专利名称：一种细胞外基质支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，涉及一种细胞外基质支架材料及其制备方法，具体涉及一种基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料及其制备方法。
背景技术：
关节软骨是无血管、淋巴及神经支配的特殊组织。关节软骨本身自我修复能力非常有限，一旦受损伤直径大于3mm将无法自行修复。目前治疗软骨缺损的主要方法有关节镜下灌洗术、关节清理术、软骨下骨钻孔术(subchondralbone drilling)、微骨折术(microfracture)、自体或异体骨软骨移植术(auto or alio osteochondral
transplantation)、自体软骨细胞移植术(autologous chondrocyte implantation, ACI)及人工关节置换术。上述方法各有手术适应症及优、缺点，并非尽善人意。近年来，随着组织工程学相关研究的突飞猛进，给软骨再生技术带来了希望。组织工程学的研究涉及种子细胞、生物可降解材料和组织构建三个方面的内容。其中，成功的关键是理想的可降解生物材料的制备。作为种子细胞的理想支架一般认为应具有以下特性良好的生物相容性和生物降解性、三维多孔立体结构、可塑性和一定的机械强度、良好的细胞界面和消毒性能。目前，根据材料的来源将生物材料支架可分为人工合成的高分子聚合物和天然生物材料两大类。高分子聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)及PGA/PLA共聚物(PLGA)等；天然生物材料包括胶原(Collagen)、纤维蛋白(Fibrin)、明胶(Gelatin)、糖氨聚糖(GAG)、海藻盐酸(Alginate)等。尽管这些生物材料在实验室及动物实验中观察到了良好的软骨再生能力，但因生物毒性、降解速度及机械强度等诸多不足未能应用到临床。有时甚至还需行复杂表面修饰，以便给种子细胞提供一个良好的人工细胞外基质环境。鉴于此，许多学者致力于以天然的细胞外基质(ECM)作为载体的研究，如小肠粘膜下层(small intestinal submucosa, SIS)、人类羊膜(human amniotic membrane, HAM)、异体脱细胞膀胱粘膜下层、异种(猪)软骨细胞分泌的细胞外基质(ECM)等。细胞外基质(ECM)支架较上述的天然或人工合成的生物材料支架具有以下优点1、细胞外基质(ECM)支架主
要成分为功能性和结构性蛋白-胶原纤维(collagen)、蛋白多糖(proteoglycans)、糖氨
聚糖(GAGs)，它们可有机的结合成超微结构供组织构建；2、细胞外基质(ECM)表面的三肽RGD，及富含硫酸软骨素、硫酸肝素的蛋白聚糖(如多配体蛋白聚糖)和CD44，在细胞黏附方面也有重要的作用；3、它还含有多种生长因子，如TGF-P、bFGF、VEGF等，特别是TGF-@和bFGF分别在促进干细胞的软骨细胞分化和促进细胞分泌细胞外基质(ECM)方面起着非常重要的作用；4、具有良好的天然的生物降解性能；5、可通过整合蛋白诱导细胞变形，进而促进细胞的生长及分化。目前，这些细胞外基质(ECM)支架已广泛应用于皮肤创面修复、输尿管重建、消化管及硬脑膜修复中。近年来也有collagen支架与自体软骨细胞移植术和PGA支架与微骨折骨髓刺激术相结合来再生软骨的报道。上述异体组织来源或异种细胞来源细胞外基质(ECM)支架有很多优点，但仍然不能完全消除免疫排斥反应和疾病传播的风险。为了解决上述问题，这些细胞外基质(ECM)支架的制备都必须要经过复杂的脱细胞过程。脱细胞过程中所使用的蛋白质变性剂和助溶剂SDS，不但会使正常组织结构发生断裂、氨基蛋白糖丢失和胶原破坏，且丢失大量生长因子(可高达39 72%)，进而降低了细胞外基质(ECM)支架的生物学功能。本发明涉及的是骨髓间充质干细胞来源的三维多孔状细胞外基质(ECM)支架，不仅能消除免疫排斥反应和疾病传播的风险，还能提供种子细胞(软骨细胞或干细胞)黏附、增殖及软骨化分化所需的微环境，是日后骨科临床进而探索出一种简易而有效的软骨缺损修复的新技术，为今后临床应用提供必要的理论依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种细胞外基质支架材料。本发明的另一目的是提供该细胞外基质支架材料的制备方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料，该细胞外基质支架是通过如下方法获得的(I)全骨髓培养法原代培养幼兔骨髓间充质干细胞取2-3周龄幼兔双股骨和/或胫骨，消毒后置装有无菌生理盐水的培养皿中，在无菌条件下开放股骨和/或胫骨两端骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，8001200转/分速度离心8 10分钟，弃上清液，骨髓间充质干细胞沉淀用DMEM培养基混悬，并计数，以I X IO8细胞密度将骨髓间充质干细胞接种于直径为150mm培养皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培养液20ml，置二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，6 8天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期为30 40天；(2)收集细胞外基质，并冷冻干燥弃步骤(I)培养皿中的培养液，将皿底膜状或胶冻状的细胞外基质收集至装有含IOmM EDC和IOmM NHS的交联液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小时后先用5mM Na2HPO4洗2飞遍，每次20 30分钟，再用双蒸水漂洗2飞次，每次20^30分钟，然后120(Tl800转/分速度离心8 15分钟，收集沉淀物经冷冻干燥得到基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。其中，所述的经冻干得到的细胞外基质支架材料根据软骨缺损区或体外实验所需修剪成合适的大小和形状，经环氧乙烷灭菌得到整体分装包。步骤(2)所述的冷冻干燥是将所述的沉淀物放入_80°C的深低温冰箱或液氮罐内冷冻成型，冷冻至少24小时后，即可将得到的细胞外基质固体物置冷冻干燥机的托盘上；冷冻干燥机需事先启动I 1.5小时预冻达到-65°C，然后将细胞外基质固体物在-55 _75°C、真空度I IOKPa条件下，经冷冻干燥处理24 48小时得到白色或银白色或象牙色的三维多孔状基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。所述的基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料的制备方法，包含如下步骤(I)全骨髓培养法原代培养幼兔骨髓间充质干细胞取幼兔双股骨和/或胫骨，消毒后置装有无菌生理盐水的培养皿中，在无菌条件下开放股骨和/或胫骨两端骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，800^1200转/分速度离心8 10分钟，弃上清液，骨髓间充质干细胞沉淀用DMEM培养基混悬，并计数，以I X IO8细胞密度将骨髓间充质干细胞接种于150mm培养皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培养液20ml，置二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，61天后进行第一次换液，之后每2 3天换液一次，整个培养周期为30 40天；(2)收集细胞外基质，并冷冻干燥弃步骤(I)培养皿中的培养液，将皿底膜状或胶冻状的细胞外基质收集至装有含IOmM EDC和IOmM NHS的交联液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小时后先用5mM Na2HPO4洗2飞遍，每次20 30分钟，再用双蒸水漂洗2飞次，每次20^30分钟，然后120(Tl800转/分速度离心8 15分钟，收集沉淀物经冷冻干燥得到基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。其中，经冻干得到的细胞外基质支架材料根据软骨缺损区或体外实验所需修剪成合适的大小和形状，经环氧乙烷灭菌得到整体分装包，可保持使用前呈无菌状态以备体内外实验研究使用，且无损它的理化特性及空间结构。所述的步骤(2)所述的冷冻干燥是将所述的沉淀物放入_80°C的深低温冰箱或液氮罐内冷冻成型，冷冻至少24小时后，即可将得到的细胞外基质固体物置冷冻干燥机的托盘；冷冻干燥机需事先启动I I. 5小时预冻达到_60°C，然后将细胞外基质固体物在-55 _70°C、真空度I IOKPa条件下，经冷冻干燥处理24 48小时得到白色或银白色或象牙色的三维多孔状基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。本发明所述的幼兔双股骨和胫骨取自兔宰杀场，优选在宰杀后I小时内分离得到的双股骨和胫骨。本发明基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料的物化指标本发明基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料为三维多孔状支架材料，孔隙大小为100-400 u m,孔隙率不低于90%，机械强度不低于3. OKPa,极高的组织相容性，细胞接种率 不低于55%，种子细胞存活率在95%以上，含胶原、蛋白多糖，及TGF-P I等生长因子。有益效果本发明细胞外基质支架材料以干细胞作为细胞外基质支架的材料来源，它不仅组织来源广、增殖能力强、自体即可获得充足的细胞量，避免了胚胎干细胞所牵涉的社会伦理学的问题，而且克服了现国内外使用异体组织来源或异种细胞来源细胞外基质(ECM)支架所带来的弊端免疫排斥反应和疾病传播的风险，同时还能提供种子细胞(软骨细胞或干细胞)黏附、增殖及软骨化分化所需的微环境，是一种有临床发展远期前景的生物支架材料。本发明所涉及的骨髓间充质干细胞外基质支架的制备过程，无论是干细胞单层高密度的体外培养，还是真空冷冻干燥处理，或是环氧乙烷灭菌，都是比较简洁易行的，对设备没有过高要求。本发明细胞外基质支架材料经环氧乙烷灭菌得到整体分装包，可保持使用前呈无菌状态以备体内外实验研究使用，且无损它的理化特性及空间结构。
图I骨髓间充质干细胞外基质支架制备的流程示意图。图2骨髓间充质干细胞外基质支架的大体观图。图3骨髓间充质干细胞外基质支架的扫描电镜下微观图。
图4骨髓间充质干细胞外基质支架病理切片HE染色倒置显微镜下一般形态结构图。图5软骨细胞接种干细胞外基质支架不同时间点的大体观。图6软骨细胞接种干细胞外基质支架不同时间点的组织化学染色观察。
具体实施例方式实施例I(一)骨髓间充质干细胞外基质支架制备的流程示意图见图1，具体方法如下(I)全骨髓培养法原代培养幼兔骨髓间充质干细胞取屠宰场刚宰杀的新鲜3周 龄幼兔，分离得到左右双股骨和胫骨，置于冰袋内运回实验室进行以下操作对股骨和胫骨行碘伏浸泡消毒，置装有无菌生理盐水的培养皿中。超净台内，开放股骨、胫骨两端骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白为止。收集骨髓冲洗液，1000转/分速度离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀用DMEM基培混悬，并计数。以I X IO8细胞密度将细胞接种于直径为150mm培养皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培养液20ml，置二氧化碳培养箱内于37 °C、5%C02、饱和湿度条件下进行单层高密度培养培养。约7天后进行第一次换液，之后换液频率为2天换液一次。整个培养周期约需培养30天。(2)收集细胞外基质，并冷冻干燥弃皿中培养液，用细胞刮勺将皿底膜状或胶冻状的细胞外基质，收集至装有含IOmM EDC和IOmM NHS的交联液的棕色玻璃容器中，浸泡24小时后先用5mMNa2HP04洗3遍，每次30分钟；后再用双蒸水漂洗3次，每次30分钟。1500转/分速度离心10分钟，收集沉淀物置合适盛具内，立即放入-80°C的深低温冰箱冷冻成型得到细胞外基质固体物。冷冻至少24小时后，即可将细胞外基质固体物置冷冻干燥机的托盘上；冷冻干燥机需事先启动I小时预冻达到-65'60°C，然后将细胞外基质固体物在温度-65 _75°C、真空度l_5KPa条件下，经冷冻干燥处理36小时，最终得到白色或银白色或象牙色的三维多孔状支架材料。(3)环氧乙烷灭菌处理并得到符合国家有关质量标准的整体分装包该材料可以根据软骨缺损区或体外实验所需，任意修剪成合适的大小和形状，可经环氧乙烷灭菌得到整体分装包，可保持使用前呈无菌状态以备体内外实验研究使用，且无损它的理化特性及空间结构。(二)所制备的干细胞外基质支架材料的外观图如图2所示，其扫描电镜下微观图如图3所示，显微镜不同放大倍数下(40、100和400倍)HE染色结果如图4所示。其物化指标三维多孔状支架材料的空隙大小为100 400 u m,孔隙率为91. 5%±2. 84%，机械强度为3. 8±0. 6KPa，极高的组织相容性，细胞接种率约为56%，种子细胞存活率为95. 4%，含胶原、蛋白多糖，及TGF-Pl等生长因子。软骨细胞接种干细胞外基质支架不同时间点的大体观见图5，软骨细胞接种干细胞外基质支架不同时间点的组织化学染色观察见图6。以下为干细胞外基质支架材料的各物化指标的检测方法(I)取实施例I中制备的骨髓间充质干细胞外基质支架，按如下方法对病理切片HE染色I)取材与固定支架块切取至0.6X0. 6X0. 6cm大小为宜，快速投入10%甲醛固定液中，固定24小时；之后流水冲洗10分钟，以洗去固定液；
2)脱水70%酒精0. 5小时；80%酒精0. 5小时；90%酒精0. 5小时;100%酒精(I)0. 5小时；100%酒精(11)0. 5小时；3)透明二甲苯(1)0. 5小时；二甲苯(11)0. 5小时；4)浸蜡将支架块放入熔化的石蜡中，75 °C温箱过夜；5)包埋在BMJ-B型包埋机上将支架块用石蜡包埋于包埋盒中(原则上一个支架块包埋于一个包埋盒中);包埋机的工作条件工作台温度为60°C，储镊块温度为64°C，蜡嘴温度为70°C ;包埋完毕的包埋块立即置于病理组织包埋冷冻台上冷却(-25 -15°C);6)切片包埋块冷却后立即在Leica石蜡切片机上切片，切片厚度为2_3iim ;切取下来的支架切片置病理组织漂烘仪的48度水中，用镊子轻轻将其贴于干净的粘附载玻
片上，之后置恒温展片台上烘干；染色前置65°C 20分钟以暖片；7)常规苏木精-伊红(HE )染色脱去石蜡二甲苯(I) 5分钟；二甲苯(II) 5分钟；二甲苯(III) 5分钟；水化(使细胞膨胀):100%酒精(I)3分钟；100%酒精(II)3分钟；90%酒精3分钟；80%酒精3分钟；70%酒精3分钟；流水冲洗10分钟；染细胞核苏木精染色5分钟；流水冲洗15分钟；分化1%盐酸酒精3 5秒；返蓝流水冲洗10 15分钟；染细胞质伊红5分钟；脱水70%酒精3分钟；80%酒精3分钟；95%酒精3分钟；100%酒精(I) 3分钟；100%酒精(II) 3分钟；透明二甲苯(I) 5分钟；二甲苯(II) 5分钟；二甲苯(III) 5分钟；封片用中性树胶封固支架切片。8)显微镜不同放大倍数下(40、100和400倍)观察记录支架切片HE染色的实验结果，见图4。(2)取本实施例中制备的干细胞外基质支架材料按照如下方法检测孔隙率、机械强度I)孔隙率采用Nettles DL文献所报道的压汞法测定支架孔隙率。测定支架体积后抽真空，将汞充至多孔支架周围，再从外部对汞加压，记录压力和加压过程中进入孔中汞的体积，孔隙率即为进入孔中汞的体积/多孔材料的体积。计算得本实施例干细胞外基质支架材料的孔隙率的实验结果为91. 5%±2. 84% ；2)机械强度的检测方法和结果支架块制备成直径为6mm、高度为6mm大小的圆柱体，用型号为model5943的Instron电子动静态万能材料试验机测试抗压性能,压缩速度为0. lmm/min。干细胞外基质支架材料机械强度的实验结果为3. 8±0. 6Kpa。(3)取本实施例中制备的干细胞外基质支架材料按如下方法检测细胞接种率I)支架块制备成直径为6mm、高度为3mm大小的圆柱体，事先用含10%胎牛血清的DMEM培养液浸泡I小时以上，浸泡时注意用镊子将支架内的气体尽可能地挤出；2)用0. 25%胰蛋白酶消化已传至P2或P3的软骨细胞，计数并制备所需要的细胞悬液量Wl ;接种的细胞量每毫升不低于5 X IO6个。
3)采取动态细胞接种法每个I. 5ml离心管内加入Iml培养液及I个支架，置台式振荡器上以50次/min的频率孵育I. 5小时；4)结束后取出支架置12孔皿内，每孔加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，置二氧化碳培养箱内于37°C、5%C02、饱和湿度条件下培养；同时计数I. 5ml离心管内剩余的软骨细胞数为W2，支架细胞接种率为=(W1-W2)/W1X 100%。干细胞外基质支架材料的细胞接种率约为56%。5)24小时后将支架取出，置换到新的6孔皿内继续同上条件下培养，2天换液一次，到实验所需时间后取出行支架上接种的种子细胞存活率的检测。(4)取本实施例制备的干细胞基质支架材料按如下方法检测接种的种子细胞存活率I)取种子细胞接种培养3天后的支架，去除培养液，用HBSS液冲洗3次，注意将培 养液冲洗干净，以免影响实验结果。2)取事先配备好的 SYTO 10 green fluorescent nucleic acid stain 和 DEADRed nucleic acid stain,每个支架标本加入500 ii I染液,室温、避光条件下孵育15分钟。3)吸去染色液，用HBSS液冲洗3次。后用4%戊二醛固定30 60分钟，HBSS液冲洗3次。4)在荧光显微镜下观察视野下的红染细胞(R)和蓝染细胞数(B)，红染细胞即为死亡细胞，蓝染细胞即为存活细胞。每个视野的种子细胞存活率=B/ (R+B)X100%，随意取5个不同视野，计算种子细胞存活率的均数。实验结果干细胞外基质支架材料接种的种子细胞的存活率为95. 4%。(5)取本实施例制备的干细胞外基质支架材料按如下方法测定胶原含量I)称取20mg支架，用剪刀细细剪碎后置1.5ml Eppendorf管，再加入I I. 5ml木瓜蛋白酶溶液，在65°C水浴中24小时，12000g离心，取上清液待检。2)羟脯氨酸标准品及支架标本经步骤I消化后的上清液分别与4NNaOH和去离子水按照表I和表2相混合，终体积为50 yl。表I
权利要求
1.一种基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料，其特征在于该细胞外基质支架是通过如下方法获得的 (1)全骨髓培养法原代培养幼兔骨髓间充质干细胞取2-3周龄幼兔股骨和/或胫骨，消毒后置装有无菌生理盐水的培养皿中，在无菌条件下开放股骨和/或胫骨两端骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓冲 洗液，800 1200转/分速度离心8 10分钟，弃上清液，骨髓间充质干细胞沉淀用DMEM基培混悬，并计数，以I X IO8细胞密度将骨髓间充质干细胞接种于直径为150mm培养皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培养液20ml，置二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，6 8天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期为30 40天； (2)收集细胞外基质，并冷冻干燥弃步骤(I)培养皿中的培养液，将皿底膜状或胶冻状的细胞外基质收集至装有含IOmM EDC和IOmM NHS的交联液的棕色玻璃容器中，浸泡20^25小时后先用5mMNa2HP04洗2飞遍，每次20 30分钟，再用双蒸水漂洗2飞次，每次20^30分钟，然后120(Tl800转/分速度离心8 15分钟，收集沉淀物经冷冻干燥得到基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。
2.根据权利要求I所述的细胞外基质支架材料，其特征在于经冻干得到的细胞外基质支架材料根据软骨缺损区或体外实验所需修剪成合适的大小和形状，经环氧乙烷灭菌得到整体分装包。
3.根据权利要求I所述的细胞外基质支架材料，其特征在于步骤(2)所述的冷冻干燥是将所述的沉淀物放入-80°C的深低温冰箱或液氮罐内冷冻成型，将得到的细胞外基质固体物置冷冻干燥机的托盘上；冷冻干燥机需事先启动I I. 5小时预冻达到-65飞(TC，然后将细胞外基质固体物在温度-55 _75°C、真空度I IOKPa条件下，经冷冻干燥处理24 48小时得到白色或银白色或象牙色的三维多孔状基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。
4.权利要求I所述的基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料的制备方法，其特征在于包含如下步骤 (1)全骨髓培养法原代培养幼兔骨髓间充质干细胞取2-3周龄幼兔股骨和/或胫骨，消毒后置装有无菌生理盐水的培养皿中，在无菌条件下开放股骨和/或胫骨两端骨髓腔，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，800 1200转/分速度离心8 10分钟，弃上清液，骨髓间充质干细胞沉淀用DMEM基培混悬，并计数，以I X IO8细胞密度将骨髓间充质干细胞接种于直径为150mm培养皿，每皿加含10%胎牛血清的DMEM培养液20ml，置二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，6 8天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期为30 40天； (2)收集细胞外基质，并冷冻干燥弃步骤(I)培养皿中的培养液，将皿底膜状或胶冻状的细胞外基质收集至装有含IOmM EDC和IOmM NHS的交联液的棕色玻璃容器中，浸泡20 25小时后先用5mM Na2HPO4洗2飞遍，每次20 30分钟，再用双蒸水漂洗2飞次，每次20^30分钟，然后120(Tl800转/分速度离心8 15分钟，收集沉淀物经冷冻干燥得到基于骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于经冻干得到的细胞外基质支架材料根据软骨缺损区或体外实验所需修剪成合适的大小和形状，经环氧乙烷灭菌得到整体分装包。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的冷冻干燥是将所述的沉淀物放入_80°C的深低温冰箱或液氮罐内冷冻成型，将得到的细胞外基质固体物置冷冻干燥机的托盘上；冷冻干燥机需事先启动I I. 5小时预冻达到_60°C，然后将细胞外基质固体物在-55 _70°C、真空度I IOKPa条件下，经冷冻干燥处理24 48小时，得到白色或银白色或象牙色的三维多孔状基于骨髓间充质干细 胞来源 的细胞外基质支架材料。
全文摘要
本发明属于生物材料领域，公开了一种细胞外基质支架材料及其制备方法。本发明细胞外基质支架材料是通过体外单层高密度培养幼兔骨髓间充质干细胞，收集其分泌的细胞外基质,应用冻干技术及合适的交联剂将其制备成具有一定孔径和孔隙率的三维多孔状支架材料。该材料可以根据软骨缺损区或体外实验所需，任意修剪成合适的大小和形状，经环氧乙烷灭菌得到整体分装包。本发明细胞外基质支架材料以干细胞作为细胞外基质支架的材料来源，组织来源广、增殖能力强、自体即可获得充足的细胞量，避免了胚胎干细胞所牵涉的社会伦理学的问题。
文档编号A61L27/36GK102743790SQ201210240648
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者唐成, 徐燕, 王黎明, 金成哲 申请人:唐成, 徐燕, 王黎明, 金成哲