稳定融合百分比。
[0276]免疫后,选择有潜力生成预期抗体的体细胞,具体而言是B淋巴细胞(B细胞)，用于产生mAb。这些细胞可以由脾、扁桃体、和淋巴结活组织样本或者由外周血样品获得。优选脾细胞和外周血细胞，因为前者是处于成浆细胞分裂阶段的抗体生成细胞的丰富来源，而后者易于获得。通常，需要免疫一组动物，切下具有最高抗体效价的动物脾脏，并用注射器对获得的脾进行匀浆而获得淋巴细胞。来自经免疫小鼠的脾通常包含大约5x107-2x108个淋巴细胞。
[0277]然后将来自经免疫动物、生成抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合，永生化骨髓瘤细胞通常与免疫的动物属于相同物种。适用于杂交瘤生产融合程序的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，具有高融合效率，并具有酶缺陷，使其不能在只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。
[0278]正如本领域技术人员知道的，可以使用大量的骨髓瘤细胞中的任一种(Goding，第65-66页，1986 ;Campbell，第75-83页，1984 ;本文收入作为参考)。例如，当经免疫动物是小鼠时，可以使用 P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、MPC_ll、MPC11-X45-GTG 1.7、和 S194/5XX0 Bul ;对于大鼠，可以使用 R210.RCY3、Y3_Ag 1.2.3、IR983F、4B210、或上文所列的小鼠细胞系；对于人细胞融合，可使用U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2、和 UC729-6。
[0279]用于产生抗体生成脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交细胞的方法通常包括在存在促进细胞膜融合的(化学的或电学的)药剂的条件下将体细胞与骨髓瘤细胞以4:1的比例混和，但是比例可以在约20: I与约1:1之间变化。Kohler和Milstein(1975 ;1976 ;本文收入作为参考)已经描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，Gefter等人(1977 ;本文收入作为参考)已经描述了使用聚乙二醇(PEG)，诸如37% (v/v)PEG的方法。电诱导融合方法的使用也是合适的(Goding，第71-74页，1986 ;本文收入作为参考)。
[0280]融合程序常常以大约lx10_6-lxl0_8的低频率产生能存活的杂交细胞。然而这不是问题所在，因为通过在选择性培养基中进行培养，能够区分能存活的融合杂交细胞与亲本未融合细胞(特别是通常可持续进行无限期分裂的未融合的骨髓瘤细胞)。选择性培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的药剂的培养基。例示性和优选的药剂是氨基蝶呤、氨甲喋呤、和重氮丝氨酸。氨甲喋呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤合成。当使用氨甲喋呤或氨甲喋呤时，要向培养基中添加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，要向培养基中添加次黄嘌呤。
[0281]优选的选择性培养基是HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。在骨髓瘤细胞中补救途径的关键酶是缺陷的，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因此它们不能存活。B细胞能够进行该途径，但是它们在培养中的寿命是有限的，通常在大约2周内死亡。因此，能够在选择性培养基中存活的细胞只有由骨髓瘤与B细胞形成的杂交细胞。
[0282]这种培养提供了杂交瘤细胞群，由此可选择特定的杂交瘤。通常在微量滴定板中培养由单克隆稀释的细胞，随后在大约2-3周后对各个克隆的上清液检验期望的反应性，从而选择杂交瘤。测定法应当是灵敏的、简单的、且快速的，诸如放射性免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬斑测定法、斑点免疫结合测定法、等等。
[0283]然后对选择的杂交瘤进行系列稀释，并克隆形成产生抗体的各个细胞系，可以无限繁殖这些克隆来提供mAb。可以以两种基本方式用这些细胞系产生mAb。其一是将杂交瘤样品注射(通常为腹腔内)进入组织相容性动物，这些动物与提供体细胞和骨髓瘤细胞用于最初融合的动物种类相同。经注射动物形成肿瘤，分泌由融合的杂交细胞产生的特定单克隆抗体。然后可以对动物进行穿刺来吸取体液(诸如血清或腹水)，提供高浓度的mAb。另一种方法是在体外培养单个细胞系，此时通常分泌mAb进入培养基，由此可容易的获得高浓度的mAb。
[0284]通过每种方法产生的mAb通常将进一步纯化，如使用过滤、离心、和各种层析法，诸如HPLC或亲和层析法，本领域技术人员众所周知所有纯化技术。这些纯化技术都涉及分级分离，以将期望抗体与混和物其它成分分开。特别适用于抗体制备的分析方法包括例如蛋白A-Sepharose和/或蛋白G-Sepharose层析法。
[0285]D.抗阴离子磷脂和氨基磷脂的第二代抗体
[0286]本发明提供了结合氨基磷脂和阴离子磷脂的“第二代”抗体，所说的抗体具有改良的特性且/或不具有现有技术中抗体相关的缺点。本文描述了这样一组抗体，其中单克隆抗体9D2和3G4是目前优选的，尤其优选3G4 (ATCC 4545)抗体。本发明还提供了特殊的免疫和筛选技术，它可以产生具有优越特性和/或较少缺点的“类似”或“竞争性”抗体。
[0287]Dl.抗体特性
[0288]本发明的第二代抗体结合氨基磷脂和阴离子磷脂，且不具有通常与抗这些磷脂的抗体相关的致病特性。这就在某种程度上使得
【发明者】可能开发新的免疫和筛选技术。
[0289]抗磷脂综合症(APS)与所谓“抗心磷脂”抗体和“狼疮抗凝血抗体”的自身抗体相关。这些综合症与倾向静脉和动脉血检检塞、血小板减少症和许多神经系统综合症相关。在这些患者中的抗磷脂抗体因此是“致病抗体”。
[0290]尽管多年来被描述成“抗磷脂抗体”和“抗PS抗体”，但这些致病抗体实际上识别结合心磷脂、PS或二者的蛋白质辅因子，而非磷脂本身(Galli等，1990 ；1993 ；McNeil等，1990 ；Rote, 1996)。抗心磷脂抗体识别β 2-糖蛋白I上的特殊区域(第281位残基和第288位残基之间)，而狼疮抗凝血抗体识别凝血酶原。类似的，疾病状态下存在的抗PE抗体结合PE与蛋白质的组合，所述蛋白质诸如低分子量和高分子量激肽原(HK)、激肽释放酶原和因子XI联合结合PE (Sugi和McIntyre，1995 ； 1996a ； 1996b)。基于此类型的蛋白质识别，患者中的抗磷脂抗体顶替了磷脂的蛋白质辅因子，从而产生了疾病的症状。
[0291]基于其并非与蛋白质辅因子联合的氨基磷脂和阴离子磷脂，而是“真正的”抗磷脂抗体这一点，特别选择出了本发明的抗体。这样，本发明的抗体不结合或置换磷脂的蛋白质辅因子，因此可以安全施用。事实上，用高剂量的本发明抗体长时期处理的小鼠未显示出凝血能力的改变，而当注射抗心磷脂或狼疮抗凝血抗体时，小鼠会有APS的反应。
[0292]无论基本机制为何，人群中存在的抗磷脂抗体都与自身免疫疾病相关，如，系统性红斑狼疮(Branch 等，1987 ；Staub 等，1989 ；Drouvalakis 和 Buchanan, 1998 ；Smirnov 等，1995 ；Rauch 等，1986 ；Rauch 和 Janoff, 1990)和复发性流产(Rote 等，1995 ；Rote 等，1996 ；Vogt等，1996 ；1997 ;Katsuragawa等，1997)。当本发明的抗体施用于小鼠或猴子时,不会产生这样的症状。
[0293]此外，被诸如9D2和3G4 (ATCC 4545)等本发明抗体识别的表位与膜联蛋白V识别的不一样。本文显示，所说的药剂不会相互交叉阻断各自与磷脂的结合。3G4和9D2抗体所识别的表位可能是六角形包装形式的PS，这是具有免疫原性的形式。膜联蛋白除了结合六角形形式的PS外，还可能结合平坦的PS。六角形的PS集中于与细胞活化相关的质膜突出中和凋亡细胞上的“泡”中。因此，诸如9D2和3G4(ATCC 4545)抗体等的本发明抗体的有限分布进一步造成了无可检测到的细胞毒性和无抗体凝血效果。
[0294]为了产生具有优越特性且/或减少或基本上无副作用的抗氨基磷脂和阴离子磷脂抗体，本发明提供了优选的免疫接种和筛选方法。其它的免疫技术和抗体在文献中已有报道(Umeda等，1989 ;Igarashi等，1991 ;Rote等，1993),包括那些具有针对所涉及脂肪酸的报道特异性的文献(Levy等，1990 ；Qamar等，1990)。另一方面,本发明的免疫技术、特别是对无血清依赖性的抗体的选择也提供了特别的有利之处。
[0295]Umeda等(1989)报道了识别磷脂酰丝氨酸的立体特异表位的单克隆抗体的产生。不过，Umeda的方法具有用沙门氏菌包裹的氨基磷脂样品直接将磷脂酰丝氨酸免疫小鼠脾脏的缺点(Umeda等，1989)。Umeda等(1989)所报道的许多抗体还展示了抗凝血活性,这是一个缺点，而本发明抗体并不如此。3G4抗体的结合模式与Umeda等(1989)的PSC8抗体不同。
[0296]本发明的抗体还具有识别所有或大部分阴离子磷脂的优势，它能提供更多的结合靶目标。因此，本发明的第二代抗体可以定义为，如本文表4中所述，与9D2或3G4(ATCC4545)抗体具有基本上相同或完全相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。
[0297]Igarashi等(1991)也报道了抗PS抗体的诱导，但再次使用了脾内免疫接种，并且当再次静脉注射抗原时只观察到了微弱的效价增加。大部分来自Igarashi等(1991)的MAbs与DNA交叉反应，且许多展示了狼疮抗凝血活性，这些缺点均不存在于本发明
【发明者】开发的抗体中。本发明优选的3G4抗体的结合模式也不同于Igarashi等(1991)表1中的那些抗体。
[0298]其它研究者已报道了与一种以上阴离子磷脂交叉反应的小鼠单克隆抗体的狼疮抗凝血活性(Alving等，1987 ；Rauch&Janoff, 1990),而本发明的
【发明者】则未经历任何困难就可得到无狼疮抗凝血活性的抗体。这代表了本发明的方法、抗体和竞争性抗体的独特优势。
[0299]除了避免使用来自患者的抗体之外，如Rauch等(1986)、Hasegawa等(1994)、Ravirajan等(1995)和Menon等(1997)中所述的抗体,本申请还通过与本领域中的已有抗体(如Rote等(1993)所述的3SB抗体)的并列比较证明了本发明提供抗体的优越特性。尽管3SB抗体具有适用于本文所公布的各种方法的特性，本发明
【发明者】开发的抗体在比较研究中仍然胜过3SB抗体，例如，如本文所示，与3SB抗体相比，3G4抗体的抗病毒作用增强(实施例XIII)。
[0300]本发明的抗体还以其亲和力为特征。在本发明之前，本领域中的抗体具有相对弱的亲和力(按其报道的)。在某些实施方案中，本发明的第二代抗体因此被定义为，如表3中所述，对PS的亲和力至少与9D2或3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力(具体而言，如本文所述在ELISA中检测到的亲和力)相同且不依赖于血清的抗体。
[0301]更优选的，本发明的第二代抗体被定义为，如表3中所述，对PS的亲和力至少与9D2或3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力相同且如本文表4中所述与9D2或3G4(ATCC4545)抗体具有基本上相同或相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。最优选的，第二代抗体是如表3中所述对PS的亲和力至少与3G4(ATCC 4545)抗体对PS的亲和力相同且如本文表4中所述与3G4(ATCC 4545)抗体具有相同的磷脂特异性且不依赖于血清的抗体。
[0302]D2.CDR 技术
[0303]抗体由可变区和恒定区组成。如本文所用，涉及抗体的术语“可变的”指抗体序列中广泛不同并用于每一种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的可变结构域某些部分。然而，可变性并不是均匀分布在整个抗体可变结构域上，而是集中在轻链和重链可变结构域中都有的称为“高变区”的三个区段中(除了下文所讨论的骆驼源化抗体之外)。
[0304]可变结构域中更高度保守的部分称为框架区(framework reg1n,FR)。天然轻链和重链的可变结构域各包含4个FR(分别为FR1、FR2、FR3、和FR4)，主要采用β -折叠片构象，由3个高变区相连，它们形成环，连接(在某些情况中是构成)β -折叠片结构部分。
[0305]每条链中的高变区由FR紧密维持在一起，并与其它链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(Kabat等人，1991 ;本文特别收入作为参考)。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是展示多种效应物功能，诸如抗体参与依赖抗体的细胞毒性。
[0306]如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域第24-34位(LI)、第50-56位(L2)、和第89-97位(L3)残基，重链可变结构域第31-35位(Hl)、第50-56位(H2)、和第95-102位(H3)残基；Kabat等人，1991，本文收入作为参考)和/或来自“高变环”的残基(即轻链可变结构域第26-32位(LI)、第50-52位(L2)、和第91-96位(L3)残基和重链可变结构域第26-32位(Hl)、第53-55位(H2)、和第96-101位(H3)残基)。“框架”或“FR”残基是除了本文定义的闻变区残基以外的可变结构域残基。
[0307]本文提供了 3G4抗体(ATCC 4545)的Vh和V κ链的DNA和推导的氨基酸序列，分别见SEQ ID N0:l、2、3和4。这些序列包含抗体重链和轻链可变区的⑶Rl_3。借助本文提供的序列和其它信息以及现有技术知识，目前能够产生一系列3G4样和改进的抗体和抗原结合区，并因此包含在本发明内。
[0308]在某些实施方案中，本发明提供了由保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一个CDR。在另一实施方案中，本发明提供了 CDR、抗体或其抗原结合区，它结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，而且它包括由保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一个⑶R。
[0309]本发明的其它方面涉及具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一种CDR，或其变体或诱变形式。本发明的其它方面涉及CDR、抗体或其抗原结合区，它结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，且包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一种CDR，或其变体或诱变形式，其中所说的变体或诱变形式保持了与该氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
[0310]在一个具体实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合区，其中3G4抗体(ATCC4545)框架区已从小鼠IgG改变成人IgG，诸如人IgGl，或其它IgG亚类，从而降低在人体内的免疫原性。在其它实施方案中，在3G4抗体(ATCC 4545)序列中检测T细胞表位的存在，正如本领域中已知的。然后可改变相应序列以去除T细胞表位，即使抗体“脱免疫”。
[0311]3G4抗体的Vh和Vk链的DNA和氨基酸序列(SEQ ID N0:l、2、3和4)的可用性意味着现在能够用CDR技术制备一系列抗体。具体而言，对在CDR中进行随机突变，并筛选产物，以鉴定出具有较高亲合力和/或更高特异性的抗体。这样的诱变和选择是抗体领域内常规实施的。由于本文所公布的优越的筛选技术，这种方法尤其适用于本发明。
[0312]这些技术可用于产生相对于其来源亲本抗体诸如9D2或3G4(ATCC4545)来说生物学特性有所改良的抗体变体。这些变体或第二代化合物通常是在亲本抗体中包含一处或多处高变区残基取代的取代变体。用于产生这些取代变体的便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟法。
[0313]在使用噬菌体展示的亲和力成熟法中，对几个高变区位点(如6-7个位点)进行突变，从而在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。由此产生的抗体变体以单价方式，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体形式展示在丝状噬菌体颗粒上。然后，如本文公开的，对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。
[0314]⑶R改组和植入技术也可用于本发明的抗体，优选9D2和3G4 (ATCC4545)抗体。⑶R改组是将⑶R序列插入一特殊的框架区(Jirholt等，1998，特别收编于此作为参考)。⑶R植入技术允许⑶R序列随机组合入单一的主体框架中(Soderlind等，1999，2000，分别收编于此作为参考)。利用这样的技术，可将例如3G4 (ATCC 4545)抗体的⑶R序列诱变而产生众多的不同序列，它们被掺入骨架序列中，并对所产生的抗体变体筛选期望特征，如较高亲和力。
[0315]根据本文所公布的内容，抗体、优选9D2和3G4(ATCC 4545)抗体的抗原结合片段还可以被最小化，从而提高稳定性。这可以基于免疫球蛋白VH和VH-样结构域通过制备单一结构域结合蛋白质来完成(Nuttall等，2000，特别收编于此作为参考)。
[0316]或者/另外，可以描绘并分析抗原-抗体复合物的晶体结构，从而鉴定抗体与靶氨基磷脂或阴离子磷脂(如PS)之间的接触点。这些接触残基和邻近残基是替代的候选者。一旦产生了这些变体，如本文所述，对变体理进行筛选，选择出在一种或多种相关测定法中显示出相似但是不同或甚至更好的特性的抗体用于进一步的开发。
[0317]D3.胳马它源化抗体(camelized antibodies)
[0318]本发明另外的实施例是“骆马它源化”抗体。来自camels和llamas (Camel Idae,camelids)的抗体包括一种独特类型的抗体，它没有轻链，因此只由重链组成。这些抗体已被称为“骆驼源化抗体”。这样的抗体的抗原结合位点是单一的结构域，被称作Vhh(VHH)。
[0319]本文提供了 3G4 (ATCC 4545)抗体Vh和V κ链的DNA和氨基酸序列(SEQ ID NO:
1、2、3和4)，这样可制备骆驼源化形式的3G4抗体。可以进行突变和结构修改，以将Vh-'对中的Vh改造成保留足够可变性的单一结构域Vhh(Muyldermans等,2001,特别收编于此作为参考)。这样的Vhh构建体是具有强抗原结合能力的小而强且有效的识别单元(Riechmann和Muyldermans, 1999),它具有可与常规Vh-V1j对不易接近的新表位相互作用的更多优势。因此，camelised抗体虽然类似于Fv片段，但具有更多的优势。
[0320]美国专利5，800，988、美国专利 6，005，079、PCT 申请 WO 94/04678、PCT 申请 WO94/25591、Riechmann&Muyldermans (1999)和 Muyldermans 等(2001)都分别收编于此作为参考，以便进一步描述和进行骆驼源化抗体的生产。因此，3G4抗体的CDR可以移植到CameIidae抗体重链免疫球蛋白的可变结构域框架上。
[0321]D4.CDR 序列
[0322]因此，本发明的更多方面涉及编码抗体重链和轻链⑶R区的分离DNA片段和重组载体，诸如9D2和3G4抗体，优选3G4(ATCC 4545)的重链和轻链，还涉及通过DNA技术的应用产生和利用表达这些⑶R区的重组宿主细胞和噬菌体。
[0323]本发明由此提供了含编码保藏号为ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少一种CDR的核酸序列的分离多核苷酸。本发明另外提供了分离的多核苷酸，它包含编码结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)、并包含保藏号ATCC 4545的杂交瘤所产生的抗体的至少的一种CDR的CDR、抗体或其抗原结合区的核苷酸序列。
[0324]本发明的其它方面涉及包含编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的至少一种CDR的核苷酸序列或其变体或诱变形式的分离多核苷酸。本发明的其它方面涉及包含编码CDR、抗体或其抗原结合区(它可结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂，优选PS，且包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的至少一种CDR)的核苷酸序列或其变体或诱变形式的分离多核苷酸，其中所说的变体或诱变形式保持了与所述氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
[0325]在本发明的其它方面，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示核苷酸序列或其变体或诱变形式。具体而言，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的核苷酸序列或其变体或诱变形式，该核苷酸序列编码可结合至少第一氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的CDR、抗体或其抗原结合区，其中任何的所说变体或诱变形式保持了与氨基磷脂或阴离子磷脂(优选PS)的结合。
[0326]本发明由此涉及可由任何哺乳动物(优选人或鼠)分离的不含总基因组DNA、并能够表达抗阴离子磷脂或抗氨基磷脂抗体重链和轻链(诸如9D2和3G4，优选SG4(ATCC4545))的CDR区的多核苷酸和DNA片段。如本文所用，术语“多核苷酸区段”和“DNA区段”指已分离的不含特定物种总基因组DNA的多核苷酸和DNA分子。术语“多核苷酸区段”和“DNA区段”包括DNA片段和这些片段的小片段，还有重组载体，包括例如质粒、粘粒、嗤囷体、病毒等等。
[0327]相似的，包含编码抗阴离子磷脂或抗氨基磷脂抗体(诸如9D2和3G4，优选3G4)重链和轻链的纯化CDR区的编码片段或分离基因部分的DNA片段，指包含这些编码序列(而且在某些方面包含调控序列)、与其它天然存在的基因或蛋白质编码序列基本上分离开的DNA片段。在这方面，术语“基因”简便的用于指功能性蛋白质、多肽、或肽编码单元。本领域技术人员可以理解，这种功能性术语包括表达或可能适合于表达合适的抗原结合蛋白质、多肽、或肽的天然抗体编码序列和更小的基因工程化片段。
[0328]“与其它编码序列基本上分离开”指感兴趣的编码片段或分离基因部分构成DNA片段编码区的重要部分，而且该DNA片段不含天然编码DNA的大部分，诸如大染色体片段或其它功能基因或cDNA编码区。当然，这指最初分离的DNA片段，不排除后来人工添加的基因或编码区。
[0329]在特定实施方案中，本发明涉及分离的编码片段或分离的基因部分，和掺入了编码抗阴离子抗体或抗氨基磷脂抗体重链和轻链(诸如9D2和3G4，优选3G4的重链和轻链)⑶R区的DNA序列的重组载体，所述⑶R区包含具有与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4有至少大约75%;更优选至少大约80%;更优选至少大约85%;更优选至少大约90%、91%、92%、93%、94%;最优选至少大约95%、96%、97%、98%或99%左右氨基酸序列同一性的氨基酸序列区的至少第一序列区；其中所述⑶R区至少基本上维持氨基酸序列SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:2的CDR区的生物学特性。
[0330]如本文公开的，序列中可以包含某些生物学上功能等同的氨基酸或“保守性替代”。其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其特意经基因工程改造以改进CDR或含CDR的抗体的特性，本领域普通技术人员是知道的，本文将进一步描述。
[0331 ] 也可以理解，氨基酸和核酸序列可以包含额外残基，诸如额外的N或C端氨基酸或者5’或3’序列而仍然属于本发明的序列，条件是序列符合上文提出的标准，优选在涉及蛋白质表达时包括生物学蛋白质活性的维持或改进。末端序列的添加包括位于编码区5’或3’部分侧翼的各种非编码序列以及控制区。
[0332]因此，本发明的核酸片段可以与其它DNA序列联合，诸如启动子、多聚腺苷酸化信号、额外的限制酶切位点、多克隆位点、其它编码片段、等等，使得它们的整体长度可能显著变化。因此预计可以采用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选受到意欲采用的重组DNA方案中制备和使用便利性的限制。
[0333] 因此，重组载体形成本发明的另外方面。特别有用的载体预计包括将DNA片段编码部分置于启动子控制之下的载体。通常，将采用重组或异源启动子，即在天然环境中与编码序列通常不相连的启动子，当然并不仅限于此。这些启动子可以包括细菌、病毒、真核、和哺乳动物启动子，只要启动子有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型、生物体、或甚至动物中的表达即可。
[0334]用于蛋白质表达的启动子和细胞类型组合的使用对于分子生物学领域技术人员而言是知道的。采用的启动子可以是组成性的或可诱导的，而且可以在指导导入的DNA片段高水平表达的适当条件下使用，这在诸如大量生产重组蛋白质或肽中是有益的。
[0335]本发明核酸序列的表达可以方便的通过本领域普通技术人员知道的、本文进一步描述的任何一种或多种标准技术来实现。例如，关于融合蛋白质重组表达的后续描述同样可以应用于在核酸水平上不与另一种编码序列可操作相连的抗体和抗体片段。
[0336]E.更多的抗体制备技术
[0337]El.来自噬菌粒文库的抗体
[0338]重组技术现在能够由编码一系列抗体的重组基因制备具有期望特异性的抗体(Van Dijk等人，1989 ;本文收入作为参考)。某些重组技术涉及对使用由经免疫动物的脾分离的RNA而制备的组合免疫球蛋白噬菌体表达文库进行免疫学筛选来分离抗体基因(Morrison 等人，1986 ；ffinter 和 Milstein, 1991 ；Barbas 等，1992 ;本文收入作为参考)。
[0339]对于这些方法，使用由经免疫动物的脾分离的RNA来制备组合型免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用表达抗原的细胞和对照细胞进行淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。这种方法相对于传统杂交瘤技术的优势是可以在一轮中产生并筛选多达大约14倍的抗体，而且通过H链与L链的组合产生了新的特异性，进一步增加了产生适当抗体的可能性。
[0340]用于在细菌中产生多样性抗体分子大型文库的一种方法是利用细菌噬菌体λ作为载体(Huse等人，1989 ;本文收入作为参考)。使用λ载体的抗体生成涉及将重链和轻链DNA序列群克隆到分开的起始载体中。随后随机组合载体形成单一载体，来指导重链和轻链共表达形成抗体片段。由用选定抗原免疫的动物的脾细胞(或其杂交瘤)分离mRNA并进行扩增，优选通过PCR?或相关扩增技术，获得重链和轻链DNA序列。重链和轻链序列通常使用引物进行扩增，所述引物将限制性位点引入扩增DNA片段末端，有助于将重链和轻链片段克隆到起始载体中。
[0341]用于产生并筛选全部或部分合成的抗体结合位点或互补位的大型文库的另一种方法利用了由丝状噬菌体(诸如M13、fl、或fd)衍生的展示载体。这些称为“噬菌粒”的丝状噬菌体展示载体可产生具有不同的和新的免疫特异性的单克隆抗体大型文库。这种技术使用丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域作为在丝状噬菌体复制装配阶段过程中联系基因产物与基因的方法，而且已经用于由组合型文库克隆并表达抗体(Kang等人，1991 ；Barbas等人，1991 ;本文收入作为参考)。
[0342]美国专利号5，658，727描述了这种用于丝状噬菌体展示的常用技术，本文收入作为参考。在最常用的方面，这种方法为使用单一载体系统由抗体基因库同时克隆并筛选预先选定的配体结合特异性提供了一种系统。对文库的分离成员筛选预先选定的配体结合能力能够将表达的抗体分子的结合能力与用于由文库分离成员编码基因的便利方法联系起来。
[0343]通过将融合多肽靶向进入细菌细胞周质以便装配功能性抗体与噬菌体装配过程中将融合多肽靶向至丝状噬菌体颗粒外壳上以便方便的筛选感兴趣文库成员进行组合，可以实现表达与筛选的联系。通过融合多肽中存在的分泌信号结构域来提供周质靶向。通过融合多肽中丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域(即cpIII或cpVIII衍生的膜锚定结构域)的存在来提供噬菌体颗粒靶向。
[0344]可以通过重链和轻链基因的改组，通过改变克隆的文库重链基因的一个或多个互补决定区、或通过易错聚合酶链式反应将随机突变导入文库，来增加基于丝状噬菌体的组合型抗体文库的多样性。美国专利号5，580，717,5, 427，908,5, 403，484、和5，223，409描述了用于筛选噬菌粒文库的其它方法，本文收入作为参考。
[0345]已经开发了用于筛选大型组合型抗体文库的另一种方法，其中利用了多样化重链和轻链序列群在丝状噬菌体(诸如M13、fl、或fd)表面的表达(美国专利号5，698，426，本文收入作为参考)。通过聚合酶链式反应(PCR?)合成了两套多样性重链(He)和轻链(Lc)序列群。将这些序列群克隆到分开的含表达必需元件的基于M13的载体中。重链载体包含基因VIII (gVIII)外壳蛋白序列，使得重链序列的翻译产生gVII1-Hc融合蛋白质。随机组合两套载体群，使得只有包含He和Lc序列的载体部分连接成单个环状载体。
[0346]组合型载体指导He与Lc序列二者的共表达，用于两种多肽的装配和M13表面表达(美国专利号5，698，426，本文收入作为参考)。组合步骤将两套多样性序列群的不同He和Lc编码序列随机带入单个载体。来自每个独立载体的载体序列对于产生存活噬菌体是必需的。另外，既然两种起始载体中只有一种包含假的gVIII序列，那么在噬菌体表面不能够实现功能性抗体片段作为Lc相关性gVII1-Fc融合蛋白质的共表达，除非载体序列连接成单个载体。
[0347]在琥珀抑制子菌株中进行抗体文库的表面表达。He序列与gVIII序列之间的琥珀终止密码子在无抑制子菌株中拆开了两种成分。分离由无抑制子菌株产生的噬菌体并感染抑制子菌株，将在表达过程中将He序列与gVIII序列联系起来。感染后培养抑制子菌株能够在M13表面以gVIII融合蛋白质(gVII1-Fab融合蛋白质)形式共表达文库内所有抗体种类。或者，可以由无抑制子菌株分离DNA，然后导入抑制子菌株来实现相同效果。
[0348]通过标准亲和分离程序对表面表达文库筛选可结合预先选定的分子的特异性Fab片段。这些方法包括例如淘选(Parmley和Smith，1988 ;本文收入作为参考)、亲和层析法、和固相印迹程序。优选淘选，因为可以在小体积中容易的、快速的筛选高效价噬菌体。而且，该程序可以选择群体中用其它方法检测不到的较少Fab片段种类，并扩增成基本上均一的群体。可以在扩增噬菌体群后对编码多肽的核酸进行测序来鉴定选定的Fab片段。
[0349]美国专利号5，667，988和5，759，817描述了用于产生多样性抗体文库并筛选期望结合特异性的另一种方法，本文收入作为参考。该方法涉及使用简并寡核苷酸和引物延伸反应将简并性引入免疫球蛋白可变重链和轻链可变结构域CDR区，并将诱变的多肽展示在噬菌颗粒表面，由此以噬菌粒文库的形式制备杂二聚体免疫球蛋白分子文库。此后，对展示蛋白筛选结合预先选定的抗原的能力。
[0350]用于产生杂二聚体免疫球蛋白分子的方法通常涉及(I)将感兴趣的重链或轻链V区编码基因导入噬菌粒展示载体；(2)通过使用包含抗体V区基因CDR同源区且包含产生随机化编码序列的简并区的寡核苷酸进行引物延伸，将随机化结合位点导入噬菌粒展示蛋白载体，形成展示载体的大型群体，其中的每一个都能够表达在噬菌粒表面展示蛋白上展示的不同的假定结合位点；(3)在丝状噬菌体颗粒表面表达展示蛋白和结合位点；并(4)使用亲和技术来分离(筛选)表面表达的噬菌体颗粒，诸如针对预先选定的抗原进行噬菌体颗粒淘选，由此分离所含展示蛋白包含可结合预先选定的抗原的结合位点的一种或多种噬菌粒。
[0351]美国专利号5，702, 892描述了用于产生多样性抗体文库并筛选期望结合特异性的这种方法的另一种形式，本文收入作为参考。在这种方法中只采用重链序列，对重链序列中编码⑶RI或⑶RIII高变区的所有核苷酸位置进行随机化，并独立于任何生物学过程而产生⑶R遗传变异性。
[0352]在这种方法中，对两个文库进行改造，即对重链基因结构框架内的寡核苷酸基序进行遗传改组。通过CDRI或CDRIII的随机突变，重建重链基因高变区，产生高度多样化序列集合。由突变基因序列集合编码的重链蛋白有可能具有免疫球蛋白的所有结合特征，同时只需要两条免疫球蛋白链之一即可。
[0353]具体而言，在不存在免疫球蛋白轻链蛋白的情况中实践这种方法。将展示经修饰的重链蛋白的噬菌体文库与已固定化的配体一起温育，来选择编码可特异性结合固定化配体的重组蛋白质的克隆。然后将结合的噬菌体与固定化配体解离，通过在细菌宿主细胞中的生长进行扩增。扩增表达不同重组蛋白质的各个病毒斑，然后可以对各个克隆测定结合活性。
[0354]E2.来自人淋巴细胞的抗体
[0355]抗磷脂抗体存在于人种群中。不过，这些抗体通常与疾病相关，本发明中应优选避免使用它们。另一方面，来自健康受试者的人淋巴细胞可适于作为起始材料用于产生本发明中所用的抗体。
[0356]体外免疫或抗原刺激也可以用于产生本发明的人抗体。这些技术可以用于刺激来自正常、健康个体的外周血淋巴细胞，其中仅仅需要用阴离子磷脂和氨基磷脂对抗体生成细胞进行体外刺激。
[0357]这种“体外免疫”涉及通常在淋巴细胞混和群(混和淋巴细胞培养物，MLC)内进行的未免疫B淋巴细胞的抗原特异性激活。体外免疫还可以由B细胞生长和分化因子及淋巴因子获得支持。由这些方法产生的抗体常常是IgM抗体(Borrebaeck等人，1986 ;本文收入作为参考)。
[0358]美国专利号5，681，729描述了能够获得主要产生IgG或IgA抗体的人淋巴细胞的另一种方法，本文收入作为参考。一般地，这种方法涉及将人淋巴细胞移植到免疫缺陷型动物中，使得人淋巴细胞“参与”该动物体；用期望抗原免疫动物，生成可产生对抗原具有特异性的抗体的人淋巴细胞；并由动物回收产生该抗体的人淋巴细胞。由此产生的人淋巴细胞可以用于产生单克隆抗体:即使产生抗体的人淋巴细胞永生化，克隆获得的永生化、人起源、产生抗体的淋巴细胞，并由克隆的永生化人起源淋巴细胞回收对期望抗原具有特异性的单克隆抗体。
[0359]在这种技术中可采用的免疫缺陷型动物是那些在移植了人淋巴细胞后不展示排异的动物。这些动物可以通过物理的、化学的、或生物学的处理而人工制备。可以采用任何免疫缺陷型动物。人淋巴细胞可以由人外周血、脾、淋巴结、扁桃体等等获得。
[0360]动物中移植的人淋巴细胞的“参与”可以通过仅仅对动物施用人淋巴细胞来实现。施用途径不限于且可以是例如皮下、静脉内、或腹膜内。人淋巴细胞的剂量不受限制，通常可以是每只动物16-1O8个淋巴细胞。然后用期望的抗原免疫免疫缺陷型动物。
[0361 ] 免疫后，通过任何传统方法由血液、脾、淋巴结、或其它淋巴组织回收人淋巴细胞。例如，单核细胞可以通过Ficoll-Hypaque (比重:1.077)离心法进行分离，并通过塑料盘吸附法除去单核细胞。来自免疫缺陷型动物的污染细胞可以通过使用对该动物细胞具有特异性的抗血清而除去。可以通过例如用该免疫缺陷型动物的脾细胞免疫另一种不同动物并由该不同的经免疫动物回收血清来获得抗血清。可以在任何阶段进行抗血清处理。也可以通过采用在细胞表面表达作为标记物的人免疫球蛋白的免疫学方法来回收人淋巴细胞。
[0362]通过这些方法，可以获得主要产生对一种或多种选定阴离子磷脂和氨基磷脂具有特异性的IgG和IgA抗体的人淋巴细胞。然后通过永生化、选择、细胞培养、和抗体生成，由人淋巴细胞获得单克隆抗体。
[0363]E3.含人抗体文库的转基因小鼠
[0364]重组技术现在可用于制备抗体。除了上文公开的组合型免疫球蛋白噬菌体表达文库，另一种分子克隆方法是由含人抗体文库的转基因小鼠制备抗体。美国专利号5，545，807描述了这些技术，本文收入作为参考。
[0365]在最常用的方面，这些方法涉及产生在其种系中插入了遗传物质的转基因动物，所述遗传物质编码至少部分的人起源免疫球蛋白，或者可以重排而编码免疫球蛋白集合。可以由人来源产生所述插入的遗传物质，或者可以人工合成。遗传物质可以编码至少部分的已知免疫球蛋白，或者可以经修饰而编码至少部分的经改变免疫球蛋白。
[0366]插入的遗传物质在转基因动物中表达，导致生成至少部分由插入的人免疫球蛋白遗传物质衍生的免疫球蛋白。发现遗传物质在转基因动物中发生重排，使得可以产生部分由插入的遗传物质衍生的免疫球蛋白集合，甚至有时插入的遗传物质以错误位置或错误几何学掺入种系也如此。
[0367]可以以DNA的形式将插入的遗传物质克隆到原核载体中，诸如质粒和/或粘粒。使用酵母人工染色体载体(Burke等人，1987 ;本文收入作为参考)，或者通过导入染色体片段(Richer和Lo，1989 ;本文收入作为参考)，可以插入较大的DNA片段。可以以传统方式将插入的遗传物质导入宿主，例如通过注射或其它程序引入受精卵或胚胎干细胞。
[0368]在优选方面，可利用最初不携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传物质的宿主动物，使得产生的转基因动物在产生免疫球蛋白时将只使用所插入的人遗传物质。这可以通过使用天然存在的缺乏相关遗传物质的突变宿主，或者通过人为制备突变体(如在细胞系中产生最终除去了相关遗传物质的宿主)来实现。
[0369]当宿主动物携带编码免疫球蛋白恒定区的遗传物质时，转基因动物将携带天然存在的遗传物质和所插入的遗传物质，并将产生由天然存在的遗传物质、插入的遗传物质、和这两种遗传物质的混和物衍生的免疫球蛋白。在这种情况中，可以通过筛选由转基因动物衍生的杂交瘤来获得期望的免疫球蛋白，如利用抗体基因表达的等位基因排斥或差异染色体丢失现象。
[0370]一旦制备了合适的转基因动物，即可简单地用期望免疫原免疫动物。根据插入物质的性质，动物可能产生嵌合免疫球蛋白，如混和小鼠/人起源的免疫球蛋白，其中外源遗传物质只编码免疫球蛋白一部分；或者，动物可能产生完全外来的免疫球蛋白，如完全人起源的免疫球蛋白，其中外源遗传物质编码整个免疫球蛋白。
[0371]可以由免疫后的转基因动物产生多克隆抗血清。可以由动物获得免疫球蛋白生成细胞来产生感兴趣的免疫球蛋白。优选由转基因动物产生单克隆抗体，如融合来自该动物的脾细胞与骨髓瘤细胞，并筛选产生的杂交瘤以选择产生期望抗体的杂交瘤。本文描述了用于这些过程的适用技术。
[0372]在另一种方法中，可以以这样一种方式将遗传物质掺入动物，使得在体液(诸如血清或动物的外部分泌物，诸如乳汁、初乳、或唾液)中产生期望抗体。例如，在体外将编码至少部分的人免疫球蛋白的遗传物质插入编码乳蛋白的哺乳动物基因，然后通过如注射将该基因导入哺乳动物受精卵，由此卵可能发育成产生乳汁的成年雌性哺乳动物，乳汁中包含至少部分由插入的人免疫球蛋白遗传物质衍生的免疫球蛋白。然后可以由乳汁收获期望抗体。本领域技术人员知道用于进行这些过程的适用技术。
[0373]通常采用上述转基因动物来产生单一同种型的人抗体，更具体的说是B细胞成熟必需的同种型，诸如IgM，可能还有IgD。用于产生人抗体的另一种优选方法是使用美国专利号 5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、和 5，770，429 (本文收入作为参考)中描述的技术，其中转基因动物据描述能够由B细胞发育需要的同种型转变成其它同种型。
[0374]在B淋巴细胞的发育过程中，细胞最初产生IgM，其结合特异性由有效重排的Vh和Vl区决定。随后，每个B细胞及其后代合成具有相同L和H链V区的抗体，但是它们可能转变H链的同种型。μ或δ恒定区的使用很大程度上是通过改变剪接决定的，使得IgM和IgD在单个细胞中共表达。其它重链同种型U、α、和ε)只在基因重排事件删除了 Cy和C5外显子后天然表达。这一基因重排过程，称为同种型转变，通常通过位于紧邻每个重链基因(除了 5)上游的所谓转变片段之间的重组而发生。各个转变片段的长度为2-10kb，主要由短重复序列组成。
[0375]由于这些原因，优选转基因在用来进行同种型转变的每个转变区上游大约l_2kb内掺入转录调控序列。这些转录调控序列优选包括启动子和增强子元件，更优选包括与转变区天然相连(即存在于种系结构中)的5’侧翼(即上游)区。虽然来自一个转变区的5’侧翼区可以可操作连接用于转基因构建的不同转变区，但是在一些实施方案中，优选转基因构建物中掺入的每个转变区具有在天然种系结构中紧接着上游的5’侧翼区。涉及免疫球蛋白转变区序列的序列信息是知道的(Mills等人，1990 ；Sideras等人，1989 ;本文收入作为参考)。
[0376]在美国专利号5，545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016、和5，770，429描述的方法中，转基因动物所含的人免疫球蛋白转基因在B细胞发育的整个途径中正确发挥功能，导致同种型转变。因此，在这种方法中，构建这些转基因来产生同种型转变和下列一项或多项:(I)高水平和细胞类型特异性表达，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的应答和激活，⑷足够大的初级库的表达，(5)信号转导，(6)体细胞超突变，和
(7)免疫应答过程中转基因抗体基因座的显性化。
[0377]对转基因功能的重要要求是产生的初级抗体库的多样性足以触发针对广泛抗原的再次免疫应答。重排的重链基因包含信号肽外显子、可变区外显子、和一列串联的多结构域恒定区(其中的每一个都由几个外显子编码)。每个恒定区基因编码不同种类免疫球蛋白的恒定部分。在B细胞发育过程中，删除了 V区近端恒定区，导致重链新类型的表达。对于每类重链，RNA剪接的不同模式产生跨膜的和分泌的免疫球蛋白二者。
[0378]人重链基因座包含大约200个V基因片段，跨越2Mb ;大约30个D基因片段，跨越大约40kb ;6个J片段，群集于大约3kb内；和9个恒定区基因片段，跨越大约300kb。整个基因座在14号染色体长臂远端部分跨越大约2.5Mb。包含所有6种已知Vh家族成员，D和J基因片段，以及μ、δ、^3、^1、和α I恒定区的重链转基因片段是知道的(Berman等人，1988 ;本文收入作为参考)。相似地构建了包含来自人轻链基因座的所有必需基因片段和调控序列的基因组片段。
[0379]成功重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因的表达常常通过在转基因非人动物中抑制内源免疫球蛋白基因的重排而具有显性效果。然而，在某些实施方案中，期望达到内源Ig基因座的完全灭活，使得不能通过例如转基因与内源Ig序列之间的转变而形成包含人可变区和非人(如鼠)恒定区的杂合免疫球蛋白链。使用胚胎干细胞技术和同源重组，可以容易的消除内源免疫球蛋白库。例外，可以使用多种技术(诸如反义技术)来实现内源Ig基因的抑制。
[0380]在本发明的其它方面,可能期望产生反式转变的(trans-switched)免疫球蛋白。包含这些嵌合的反式转变免疫球蛋白的抗体可用于期望具有非人(如鼠)恒定区的多种应用中，如用于在宿主中保留效应物功能。鼠恒定区的存在相对于人恒定区能够提供优势，例如提供鼠效应物功能(如ADCC、鼠补体固定)，从而能够在小鼠疾病模型中检验这种嵌合抗体。在动物检验后，可以通过如由来源(杂交瘤克隆)进行PCR扩增或cDNA克隆来分离人可变区编码序列，并剪接成编码期望的人恒定区的序列，编码更适合于人治疗性用途的人序列抗体。
[0381]E4.人源化抗体(humanized antibody)
[0382]人抗体用于人的治疗通常具有至少3个潜在优势。第一，因为效应物部分是人的，所以它与人免疫系统其它部分的相互作用可能更好，如通过依赖补体的细胞毒性(CDC)或依赖抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)更有效的破坏靶细胞。第二，人免疫系统不会将抗体识别成外来物质。第三，人体循环中的半衰期将与天然产生的人抗体相似，使得所需剂量较小，给药频率较低。
[0383]本文提供了用于制备人抗体的多种方法。除了人抗体，“人源化”抗体也具有许多优势。“人源化”抗体通常是来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或其它物种并包含人恒定区和/或可变区结构域或特定变化的嵌合或突变单克隆抗体。本领域技术人员众所周知用于产生所谓的“人源化”抗VEGF抗体的技术。
[0384]人源化抗体也享有上述优势。第一，效应物部分仍是人的。第二，人免疫系统不会将框架或恒定区识别成外来的，因此针对这种注射抗体的抗体应答应当比针对完全外来的小鼠抗体的低。第三，与注射的小鼠抗体相反，注射的人源化抗体的半衰期与天然产生的人抗体大概更相似，也使得所需剂量较小且频率较低。
[0385]已经描述了用于产生人源化抗体的大量方法。可以利用通过二硫键结合在一起的抗体结构域的受控重排，形成新的人造蛋白质分子或“嵌合”抗体(Konieczny等人，1981 ；本文收入作为参考)。重组DNA技术也可以用于构建编码小鼠抗体轻链和重链可变结构域与人抗体轻链和重链恒定结构域的DNA序列之间的融合基因(Morrison等人，1984 ;本文收入作为参考)。
[0386]可以通过分子方法将编码鼠单克隆抗体抗原结合部分或互补决定区(OTR)的DNA序列移植到编码人抗体重链和轻链框架的DNA序列中(Jones等，1986 ；Riechmann等人，1988 ;各自引入本文作为参考)。表达的重组产物称为“重塑(reshaped)”或人源化抗体，其包含人抗体轻链和重链的框架和鼠单克隆抗体的抗原识别部分CDR。
[0387]美国专利号5，639，641描述了用于产生人源化抗体的另一种方法，本文收入作为参考。这种方法经重新铺面(resurfacing)提供了因可变区展现人表面而具有改进的治疗功效的人源化啮齿类抗体。在这种方法中:(I)产生抗体重链和轻链可变区群的位置比对，给出一组重链和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的比对位置至少大约98%是相同的；(2)对啮齿类抗体(或其片段)确定一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(3)鉴定与该组啮齿类表面暴露氨基酸残基最近似相同的一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(4)用步骤(3)中鉴定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组替代步骤(2)中确定的重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基组，不作改变的是距啮齿类抗体互补决定区的任何残基的任何原子5人以内的那些氨基酸残基；和(5)产生具有结合特异性的人源化啮齿类抗体。
[0388]美国专利号5，693，762,5, 693，761,5, 585，089、和 5，530，101 描述了用于产生人源化抗体的类似方法，本文收入作为参考。这些方法涉及产生具有来自供者免疫球蛋白的一个或多个互补决定区(CDR)和可能的额外氨基酸以及来自人受者免疫球蛋白的框架区的人源化免疫球蛋白。每一条人源化免疫球蛋白链除了 CDR之外，通常还包含来自能够与该CDR相互作用而发挥结合亲和力的供者免疫球蛋白框架的氨基酸，诸如与免疫球蛋白供者内CDR紧邻或者据分子模拟预测相距大约3Λ以内的一个或多个氨基酸。重链和轻链都可以通过使用美国专利号5， 693，762,5, 693，761,5, 585，089、和5，530，101 (本文收入作为参考)描述的多种位置标准中的任一项、任意组合、或所有标准来进行设计。当组合形成完整抗体时，人源化免疫球蛋白在人中基本上没有免疫原性，并基本上保留与免疫球蛋白供者相同的针对原始抗原的亲和力。
[0389]美国专利号5，565，332和5，733，743描述了用于产生人源化抗体的另一种方法，本文收入作为参考。这种方法将人源化抗体的概念与也在本文详细描述的噬菌粒文库结合起来。一般地说，这种方法利用来自针对感兴趣抗原的抗体或抗体群的抗原结合位点的序列。由此，对于单一的啮齿类抗体，可以将包含抗体中部分抗原结合位点的序列与能够在组合时产生完整抗原结合位点的人抗体序列多样性文库联合起来。
[0390]由这一方法产生的抗原结合位点与由⑶R移植产生的不同，其中只有原始啮齿类抗体的部分序列有可能以相似方式接触抗原。选择的人序列有可能在序列和与抗原的接触方面与最初的结合位点不同。然而，由部分原始序列与抗原的结合和抗原及其抗原结合位点的形状造成的约束，有可能驱动人序列与抗原的相同区域或表位的新接触。这一过程因此称为“表位盖印选择” (epitope imprinted select1n, EIS)。
[0391]由动物抗体开始，一种方法可以选择出对部分人源抗体。这些抗体可能与人抗体在序列方面足够相似，可直接或在改变少数关键残基后用于治疗。可以通过各个残基的定点诱变或通过整个环的CDR移植来取代那些与人序列残基不同的残基，从而将选定抗体的啮齿类成分与人序列残基之间的序列差异降至最低。然而，也可以产生完全为人序列的抗体。EIS由此提供了用于产生可相应地与动物或部分人源抗体结合相同表位的部分人源或完全人源抗体的方法。在EIS中，可以将抗体片段库展示在丝状噬菌体表面，并通过噬菌体与抗原的结合来选择具有抗原结合活性的片段的编码基因。
[0392]美国专利号5，750，078、5，502，167、5，705，154、5，770，403、5，698，417、5，693，493,5, 558，864,4, 935，496、和4，816，567描述了在本发明中试图用于使抗体人源化的其它方法，本文收入作为参考。
[0393]E5.经 PCR? 的诱变
[0394]定点诱变是一种有用的技术，可通过其DNA的特异性诱变而用于制备各种抗体。通过将一个或多个核苷酸序列变化导入DNA，本技术还能够容易的用于制备并检验体现了一个或多个上述考虑的序列变体。
[0395]虽然有许多方法适用于诱变，但是目前通常优选使用聚合酶链反应(PCR?)。此技术提供了快速、有效的将期望突变导入给定DNA序列中的方法。下文具体描述了如何使用PCR?将点突变导入序列中，这可以用于改变由给定序列编码的氨基酸。此方法经改动也适于将限制性酶切位点导入DNA分子。
[0396]在此方法中，可将合成的寡核苷酸设计成能在扩增片段的一端掺入点突变。PCR?之后，通过用Klenow片段处理使扩增片段成为平端，然后连接平端化片段并亚克隆至载体中以便于序列分析。
[0397]为了制备期望诱变的模板DNA，可使用待突变区侧翼的限制性位点将DNA亚克隆至高拷贝数的载体，如PUC19中。然后使用质粒微量制备法制备模板DNA。使用自动合成仪合成适当的寡核苷酸引物，该引物基于亲本序列，但含有期望的点突变，其5’端侧翼是限制性酶位点。通常要求引物与模板DNA有大约15个碱基是同源的。可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化引物，但用于PCR?中时，并不绝对需要这么做。然后，应使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
[0398]应使用含有期望点突变的寡核苷酸引物，通过PCR?扩增模板DNA。扩增缓冲液中的MgCl2浓度通常为大约15mM。通常应如下进行大约20-25轮PCR?循环:95°C变性35秒；50°C杂交2分钟；72°C延伸2分钟。PCR?通常包括于72°C最后一次延伸循环约10分钟。在最后的延伸步骤之后，应在反应混合物中加入约5个单位的Klenow片段，于约30°C再保温15分钟。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成为平端并适于平端克隆。
[0399]通常通过非变性的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分析得到的反应混合物，以证实扩增已产生预定的产物。可通过除去大多数矿物油，用氯仿抽提以除去残留的油，用经缓冲的酚抽提，然后用100%乙醇沉淀浓缩来处理反应混合物。接着，用能够切割寡核苷酸侧翼序列的限制性酶消化大约一半的扩增片段。在低融点琼脂糖凝胶上纯化经消化的片段。
[0400]为了亚克隆片段和检查点突变，可通过平端连接将两种扩增片段亚克隆至经适当消化的载体中。然后用于转化大肠杆菌，随后使用微量制备法从中制备质粒DNA。通过DNA测序分析质粒DNA中的扩增部分以确认产生了正确的点突变。这一点至关重要，因为TaqDNA聚合酶会将额外的突变导入DNA片段。
[0401]使用依次PCR?步骤也可实现点突变的导入。在此程序中，使包含突变的两种片段互相退火，并通过相互引发的合成而延伸。然后通过第二个PCR?步骤扩增此片段，从而避免了上述方案中需要的平端连接。在此方法中，如上所述进行模板DNA的制备、寡核苷酸引物的产生、和第一次PCR?扩增。然而，在此方法中，选定的寡核苷酸与模板DNA应有大约15-大约20个碱基的一段序列是同源的，它们互相之间还必须重叠大约10个碱基或更多。
[0402]在第二次PCR?扩增中，可使用各个扩增片段和各个侧翼序列引物，并使用上述条件进行大约20-25轮PCR?循环。可使用上述步骤再次亚克隆片段并检查点突变是否正确。
[0403]在使用上述任一方法时，通常优选通过扩增尽可能小的片段来导入突变。当然，也应仔细考虑如寡核苷酸的解链温度这样的参数，该参数通常受寡核苷酸的GC含量和长度的影响。本领域技术人员众所周知这些方法的实施及其优化(必要时)，多种出版物进一步描述了有关内容，如《分子生物学现行方案》(Current Protocol in Molecular B1logy)(1995,本文收入作为参考)。
[0404]当进行定点诱变时，可以采用表A作为参考。
[0405]表A
[0406]
【权利要求】
1.纯化的抗体或其抗原结合片段、或该抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，其中所述抗体是保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4或嵌合抗体，所述嵌合抗体中保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4的抗原结合片段可操作性地附着了人抗体的恒定区。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体，所述嵌合抗体中保藏为ATCCPTA4545的单克隆抗体3G4的抗原结合片段可操作性地附着了人抗体的恒定区。
3.包含纯化的抗体或其抗原结合片段、或该抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物的组合物，其中所述抗体是保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4或嵌合抗体，所述嵌合抗体中保藏为ATCC PTA 4545的单克隆抗体3G4的抗原结合片段可操作性地附着了人抗体的恒定区。
4.权利要求3的组合物，其中所述抗体是双特异性抗体、重组抗体或基因工程化抗体或者其抗原结合片段。
5.权利要求3的组合物,其中所述抗体是scFv、Fv、Fab’、Fab二聚体、二体、线性抗体或抗体的F(ab’)2抗原结合片段，或者CDR、单价片段、骆驼源化或单一结构域抗体。
6.权利要求3的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体，所述嵌合抗体中保藏为ATCCPTA4545的单克隆抗体3G4的抗原结合片段可操作性地附着了人抗体的恒定区。
7.权利要求3-6中任一项的组合物，其中所述抗体可操作性地附着了生物学试剂、治疗剂或诊断剂。
8.权利要求7的组合物，其中所述抗体可操作性地附着了细胞毒素、化疗剂、放疗剂、抗血管发生剂、凋亡诱导 剂、类固醇、抗代谢物、抗微管蛋白药、考布司汀、抗生素、细胞因子、烷化剂或凝血剂。
9.权利要求7的组合物，其中所述抗体可操作性地附着了体内诊断剂，所述体内诊断剂是使用非侵入式成像可检测的。
10.权利要求9的组合物，其中所述抗体可操作性地附着了顺磁性的、X射线成像的或放射性的同位素。
11.权利要求9的组合物，其中所述抗体可操作性地附着了铟m、碘125、碘131、镓68、锝99m、或钆。
12.权利要求3-11中任一项的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。
13.权利要求3-11中任一项的组合物，其中所述组合物是气雾组合物。
14.权利要求3-11中任一项的组合物，其中所述组合物是脂质体或纳米颗粒组合物。
15.权利要求14的组合物，其中所述组合物是隐蔽的或PEG化的脂质体组合物，其上包被了所述抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物。
16.权利要求15的组合物，其中所述隐蔽的或PEG化的脂质体还包含额外的治疗剂。
17.权利要求3-16中任一项的组合物，其中所述组合物还包含额外的生物学试剂、治疗剂或诊断试剂。
18.权利要求17的组合物，其中所述额外的治疗剂是抗血管发生剂或抗癌剂。
19.权利要求18的组合物，其中所述额外的治疗剂是细胞毒素、化疗剂、放疗剂、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、凋亡诱导剂、类固醇、抗代谢物、叶酸类似物、抗微管蛋白药、拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、考布司汀、嘧啶类似物、抗生素、钼配位复合物、细胞因子、烷化剂或凝血剂。
20.权利要求18的组合物，其中所述额外的治疗剂是多西他赛、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、伊立替康、顺钼或碳钼。
21.可检测地标记的肽，其包含可操作性地附着了体内诊断剂的耐久霉素肽，所述体内诊断剂是使用非侵入式成像可检测的。
22.权利要求21的可检测地标记的肽，其中所述体内诊断剂是锝99m。
23.包含可检测地标记的肽的组合物，所述可检测地标记的肽包含可操作性地附着了体内诊断剂的耐久霉素肽，所述体内诊断剂是使用非侵入式成像可检测的。
24.权利要求23的组合物，其中所述体内诊断剂是使用核磁成像装置可检测的。
25.权利要求23的组合物，其中所述体内诊断剂是使用Y闪烁相机或检测仪可检测的。
26.权利要求23的组合物，其中所述体内诊断剂是顺磁性的、X射线成像的或放射性的同位素。
27.权利要求23的组合物，其中所述体内诊断剂是铟m、碘125、碘131、锝99m、钆或镓。
28.权利要求27的组合物，其中所述体内诊断剂是锝99m。
29.权利要求3-20中任一项的组合物，用于治疗中。
30.权利要求3-20中任一项的组合物，用于抑制血管发生。
31.权利要求3-20中任一项的组合物，用于治疗癌症。
32.权利要求3-20中任一项的组合物，用于与化疗或放疗联合治疗癌症。
33.权利要求3-6、9-11或23-28中任一项的组合物，用于成像或诊断。
34.权利要求3-20中任一项的组合物在制备用于通过抑制血管发生而治疗或预防疾病的药物中的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述药物可用于治疗或预防黄斑变性、关节炎、类风湿关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、甲状腺增生、格雷夫斯病、血管瘤、新生血管性青光眼、或牛皮癣。
36.权利要求3-20中任一项的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
37.权利要求3-20中任一项的组合物在制备可用于与化疗或放疗联合治疗癌症的药物中的用途。
38.权利要求9-11或23-28中任一项的组合物在制备用于成像或诊断与细胞表面存在的氨基磷脂相关联的疾病或病症的药物中的用途。
39.权利要求38的用途，其中所述药物包含权利要求9-11中任一项的组合物，所述组合物用于成像或诊断疾病或病症，在所述疾病或病症中，在疾病位点的细胞在细胞表面表达氨基磷脂、磷脂酰丝氨酸。
40.权利要求38的用途，其中所述药物包含权利要求23-28中任一项的组合物，所述组合物用于成像或诊断疾病或病症，在所述疾病或病症中，在疾病位点的细胞在细胞表面表达氨基磷脂、磷脂酰乙醇胺。
41.权利要求38的用途，其中所述疾病是癌症。
42.权利要求38的用途，其中所述疾病是病毒感染疾病。
43.权利要求38的用途，其中所述疾病是血栓症、肺栓塞、心肌梗死或动脉粥样硬化。
44.权利要求43的用途，其中所述疾病是心肌梗死。
【文档编号】A61P9/10GK104130327SQ201210153265
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2003年7月15日 优先权日:2002年7月15日
【发明者】P·E·索普, M·M·苏亚雷斯, 黄贤明, 何进, S·兰 申请人:得克萨斯大学体系董事会