专利名称：一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼类精巢生物反应器的制备方法，还涉及一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用蛋白质、工业酶、疫苗和抗体中的应用。
背景技术：
转基因生物反应器是指将外源基因转入细胞或动植物、微生物，利用细胞增殖或生物体代谢制备外源基因的表达产物，主要包括转基因微生物生物反应器、转基因动物生物反应器和转基因植物生物反应器三大类。转基因微生物生物反应器生产的产物一般不具备生物活性，须经过后续的糖基化、羟基化等一系列修饰加工，工艺繁琐，耗时费力。转基因动植物生物反应器的产物具有 天然的生物活性，产品无需后加工过程，受到研究者们的青睐和社会各界的关注。就转基因动物生物反应器而言，最令人瞩目的是转基因动物乳腺生物反应器。利用乳腺反应器生产的重组人抗凝血酶III是第一个获准上市的动物生物反应器蛋白药物(GTC Bio-therapeutics. Inc. http://www. transgenics. com/pressre_leases/pr060206·html);转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器生产的重组蛋白已进入临床III期试验；数百种重组蛋白处于研发阶段。由于转基因动物乳腺生物反应器的主体是哺乳动物，有限的卵细胞数量和胚胎的体内发育使得转基因操作极其困难，加上扩群速度缓慢，产品难以实现快速规模化生产。鱼类转基因技术成熟，受精和胚胎发育过程在体外进行，易于转基因操作和筛选目的基因高表达的个体，以建立多途高效生物反应器平台；红鲤怀卵量大，性成熟的雌鱼每尾可产卵5万颗以上，具有扩群速度快的特点；红鲤生长快，雄性个体在南方地区一年即可性成熟，精液平均产量10_20ml/尾/次，总蛋白含量为3. 04mg/ml ;在人工控制环境下，红鲤可多季节，甚至常年生产精液，按每亩水面养殖1000尾雄鱼，每半个月生产一批次精液，平均每尾产精液IOml计算，年产精液可高达240，OOOml0鱼类精巢生物反应器具有研制快捷、规模化迅速的特点，适合生产中低需求量的蛋白质产品，应对瞬息万变的市场需求。鱼类精巢生物反应器将成为生物反应器家族中一个重要的成员。禽流感(Avian influenza, Al),又称真性鸡痕,是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性、高度致死性传染病。禽流感根据病原体表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分成若干亚型，目前已经发现15种血凝素亚型(Hl H15)和有9种神经氨酸酶亚型(NI N9), H 5N1属于高致病性的一种亚型。高致病性禽流感病毒不仅可感染家禽，而且能突破种属屏障，感染人类，禽流感被国际兽医局定为A类传染病，我国将其列为一类动物疫病，禽流感的预防和控制是关乎禽类养殖业发展和人类健康的重大课题。目前，用于预防和控制病毒性流行病的疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗的生产存在安全隐患，可能对环境和生产人员健康构成威胁；减毒活疫苗研发困难，且存在毒力恢复、形成新流感毒株的潜在的风险。传统亚单位疫苗从病毒粒子中分离获得，虽安全性得到保障，但生化制备工艺复杂、成本高昂，难以推广应用。随着基因克隆、DNA重组和转基因技术的发展，利用真核表达系统生产廉价的目标蛋白成为可能，藉此生产的亚单位疫苗同时具备良好的免疫原性和高度的安全性，是目前该领域研究的热点。本发明利用红鲤精巢作为生物反应器，制备禽流感病毒H5N1表面抗原一血凝素蛋白，建立一个H5N1亚单位疫苗的生产平台
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法，方法易行，操作简便。鲤鱼精巢生物反应器是一种以转基红鲤为宿主动物、红鲤精巢为产物特异表达组织的生物反应器，该生物反应器具有研制快捷、规模化迅速的特点，适合生产中低需求量的蛋白质产品，可应对瞬息万变的市场需求。本发明的另一个目的是在于提供了一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用蛋白质、工业酶、疫苗和抗体中的应用，通过将两个鱼类精巢特异高效表达启动子分别与目的蛋白基因进行重组，通过显微注射方法，将重组基因导入红鲤受精卵，使其在基因组中稳定整合，从而在精液中获得目的蛋白，可实现对目的蛋白的规模化生产。为实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种鲤鱼精巢生物反应器，通过以下步骤制备得到I)、筛选精液中高表达基因的启动子对斑马鱼的精液蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，割取电泳条带进行质谱检测，获得六个在斑马鱼精液中特异表达的基因；提取斑马鱼精巢总RNA，RT-PCR筛选出六个基因中表达量最高的两个基因，基因库序列号为BC122153和BC076027 ;与斑马鱼基因组数据库比较，获得这两个基因的启动子序列，命名为Q2，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示；2)、重组载体的构建通过重叠PCR方法，构建分别由Q2和Q3驱动的目的蛋白基因基因表达载体；3)、转基因鱼的制备采用显微注射法(Zhu，et al. 1985)，将两个重组基因片段分别导入红鲤受精卵中，常规方法孵化、养殖(可参考http: //baike. baidu. com/view/3868648, htm 中的内容)；4)、阳性转基因鱼的筛选采集性成熟转基因红鲤精液，提取基因组DNA，采用常规PCR方法，检测筛选转植基因阳性个体；5)、高表达阳性转基因鱼的筛选采用ELISA方法，检测转基因红鲤精液中目的蛋白含量，选择高效表达个体作为父本，繁殖扩群，获得反应器群体。一种鲤鱼精巢生物反应器在制备禽流感病毒血凝素H5N1-HA (药用蛋白质或抗体或工业酶)中的应用，其步骤是I)、筛选精液中高表达基因的启动子对斑马鱼的精液蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，割取电泳条带进行质谱检测，获得六个在斑马鱼精液中特异表达的基因；提取斑马鱼精巢总RNA，RT-PCR筛选出六个基因中表达量最高的两个基因，基因库序列号为BC122153和BC076027 ;与斑马鱼基因组数据库比较，获得这两个基因的启动子序列，命名为Q2，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示；2)、重组载体的构建采用重叠PCR方法，构建分别由Q2和Q3驱动的H5N1-HA基因的重组表达载体，分别命名为PQ2-HA (图2)和pQ3-HA (图3)。其中，Q2、Q3启动子DNA片段根据步骤I)中克隆获得的序列，从斑马鱼基因组中PCR扩增获得，H5N1-HA基因DNA片段根据GenBank中的序列资料(序列号EF624256)生化合成获得(由上海生工生物工程公司合成);3)、转基因鱼的制备采用显微注射法(Zhu，et al. 1985)，将两个重组基因片段分别导入红鲤受精卵中，常规方法孵化、养殖；4)、阳性转基因鱼的筛选采集性成熟转基因红鲤精液，提取基因组DNA，采用常规PCR方法，检测筛选转植基因阳性个体；5)、高表达阳性转基因鱼的筛选及蛋白检测采用ELISA方法，检测转基因红鲤精液中目的蛋白含量，选择高效表达个体作为父本，繁殖扩群，获得反应器群体，H5N1-HA高表达于红鲤精液中。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果 I、研制简便鱼类的受精和胚胎发育过程在体外完成，易于进行转基因操作和大规模筛选，进而获得目的基因高效表达的转基因个体；2、扩群迅速鱼类怀卵量大，性成熟红鲤怀卵量高达50，000颗/尾，能迅速形成大规模转基因鱼群体；3、持续高效红鲤生长快，雄性个体在南方地区一年即可性成熟，精液平均产量10-20ml/尾/次，总蛋白含量为3. 04mg/ml ;在人工控制条件下，红鲤可常年产生精液。鱼类精巢生物反应器可持续高效生产目的基因蛋白。
图I为一种斑马鱼精液中特异表达的六个基因RT-PCR产物电泳图。“M” 为分子量 Marker I”、“2”、“3”、“4”、“5” 和 “6” 泳道分别是 ΝΜ_001002099,NM_212788、BC122153、NM_001003646、BC076027 和 NM_001080035 基因的 RT-PCR扩增产物。图2为一种表达载体pQ2-HA示意图。长度8682bp ;抗性氨节。图3为一种表达载体pQ3-HA示意图。长度8759bp ;抗性氨苄。图4为一种转H5N1-HA基因红鲤阳性鱼PCR检测电泳图。“M”为分子量DL2000Marker ;箭头所示为PCR扩增条带。图5为一种使用Curve Expertl. 3绘制出的ELISA标准曲线。
具体实施例方式实施例I :一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法，通过以下步骤制备得到I)、筛选精液中高表达基因的启动子对斑马鱼的精液蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，割取电泳条带进行质谱检测，获得六个在斑马鱼精液中特异表达的基因；提取斑马鱼精巢总RNA，RT-PCR筛选出六个基因中表达量最高的两个基因，基因库序列号为BC122153(SEQ ID NO. I)和BC076027(SEQ ID NO. 3);与斑马鱼基因组数据库比较，获得这两个基因的启动子序列，命名为Q2，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示；2)、重组载体的构建通过重叠PCR方法，构建分别由Q2和Q3驱动的目的蛋白基因基因表达载体；3)、转基因鱼的制备采用显微注射法(Zhu，et al. 1985)，将两个重组基因片段分别导入红鲤受精卵中，常规方法孵化、养殖；4)、阳性转基因鱼的筛选采集性成熟转基因红鲤精液，提取基因组DNA，采用常规PCR方法，检测筛选转植基因阳性个体；5)、高表达阳性转基因鱼的筛选采用ELISA方法，检测转基因红鲤精液中目的蛋白含量，选择高效表达个体作为父本，繁殖扩群，获得反应器群体。
实施例2 —种鱼类精巢生物反应器在制备H5N1-HA中的应用，其步骤是A.精巢特异闻效表达基因启动子的筛选，其步骤是首先对斑马鱼的精液蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，割取电泳条带进行质谱检测，生物信息学分析质谱检测结果，获得六个在斑马鱼精液中特异表达的基因(表I);然后提取斑马鱼精巢总RNA，反转录获得cDNA。RT-PCR验证(RT-PCR引物见表2)以上六个基因在精巢中的表达(图I);最后挑选表达量最高的二个基因，序列号分别为BC122153，其核苷酸序列为SEQID NO. I所示，和BC076027，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示，与斑马鱼基因组数据库比较，获得这二个基因的启动子序列，分别命名为Q2 (其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示)和Q3 (其核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示)。表I斑马鱼精液中特异表达的六个基因的基本信息
权利要求
1.一种鲤鱼精巢生物反应器，由以下步骤制备得到 1)、筛选斑马鱼精液中高表达基因的启动子对斑马鱼的精液蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，割取电泳条带进行质谱检测，获得六个在斑马鱼精液中特异表达的基因；提取斑马鱼精巢总RNA，RT-PCR筛选出六个基因中表达量最高的两个基因，基因库序列号为BC122153和BC076027 ;与斑马鱼基因组数据库比较，获得这两个基因的启动子序列，命名为Q2和Q3 ； 2)、重组基因表达载体的构建通过重叠PCR方法，构建分别由Q2和Q3驱动的目的蛋白基因表达载体； 3)、转基因鱼的制备采用显微注射法，将两个重组基因片段分别导入红鲤受精卵中，常规方法孵化、养殖； 4)、阳性转基因鱼的筛选采集性成熟转基因红鲤精液，提取基因组DNA，采用常规PCR方法，检测筛选转植基因阳性个体； 5)、高表达阳性转基因鱼的筛选采用ELISA方法，检测转基因红鲤精液中目的蛋白含量，选择高效表达个体作为父本，繁殖扩群，获得反应器群体。
2.根据权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器，其特征在于所述的目的蛋白为禽流感病毒血凝素。
3.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器，其特征在于所述的Q2启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
4.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器，其特征在于所述的Q3启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示。
5.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用蛋白质中的应用。
6.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用工业酶中的应用。
7.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用疫苗中的应用。
8.权利要求I所述的一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法及应用，一种鲤鱼精巢生物反应器，其制备步骤为A.筛选在精液中高表达基因的启动子;B.构建在鱼类精巢中特异表达的目的基因表达载体；C.将重组基因片段导入红鲤受精卵，使其在基因组中稳定整合；D.目的基因在转基因红鲤精巢中高效表达，获得一种高效表达目的基因的生物反应器。利用鱼类精巢基因特异表达的属性，可构建安全高效、可持续利用的生物反应器；同时鱼类具有扩群速度快和养殖成本低的特点，可实现生物反应器的规模化、低成本运行。
文档编号A61K39/00GK102796763SQ201210282430
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者阮慧云, 李良明 申请人:武汉达邦生物科技有限公司