专利名称：类叶升麻苷在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及类叶升麻苷多靶点防治阿尔茨海默病的用途，属医药领域范畴。
背景技术：
阿尔茨海默病是一种原发性灰质脑病。其特点是大脑皮层萎缩，并伴有神经原纤维缠结及老年斑，病程呈进行性发展，最后导致痴呆，但病因不清。脑血管性痴呆则与脑溢血、脑血栓、脑动脉硬化等有关，目前，临床所用药物虽然能改善脑溢血或脑栓塞等带来的一些症状，但对改善记忆或智力障碍均无效。根据联合国估计，10年后老年人将达5. 9亿，2025年增至11亿。AD不仅是老年人群的最大健康杀手，还已成为现代社会老年人的主要致死疾病之一，严重威胁人类晚年精神健康和生活质量，给社会、家庭带来沉重的负担和压力，已引起社会普遍关注，成为不可忽视的社会公共卫生难题。因此针对老年痴呆的治疗药物的研究有着重要的医学和社会学意义。 目前阿尔茨海默病的发病机制尚未十分清楚，主要有3种假说0-淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说和神经血管假说。此外，还有一些其他相关学说，如胆碱能学说、基因突变学说、神经细胞凋亡学说、免疫异常学说、氧化应激学说、炎性反应学说等，但每种学说都不能圆满的诠释所有AD的病理现象。总言之，阿尔茨海默病的发病机制异常复杂，涉及多条分子信号通路，包括AP、Tau蛋白及突触异常等，各机制之间相互联系，共同促使神经元变性。迄今已有的治疗方法皆针对某一靶点，临床疗效有限。类叶升麻苷为苯乙醇苷类的代表性成分，具有调节免疫、抗炎、抑制肿瘤生长、抗病毒和抗菌等广泛的药理学活性，类叶升麻苷也是多种药用植物的活性成分之一，因而受到了国内外学者的普遍关注，其多靶点的作用及作用机制的探讨已成为近年来研究的热点课题。目前，研究发现类叶升麻苷具有抗老年痴呆的潜能，如抗凋亡、抑制细胞迁移、减缓老化、抗氧化、抗动脉粥样硬化、促进神经功能的恢复，改善记忆、抑制弹性蛋白酶活力和血小板聚集，抑制内皮素的增加等。迄今为止，未见有类叶升麻苷多靶点治疗阿尔茨海默病用途的相关报道。本发明针对阿尔茨海默病多发病机理的特点，对类叶升麻苷进行多靶点作用的相关研究，最终证实类叶升麻苷具有多靶点防治阿尔茨海默病的用途。
发明内容
本发明目的在于提供类叶升麻苷在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，其中类叶升麻苷通过合成或从植物中制备得到的。通过试验表明采用相关药理学试验进行类叶升麻苷治疗阿尔茨海默病的药效学评价，分别从改善中枢胆碱能神经系统、调节谷氨酸水平、抑制3淀粉样蛋白(A3)形成和沉积、神经保护、抑制tau蛋白异常磷酸化、抗氧化、改善脑循环或者降低胆固醇方面，阐明类叶升麻苷多途径、多靶点治疗阿尔茨海默病的用途。本发明所述的一种类叶升麻苷在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，该类叶升麻苷是通过多靶点作用防治阿尔茨海默病。
所述的类叶升麻苷的来源是从植物中制备得到或通过人工合成途径得到。其中从植物中制备得到类叶升麻苷，是采用有机试剂提取、大孔树脂或者柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化或者制备色谱制备或者重结晶等方法从含有类叶升麻苷的植物中获得的。通过人工合成途径是采用廉价、易得、低毒性、低污染的原料，经过酯化反应、官能团间的转换等方法合成得到。本发明所述的类叶升麻苷防治阿尔茨海默病，是通过改善中枢胆碱能神经系统、调节谷氨酸水平、抑制3淀粉样蛋白(A3)形成和沉积、神经保护作用、抑制tau蛋白异常磷酸化、抗氧化作用、改善脑循环以及降低胆固醇等途径，从而实现多靶点防治阿尔茨海默病。其中所述的药物为口服液、粉剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。本发明所述的类叶升麻苷的结构式为
HOOH HOO
\_ U hsZ / \=y
1OH
//HO 0 HO OH类叶升麻苷是指以干品重量计算类叶升麻苷含量在90-99. 9%。本发明所述的类叶升麻苷防治阿尔茨海默病的用途，通过试验表明类叶升麻苷能够改善中枢胆碱能神经系统、调节谷氨酸水平、抑制3淀粉样蛋白(A3)形成和沉积、神经保护作用、抑制tau蛋白异常磷酸化、抗氧化作用、改善脑循环和降低胆固醇作用，从而达到多途径多靶点治疗阿尔茨海默病的目的。
图I为本发明各组动物脑组织海马区镜下观察图(XlO)图。图2为本发明各组动物脑组织海马区镜下观察图(X40)图。图3为本发明类叶升麻苷对OA所致SK-N-SH细胞形态学的影响图，其中I为OA模型组，2 为 5 ii g mL—1, 3 为 10 ii g mL—1,4 为 20 ii g mL—1, 5 为空白对照组。图4为本发明类叶升麻苷对OA致神经细胞骨架蛋白磷酸化的保护作用图。
具体实施例方式以下具体实施例对本发明作进一步的说明，而不是限制本发明，不应将此理解为本发明上述主题的应用范围仅限于以下的实施例。实施例本发明所述的一种类叶升麻苷在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，该类叶升麻苷是通过多途径、多靶点作用，具体实验为类叶升麻苷对APP695V717I转基因小鼠模型作用实验方法取同月龄同背景C57BL/6J小鼠为正常对照组，同月龄APP转基因阴性小鼠作为阴性对照组，4月龄APP695V717I转基因小鼠分为模型组和用药组，持续饲养6个月至10月龄；采用Morris水迷宫和物体识别实验对小鼠空间学习记忆能力的行为学进行研究。采用放射免疫法、免疫组化法、免疫印迹法检测海马和皮层突触素、突触后致密物质-95、a-突触核蛋白(a-syn，AD病人脑内老年斑另一核心成分)的表达，用透射电镜观察海马神经4突起内线粒体、细胞骨架蛋白、突触数目及突触内囊泡超微结构变化，免疫荧光双标法检测皮层及海马神经元a-syn分别与A3、泛素(Ub)及淀粉样纤维共同定位，parkin蛋白分别与及a -syn于泛素ude共同定位。实验结果4月龄APP转基因小鼠在Morris水迷宫实验中的潜伏期明显延长；海马CAl区神经元突起内超微结构和突触结构基本正常，但突起内线粒体结构轻度肿胀并伴有部分内嵴和外膜断裂，突触连接减少，突触数密度有降低趋势，突触囊泡明显减少 ’海马 和皮层的突触素和突触后致密物质-95(PSD-95)表达有降低趋势；4月龄转基因小鼠大脑海马与皮层a-syn表达已明显增加；10月龄APP转基因小鼠在Morris水迷宫实验中潜伏期和游泳距离均明显延长；物体识别实验中分辨指数也明显下降；海马CAl区突起内线粒体肿胀、嵴断裂甚至空泡化，突触数量减少，突触前后膜及突触间隙结构模糊不清，突触后致密物质变薄，神经毡内多数突触小泡减少甚至消失；皮层和海马CAl区、CA3区及齿状回的突触素表达明显降低，皮层和海马PSD-95蛋白表达明显减少；10月龄转基因小鼠大脑海马与皮层中a-syn表达明显增加；免疫荧光双标结果显示，10月龄转基因小鼠海马与皮层顶叶神经元内ct-syn、泛素分别与淀粉样纤维存在共同定位；parkin分别与a-syn及泛素存在共同定位，提示a-syn经由泛素-蛋白酶体途径(UPP)降解异常，发生聚集，参与淀粉样斑块形成。不同剂量的类叶升麻苷灌胃给药6个月可明显缩短10月龄APP转基因小鼠Morris水迷宫的潜伏期和游泳距离；提高其在物体识别实验中的分辨指数，减轻模型小鼠神经元突触损伤，使模型小鼠海马CAl区神经毡突起内线粒体轮廓清晰，嵴多而明显，突触连接丰富，结构基本正常，突触前后膜及突触间隙结构清晰，突触后致密物增厚，囊泡数量增加；增加APP转基因模型小鼠皮层及海马突触素和PSD-95蛋白的表达。类叶升麻苷能抑制10月龄APP转基因小鼠皮层及海马中a-syn蛋白过表达和聚集。类叶升麻苷使a-syn降解的主要途径-泛素-蛋白酶体途径中的关键成分泛素、parkin、UCH-Ll、HSP70的表达都有所提高，提示类叶升麻苷通过促进a-syn降解以发挥神经保护作用。对线粒体呼吸链复合体IV抑制剂叠氮钠拟AD细胞模型作用实验方法培养贴壁SH-SY5Y细胞用0. 25%胰酶消化，细胞计数后以每孔I X IO6个/ml加到细胞板上，培养过夜，待铺成单层后吸除原培养基，分别设空白对照、正常对照、阳性对照及加入不同浓度供试品孔与SH-SY5Y细胞预孵育24h后，弃去培养液，加入5OmmoI I/1叠氮钠损伤4h,测定各项指标。实验结果采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定法测定线粒体膜电位的影响，结果叠氮钠与培养的SH-SY5Y细胞共孵育后，细胞线粒体细胞色素C氧化酶活性下降，细胞存活率下降，且呈时间及剂量依赖性，细胞线粒体跨膜电位的荧光强度值下降，尤其是细胞突起降低最为显著。给予不同剂量的类叶升麻苷后，损伤情况得到了显著的改善。
类叶升麻苷对活性氧过氧化氢(H2O2)致神经细胞损伤模型影响实验方法采用MEM培养基，在5% CO2, 37 °C的孵箱中培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，将SYSY细胞以密度为IX IO5 -mr1接种于培养瓶中，待细胞生长至90%时，制成2X105 -mr1的细胞悬液，更换无血清培养基，接种于培养皿中，分组(空白对照组、正常对照组、阳性对照组和给药组)，给药组细胞加入不同浓度的供试品孵育24h后，吸去培养基，PBS洗I次，加入H2O2 (500 u mo I L—1)损伤18h，弃去培养基，制成单细胞悬浮液，进行后续测试。实验结果采用酶标仪和流式细胞仪进行检测供试品对细胞内SOD活性及细胞内R0S、NO和GSH含量的影响，结果浓度为10、20、40mg kg—1的类叶升麻苷使活性氧的释放分别降低了 40% (P < 0. 05) ,32% (P < 0.01)和 25% (P < 0. 05), NO 的释放分别降低了29% (P < 0.01),37% (P < 0. 05)和51% (P < 0. 01)，同时不同剂量的类叶升麻苷有明显抑制GSH降低的作用，表明类叶升麻苷能够抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤， 有神经保护作用。采用Western-blot方法通过检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax的表达水平，结果类叶升麻苷三个剂量组与模型组相比较，caspase-3的含量分别减少了30% (P < 0. 01) ,89% (P < 0. 01)和 95% (P < 0. 01)，caspase-9 的含量分别减少了 77%(P < 0. 01) ,101% (P < 0. 01)和 85% (P < 0. 01)，Bcl-2 分别增加了 76% (P < 0. 01)、117% (P < 0.01)和94% (P < 0.01)，对Bax没有影响，表明类叶升麻苷可能通过抗氧化作用抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡，从而起到保护神经的作用。类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用实验方法将昆明种小鼠适应性饲养一周后，经小鼠跳台测试去掉不符合条件的小鼠，其中包括先天愚笨的和特别聪明的，然后对经过行为学实验筛选合格的72只小鼠，采用PEMS 3. I医用统计软件，以体重为指标，随机分为6组，每组各12只，给药组口服给予剂量分别为30、60、120mg kg—1的类叶升麻苷以及石杉碱甲片，空白对照组、模型组给予等量的生理盐水，在进行小鼠行为学实验之前，除空白对照组外，其余各组小鼠均分别腹腔注射东莨菪碱3mg kg'腹腔注射体积为0. ImL (IOg)'空白对照组腹腔注射等容量生理盐水。15min后按实验安排进行小鼠跳台试验以及水迷宫试验。实验结果模型组小鼠逃避潜伏期明显低于空白对照组(P < 0.01)，石杉碱甲片阳性对照组可延长小鼠逃避潜伏期(P < 0. 05)，类叶升麻苷低、中、高剂量组均可显著延长小鼠逃避潜伏期(P<0.01);此外类叶升麻苷低、中、高剂量组均能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的跳台错误次数降低(P < 0. 01)。提示东莨菪碱破坏了小鼠被动回避学习记忆能力，而类叶升麻苷可以翻转东莨菪碱对小鼠被动回避学习记忆能力的损伤。表I类叶升麻苷对小鼠跳台成绩的影响(&士S，n = 12)
权利要求
1.一种类叶升麻苷在制备防治阿尔茨海默病药物中的用途，其特征在于类叶升麻苷是通过多靶点作用防治阿尔茨海默病。
全文摘要
本发明涉及类叶升麻苷在制备治疗阿尔茨海默病药物中的用途，该类叶升麻苷是通过多靶点作用防治阿尔茨海默病。所述的类叶升麻苷通过人工合成或从植物中得到。通过体内外实验证实类叶升麻苷能够改善改善中枢胆碱能神经系统、调节谷氨酸水平、抑制β淀粉样蛋白(Aβ)形成和沉积、神经保护作用、抑制tau蛋白异常磷酸化、抗氧化作用、改善脑循环以及降低胆固醇等途径，从而实现多靶点防治阿尔茨海默病。
文档编号A61K31/7032GK102755341SQ201210240638
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者彭晓明, 闫明, 霍仕霞, 高莉, 黄毅 申请人:闫明