专利名称：一种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明是涉及一种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料及其制备方法，属于纳米材料生物应用领域。
背景技术：
石墨烯是碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的一种炭质新材料，其厚度只有0. 335nm,是构建其他维数炭质材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。石墨烯自2004年被发现以来，已迅速成为材料科学和凝聚态物理领域最为活跃的研究前沿，而其在生物医学领域的研究是近两年才开始的，目前相关工作报道还比较少。
在生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，通常由石墨粉经化学氧化、超声分散而制得。由于其表面含有大量的含氧活性基团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等亲水性基团，因而具有良好的水溶液稳定性和生物相容性。同时，由于石墨烯具有单原子层结构，其比表面积很大，且两个基面都可以吸附药物，因此非常适合用作药物载体。
发明内容
本发明旨在提供一种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料及其制备方法，通过在氧化石墨烯上修饰透明质酸，一方面增强该材料在生物体内的生物相容性，另一方面有利于靶向体内恶性肿瘤细胞。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下—种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料，在单层氧化石墨烯表面上共价连接己二酸酰肼，利用己二酸酰肼上的氨基进一步偶联靶向分子透明质酸，所述单层氧化石墨烯的厚度为0. 5-2nm,所述氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料的平均尺寸为50_300nm。上述材料的制备方法包括以下步骤(I)按照氧化石墨烯EDC:NHS的质量比为0. 8-1. 2:5:15向氧化石墨烯的水溶液中分别加入EDC和NHS，然后调节溶液的pH至5. 5-5. 8 ；(2)按照氧化石墨烯己二酸酰肼(ADH)质量比为1:10-12向上述溶液中加入己二酸酰肼，常温下搅拌20-24h，洗涤并干燥；(3)按照透明质酸EDC:NHS的质量比为1.5-2.5:5:15向透明质酸溶液中分别加A EDC和NHS,然后调节溶液的pH至5. 5-5. 8 ；(4)加入I. 5-3倍质量的步骤(2)所得干燥物质，常温下搅拌20-24h，洗涤并干燥。步骤(I)中的氧化石墨烯的水溶液的浓度为l_2mg/mL。步骤(3)中的透明质酸溶液的浓度为l_2mg/mL。所述石墨氧化烯的制备方法包括以下步骤
(I)将天然石墨粉与氯化钠按照1:25-1:30的质量比混合研磨20-30min，用水溶解，过滤并干燥；(2)将步骤(I)所得石墨粉按照0. 06-0. lg/mL的固液比加入浓硫酸(96%_98%)中，同时加入与石墨粉质量比为0. 25-0. 5 1的硝酸钠置于6-10° C下搅拌30-40min，加入与石墨粉质量比为I. 5-2 1的高锰酸钾，在10-15°C下继续搅拌8-10h，然后继续在35-40°C搅拌 30-40min，在 65-80°C搅拌 45_50min，在 98_105°C搅拌 30_40min ；(3)加入反应液2-3倍体积去离子水，搅拌30-40min，然后加入反应液2_3倍体积质量浓度2. 5-3%的过氧化氢溶液，搅拌30-40min，停止反应，将反应液超声振动2_2. 5h，本步骤反应维持温度均在98-105°C ；(4)用5%盐酸溶液洗涤离心反应液3-5次，再用去离子水离心洗涤使上层清液为中性，干燥。
本发明所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料的制备原理是先在单层氧化石墨烯(NGO)上面共价连接己二酸酰肼(ADH)，然后把透明质酸(HA)和己二酸酰肼(ADH)偶联在一起，通过间接的方法修饰到单层氧化石墨烯的表面。与现有技术相比，本发明的有益效果在于氧化石墨烯为单层结构，厚度在
0.5-2nm,尺寸在50_300nm,更加有利于生物应用；制得的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料中，透明质酸共价修饰到氧化石墨烯表面，具有一定的靶向性；并且，修饰后的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，有利于材料的生物应用，所得功能化纳米材料有望用作药物传输载体。
图I为实施例I所制备的氧化石墨烯的透射电镜(TEM)2为实施例I所制备的氧化石墨烯的原子力显微镜(AFM)图。图3为实施例I所制备的氧化石墨烯的XRD谱图。图4为实施例2制备的氧化石墨烯/己二酸酰肼和氧化石墨烯/透明质酸的紫外吸收图谱。图5为实施例2制备的氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸的Raman谱图。图6为实施例3制备的氧化石墨烯/透明质酸在不同阿霉素浓度下的载药百分比。图7为实施例3所制备的氧化石墨烯/透明质酸在不同pH值下的药物释放情况。图8为实施例4制备的氧化石墨烯/透明质酸在不同喜树碱浓度下的载药百分比。图9为实施例4所制备的氧化石墨烯/透明质酸在不同pH值下的药物释放情况。图10 (a)和(b)分别为氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸对HeLa细胞的MTT毒性实验数据。图11 (a)和(b)分别为氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸对MCF-7细胞的MTT毒性实验数据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明实施例I(I)将2克天然 石墨粉，60克氯化钠，两者混合在一起充分的研磨，研磨30min之后，用水溶解并抽滤；(2)将上述滤纸上抽滤的物质干燥之后放入装有23mL浓硫酸的100毫升圆底烧瓶中，同时加入0. 5克硝酸钠置于6°C的冰水浴中磁力搅拌，搅拌30min之后，缓慢加入3. 0克高锰酸钾，在10°C水浴中继续搅拌8h ；(3)维持上述反应(2)在35°C搅拌30min，在65°C搅拌45min，在98°C搅拌30min ；(4)经过步骤(3)之后，加入46mL去离子水，继续搅拌30min，然后加入200mL质量浓度3%的H2O2水溶液；搅拌30min之后使反应停止；然后将反应液在超声机中超声2h ；(5)用5%盐酸溶液离心洗涤反应液5次，再用去离子水离心洗涤使上层清液为中性，将样品真空干燥24h，得到单层氧化石墨烯。透射电镜(TEM)图见图I ;由TEM图可见氧化石墨烯均匀分散在水溶液体系中，平均尺寸为180nm。原子力显微镜(AFM)图见图2，由AFM图可见其中的一个氧化石墨烯纳米粒子的厚度为0. 98nm，尺寸为265nm，符合我们制备的纳米级别，有利于生物应用。X射线粉末衍射(XRD)图谱见图3，由XRD图可见在11. 4°和42°分别出现了氧化石墨烯的特征吸收峰，对应于001和100晶面。实施例2(I)取50mg实施例I制得的干燥的氧化石墨烯，按照lmg/mL的浓度分散在水溶液中；按照氧化石墨烯EDC:NHS质量比为1:5:15的比例分别加入EDC和NHS ；(2)加入 lmg/mL 的 NaOH 调节溶液的 pH=5. 76 ；(3)加入520mg的己二酸酰肼(ADH)，在常温条件下搅拌24h ；(4)用去离子水离心洗涤数次，冷冻干燥24h，得氧化石墨烯/己二酸酰肼(GO-ADH)；(5)称取15mg透明质酸，溶解在15mL去离子水中；(6)按照透明质酸EDC:NHS质量比为2:5:15的比例分别加入EDC、NHS ；(7)用 lmg/mL 的 NaOH 调节溶液的 pH=5. 6 ；(8)加入30mg步骤(4)中冷冻干燥的样品，在常温条件下搅拌24h ；(9)用去离子水离心洗涤数次，冷冻干燥24h，得氧化石墨烯/透明质酸(GO-HA)。所制备的氧化石墨烯/透明质酸(GO-HA)和氧化石墨烯/己二酸酰肼(GO-ADH)的紫外吸收见图4，由图可见通过Fmoc-Cl法分别对氧化石墨烯/己二酸酰肼和氧化石墨烯/透明质酸的氨基密度进行定量检测，使用300nm处紫外的不同吸收值，根据Fmoc-Cl标准工作曲线分别计算相应的氨基密度为5. 86X 10_5mOl/g、3. 4X 10_5mOl/g ；氧化石墨烯(GO)和氧化石墨烯/透明质酸(GO-HA)的拉曼光谱见图5，由图可见氧化石墨烯在1350CHT1和1580CHT1分别出现D峰和G峰，并且两个峰值的比值越小，说明材料排列越有序，并且在2679CHT1出现2D，说明是单层氧化石墨烯；当氧化石墨烯修饰透明质酸之后，材料的厚度以及表面结构发生了变化，导致2D峰消失，进而弥补了 GO的表面缺陷，使得D峰/G峰比值减小。
实施例3(I)配制不同浓度的D0X，溶剂是DMS0，浓度分别是40、60、100、200、300、1000、1500、2000 u g mL 1 ；
(2)分别称取5mg的G0-HA加入IOmL上述溶液中；(3)放置到摇床中200转/min，37°C条件下转动20h ；(4)然后分别再用3mL的水洗涤3次，最后用DMSO定容到25mL ；(5)对8个不同浓度的上层清夜测量紫外吸光度，分别计算出载药量，结果如图6所示。由图可见，当阿霉素的浓度大于等于IOOOil g mL-1的时候，氧化石墨烯的载药量达到饱和状态，约为300mg/g ；图7为本实施例中的氧化石墨烯/透明质酸在不同pH值下的药物释放情况，在测试之前，溶液用PBS稀释了 12. 5倍。(a):和氧化石墨烯/透明质酸相互作用前后阿霉素(DOX)的紫外可见光谱；(b) 37° C时，载有DOX的氧化石墨烯/透明质酸在不同pH(7. 4，6.3,5. 2)条件下DOX释放图。由图可见，装载药物的杂化材料的药物释放是pH响应的，能达到可控和缓释的作用。在pH为7. 4和6. 3时，DOX能比较稳定的附着在氧化石墨烯表面，经过72小时之后，于相应的pH值的PBS缓冲溶液中，仅分别有3. 8%和4. 3%的药物释放。然而在pH为5. 2时，25小时之后就有22. 5%的DOX释放出来，这种pH依赖的药物释放性质在药物运输应用上是非常重要和有用的。这些结果也表明该药物传输系统在正常的生理条件下具有微小量的药物释放，其在抵达和进入癌细胞之前对正常组织的副作用很小，这对于GO-HA在实际生物应用中具有重要意义。实施例4
(I)配制不同浓度的CPT，溶剂是DMS0，浓度分是5、10、20、40、60、90、
120 Ug* mir1 ； (2)分别称取5mg的G0-HA加入IOmL上述溶液中；(3)放置到摇床中200转/min，37°C条件下转动20h ；(4)然后分别再用3mL的水洗涤3次，最后用DMSO定容到25mL ；(5)对7个不同浓度的上层清液测量紫外吸光度，分别计算出载药量，结果如图8所示。由图可见，当喜树碱的浓度大于等于80 Ug ^mL-1的时候，喜树碱的载药率达到最大，约为15% ；图9为本实施例所制备的氧化石墨烯/透明质酸在不同pH值下的药物释放情况，在测试之前，溶液用DMF稀释了 12. 5倍。(a):和氧化石墨烯/透明质酸相互作用前后喜树碱(CPT)的紫外可见光谱；(b) 37° C时，载有CPT的氧化石墨烯/透明质酸在不同PH(6. 3,5. 2)条件下DOX释放图。由图可见，喜树碱作为一种疏水性药物，其释放速率明显小于阿霉素。这对于其在实际生物应用中将具有十分重要的意义，因为载药材料在到达和进入癌细胞之前对正常的组织器官具有极小的副作用。一旦担载药物的材料被癌细胞摄取，疏水的药物分子就会在细胞内的疏水部位被释放出来而杀死肿瘤细胞。图10为氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸的MTT实验数据，(a)和(b)为氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸在HeLa细胞孵育一段时间的毒性研究结果；由图可见，当氧化石墨烯/透明质酸和HeLa细胞共同孵育24小时后，细胞的存活率在材料的浓度高达200ug. mL-1时仍然超过80%。并且，在相同的样品浓度下，12和24小时孵育时间所得的HeLa细胞存活率没有出现很大差异。这些数据表明，氧化石墨烯/透明质酸在一个较宽的浓度范围内没有毒性。图11 (a)和(b)为氧化石墨烯和氧化石墨烯/透明质酸在MCF-7细胞孵育一段时间的毒性研究结果。由图可见，当氧化石墨烯/透明质酸和MCF-7细胞共同孵育24小时后，细胞的存活率在材料的浓度高达200 Ug ^mL-1时仍然超过80%。这些数据显示，材料可以安全的应用于生物领域。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范
围。权利要求
1.一种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料，其特征在于，在单层氧化石墨烯表面上共价连接己二酸酰肼，利用己二酸酰肼上的氨基进一步偶联靶向分子透明质酸，所述单层氧化石墨烯的厚度为O. 5-2nm，所述氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料的平均尺寸为50-300nm。
2.权利要求I所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)按照氧化石墨烯EDC:NHS的质量比为O.8-1. 2:5:15向氧化石墨烯的水溶液中分别加入EDC和NHS，然后调节溶液的pH至5. 5-5. 8 ； (2)按照氧化石墨烯己二酸酰肼质量比为1:10-12向上述溶液中加入己二酸酰肼，常温下搅拌20-24h，洗涤并干燥； (3)按照透明质酸EDC:NHS的质量比为I.5-2. 5:5:15向透明质酸溶液中分别加入EDC和NHS，然后调节溶液的pH至5. 5-5. 8 ； (4)加入I.5-3倍质量的步骤(2)所得干燥物质，常温下搅拌20-24h，洗涤并干燥。
3.权利要求I所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(O中的氧化石墨烯的水溶液的浓度为l_2mg/mL。
4.权利要求I所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的透明质酸溶液的浓度为l_2mg/mL。
5.权利要求2、3或4所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料的制备方法，其特征在于，所述石墨氧化烯的制备方法包括以下步骤 (1)将天然石墨粉与氯化钠按照1:25-1:30的质量比混合研磨20-30min,用水溶解,过滤并干燥； (2)将步骤(I)所得石墨粉按照O.06-0. l_g/mL的固液比加入浓硫酸中，同时加入与石墨粉质量比为O. 25-0. 5 1的硝酸钠置于6-10° C下搅拌30_40min，加入与石墨粉质量比为I. 5-2 1的高锰酸钾，在10-15°C下继续搅拌8-10h，然后继续在35-40°C搅拌30-40min，在 65-80°C搅拌 45-50min,在 98-105°C搅拌 30_40min ； (3)加入反应液2-3倍体积去离子水，搅拌30-40min，然后加入反应液2_3倍体积质量浓度2. 5-3%的过氧化氢溶液，搅拌30-40min，停止反应，将反应液超声振动2_2. 5h，本步骤反应维持温度均在98-105°C ； (4)用5%盐酸溶液洗涤离心反应液3-5次，再用去离子水离心洗涤使上层清液为中性，干燥。
6.权利要求I所述的氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料用于靶向药物传输。
全文摘要
本发明公开了一种氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料，其特征在于，在单层氧化石墨烯表面上共价连接己二酸酰肼，利用己二酸酰肼上的氨基进一步偶联靶向分子透明质酸，所述单层氧化石墨烯的厚度为0.5-2nm，所述氧化石墨烯/透明质酸纳米药物载体材料的平均尺寸为50-300nm。本发明制得的氧化石墨烯/透明质酸纳米材料中，透明质酸共价修饰到氧化石墨烯表面，具有良好的靶向性；并且，修饰后的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，有利于材料的生物应用，所得功能化纳米材料有望用作药物传输载体。
文档编号A61K47/04GK102727901SQ20121024054
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者吴惠霞, 曾波, 杨仕平, 王亚培 申请人:上海师范大学