治疗糖尿病的植物萃取物及其制备方法
【专利摘要】本发明系关于一种用于治疗糖尿病的植物萃取物及其制备方法。该植物萃取物系来自煮饭花（Mirabilis?jalapa?L.）的根部，具降低血糖、增加胰岛素敏感度、以及增加骨骼肌肝醣含量之功效。
【专利说明】治疗糖尿病的植物萃取物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明系关于ー种治疗糖尿病的煮饭花(Mirabilis jalapa L.)根部萃取物。【背景技术】
[0002]糖尿病是ー种胰脏分泌胰岛素的功能有缺陷或产生之胰岛素效力不足所造成的慢性疾病。这样的缺陷导致血液中的葡萄糖浓度增加，因而导致许多组织或器官的损害，特别是血管及神经。
[0003]糖尿病有两种型式，称为第I型糖尿病及第II型糖尿病。第I型糖尿病,又称胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM)。IDDM 病患具有膜脏beta细胞的缺陷，导致无法正常分泌胰岛素，且有致命危险。通常好发于幼年或青少年期间，故又称为幼年型糖尿病，但近年来亦渐渐发现成年型病患。第I型糖尿病病患终其一生必须藉由注射投与胰岛素，以维持生命。第II型糖尿病，又称非胰岛素依赖型糖尿病(non-1nsulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM),具家族性，亦与环境因子有密切关联性。健康饮食、运动及避免体重过重可避免疾病的发生及恶化。在精致饮食的风潮下，食用过多的油脂果糖为第二型糖尿病的罹病原因之一。第II型糖尿病病患需要服用药物，以达理想的血糖控制，亦有部分病患须施予胰岛素，以降低血糖含量。
[0004]糖尿病会衍生许多严重并发症，例如，视网膜病变、神经损害、脚痛、静脉曲张与肿胀、血液循环失调、行走困难、肝功能失调、高胆固醇症、蛋白尿、高血脂症、摄护腺肿大、高血压等。妥善地控制血糖含量可有效控制病情及降低并发症的产生。
[0005]目前用于治疗糖尿病的药物包括磺酰尿素类、美格耐德类(meglitinides)、双胍类、噻唑烷二酮类，以及a-糖苷酶抑制剂，然而其具有许多限制，例如，副作用和高比例的继发性药物失效(secondary failure)。因此,越来越多病患倾向于自各种药用植物中寻找新颖之天然的抗糖尿病药物。
[0006]煮饭花(Mirabilis jalapa L.)，属紫茉莉科植物，正式名称为紫茉莉，又名草茉莉、夜娇娇、夜晚花、胭脂花、洗澡花、地雷花、白粉花、晚妆花、草茉莉、入地老鼠、粉团花、野茉莉、粉豆花、素香等。煮饭花为多年生草本植物，主枝直立，侧枝散生伏地，节部膨大，节部并显粉红色，株高可达I米左右。叶形为卵状三角形，对生，翠绿，内有浅色叶脉；花朵状似喇叭，花瓣五裂，花径2至3厘米，长4至5厘米，大多为大红或紫色，亦有白、粉、黄及复色等；果实坚硬，呈黑色，外形酷似地雷，故亦称「地雷花」。煮饭花于传统中药上已被广泛用于治疗痢疾利尿、腹泻、腹绞痛；其根部萃取物亦可治便秘、泌尿系统病变、急性关节炎等疾病。根据植物化学成分分析，已知煮饭花根包含生物碱、苷类、醣类及植物酉学 %= (C.1.B.Walker, G.Trevisan, M.F.Rossato et al., “Antinociceptive activityof Mirabilis jalapa in mice, ^ Journal of Ethnopharmacology,vol.120, n0.2, pp.169-175，2008.)。但尚无文献针对煮饭花根之萃取物提出明确的实验数据说明其治疗糖尿病之功效及针对分离其有效萃取物区分的制备方法。
【发明内容】
[0007]有别于相关习知技艺，本发明系关于ー种治疗糖尿病的煮饭花(Mirabilisjalapa L.)根萃取物，该萃取物之特征在于以醇类溶液自煮饭花根之水粗萃物分离出醇类不溶物或再进ー步以水纯化该醇类不溶物而得，其与习知之煮饭花萃取物不同，可有效用于预防或治疗糖尿病。
[0008]因此，本发明一方面提供一种治疗糖尿病之组合物，其系包含煮饭花(Mirabilisjalapa)根之醇类不溶性萃取物，该萃取物之特征在于其HPLC分析图于滞留时间为4.27及5.36分钟具有吸收峰，其中HPLC分析条件如下:仪器:日立L-7100 HPLC帮浦(HitachiL-7100 HPLC Pump);注射体积:50 y I ;分析管柱:Shodex OHpak SB-804HQ, 10 u m,8X300mm ;排阻极限(exclusion limit):1,000,000 ;管柱温控器:Eldex CH-150, 30°C ;流动相:水r流速:lml/min ;以及蒸发光散色查看器=Sedere Sedex 75 ELSD，45°C，3.0巴。
[0009]根据本发明之具体实施例，该醇类不溶性萃取物系由包括下列步骤之方法所制得:将煮饭花根或干燥之煮饭花根，经水萃取得粗萃物；再以醇类溶液自该粗萃物中分离出ー醇类不溶性萃取物。具体而言，该方法包括:
[0010](i)以水加热煮饭花根或干燥之煮饭花根，并将其过滤而形成第一滤液；
[0011](ii)浓缩步骤(i)所述第一滤液以获得ー浓缩滤液，并与醇类溶液混合形成一混合液；及
[0012](iii)过滤步骤(ii)所述混合液以获得第二滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根之醇类不溶性萃取物。
[0013]另ー方面，本发明提供一种治疗糖尿病之组合物，其系包含煮饭花根之水不溶性萃取物，该萃取物之特征在于其HPLC分析图于滞留时间为4.85及5.58分钟具有吸收峰，其中HPLC分析条件如下:仪器:日立L-7100HPLC帮浦(Hitachi L-7100 HPLC Pump);注射体积:50iil ;分析管柱:Shodex OHpak SB-804HQ, 10 u m, 8 X 300mm ;排阻极限(exclusionlimit):1, 000, 000 ;管柱温控器:Eldex CH-150, 30°C ;流动相:水；流速:lml/min ;以及蒸发光散色查看器:Sedere Sedex 75 ELSD，45°C，3.0 巴。
[0014]根据本发明之具体实施例，该水不溶性萃取物系由包括下列步骤之方法所制得:将煮饭花根或干燥之煮饭花根，经水萃取得粗萃物；以醇类溶液自该粗萃物中分离出ー醇类不溶性萃取物；再以水进行两次萃取并分离出一水不溶性萃取物。具体而言，该方法包括:
[0015](i)以水加热煮饭花植株根部或干燥之煮饭花根，并将其过滤而形成第一滤液；
[0016](ii)浓缩步骤(i)所述第一滤液以获得ー浓缩滤液，并与醇类溶液混合形成一混合液；
[0017](iii)过滤步骤(ii)所述混合液以获得第二滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根之醇类不溶性萃取物；
[0018](iv)以水溶解步骤(iii)所述不溶物并离心以收集其沉淀物；
[0019](V)再以水溶解步骤(iv)所述沉淀物并离心以获得一上清液 '及
[0020](vi)过滤步骤(V)所述上清液以获得第三滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根之水不溶性萃取物。
[0021]举例而言，本发明所述醇类溶液可为甲醇或こ醇溶液，较佳为こ醇溶液。根据本发明之具体实施例，此处所述浓缩滤液系与等体积之こ醇溶液混合。
[0022]本文所使用的「こ醇」或「酒精」可交互使用，以百分比表示的こ醇或酒精是指溶于水的体积百分比(V/V)，例如，95%こ醇是指含有95%的こ醇及5%的水之溶液。
[0023]再一方面，本发明提供一种预防或治疗糖尿病之医药组合物，其包含治疗有效量之此处所述煮饭花根之醇类不溶性萃取物或水不溶性萃取物；以及ー医药上可接受之载剂。
[0024]本发明亦提供一种此处所述煮饭花根之醇类不溶性萃取物或水不溶性萃取物用于制备预防或治疗糖尿病之药物的用途。
[0025]除非另有定义，此处所有使用之技术及科学名词与本发明所属【技术领域】中熟习此技艺者所一般了解者具有相同的含意。
[0026]本说明书所使用的冠词「一」或「该」，除非内文另有清楚指明，系指该冠词的一或ー个以上(即，至少ー个)的受体。举例而言，「ー样本」系包括复数个此类本【技术领域】中熟习此技艺人士所知之样本及其等效物。 [0027]此处所使用的「糖尿病」こ词是ー种糖类代谢失调的疾病，包括「第I型糖尿病」及「第II型糖尿病」。此处所使用的「第I型糖尿病」又称为「幼儿型糖尿病」或「胰岛素依赖型糖尿病」，其系指胰脏制造极少或无胰岛素为特征的疾病，起因是胰脏制造胰岛素的功能不佳，病患终生需依赖胰岛素控制病情。在无胰岛素之下该病人可能造成严重的代谢性并发症,例如酮酸血症和昏迷。此处所使用的「第II型糖尿病」又称为「成人型糖尿病」或「非胰岛素依赖型糖尿病」，其系指不论是否有胰岛素仍产生过量葡萄糖以及由于不良的萄萄糖廓清而造成循环葡萄糖含量过高为特征的疾病，起因于人体对胰岛素作用反应不佳，而非胰岛素浓度不足。第II型糖尿病通常与饮食及肥胖有夫。
[0028]此处所使用的「萃取物」系指针对一物质进行萃取所得之产物，通常是藉由将所欲萃取的物质浸泡或混合于溶剂中而获得的溶液或浓缩制剂。典型地，萃取物系制备自新鮮植物或经研磨或干燥之植物样本。此领域已知有各种萃取方法，包括但不限于浸溃、渗滤、再渗滤、消解、逆流萃取、涡轮萃取、挤压/压挤/压榨或超临界流体二氧化碳萃取。适当的溶剂包括但不限于水、こ醇、こ醇/水混合物、甲醇、丁醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、正己烷、石油醚、こ酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或其他溶剂。可视需要地选择试剂之种类或调配溶剂之浓度，以达适当极性而进行萃取。例如，本发明所提供一较佳实施例中，系以水为溶剂。溶剂与待萃取物质之比例可为约1:1至约1:100 (w/v (g/ml))、(较佳为约1:1至约1:50 (w/v (g/ml))、更佳为约 1:1 至约 1:20、(w/v (g/ml)),还要更佳为约 1:15 或 1:10(w/v (g/ml))。萃取可在适当温度进行，例如，在约5°C至约100°C、约10°C至约100°C、约20°C至约100°C、约40°C至约100°C、约60°C至约100°C、约70°C至约100°C、或约80°C至约IOO0C。在ー实例中，将新鲜植物或干燥的植物样本之根部(视需要地经切碎或磨碎)与水混合或浸泡并充分搅拌达一段足够的时间，例如，I小时或以上、4小时或以上、8小时或以上、10小时或以上、12小时或以上、14小时或以上、或16小时或以上，在室温进行或加热进行，经由过滤移除固体残留物(滤渣)，然后收集所获得的汁液(粗萃液)；视需要浓缩粗萃液，并加入其他溶剂如醇类溶液进ー步予以分割或分离。所得分割或分离之萃取物亦可再加入溶剂如水更进一歩予以纯化。
[0029]此处所使用的「治疗」こ词包括为了治愈、愈合、减轻、舒缓、改变、矫正、改善、改进或影响该疾病、该疾病之症状、该疾病引起的残疾或罹患该疾病之倾向的目的，而将包含一或多种活性剂之组合物施用或投与至患有该疾病、该疾病之症状或有罹患该疾病之倾向的个体，或对该等个体进行其他处理。例如，治疗糖尿病通常包括施予病患一活性成分或药物，以达到降低血液葡萄糖浓度、改善胰岛素敏感度，降低胰岛素抗性或増加葡萄糖的消耗等之目的。本说明书所使用的「预防」乙辞系指如个体发病前预先处理可避免产生该病症。
[0030]此处所使用的「个体」乙词特别指需此处所述治疗的哺乳动物，例如，人类，但亦可为宠物(如犬、猫等)、农畜动物(如牛、羊、马、猪等)或实验动物(如，小白鼠、大鼠天、竺鼠、白兔等)。
[0031]本说明书所使用的「治疗有效量」乙词系指用于治疗之物质可提供治疗功效之量，其系取决于施用的模式及待治疗的状况，包括但不限于年龄、体重、症状、治疗效果、投药路径及治疗时间。
[0032]本说明书所使用的「载剂」或「医药上可接受之载剂」乙词是指用于医药之稀释剂、赋形剂或类似物，包括制药业一般知识者所熟知者主。
[0033]可以任何适合的路径施用本发明之医药组合物，包括但不限于非经肠道或口服投药。非经肠道投药之医药组合物其形式包括溶液、悬浮液、乳液，及可在使用前刻溶解或悬浮于溶剂中之固体可注射组合物。可藉由溶解、悬浮或乳化一或多活性成分于稀释剂中来制备该注射液。前述稀释剂之实例为用于注射之蒸馏水、生理盐水、植物油、醇类及其组合。又，该注射液可含有安定剂、助溶剤、悬浮剂、乳化剤、平滑剂、缓冲液、保存剂等。该等注射液系在最終制剂步骤中灭菌或以无菌程序制备。本发明之医药组合物亦可被制剂成无菌固体配制品，例如，藉由冷冻干燥，并可在使用前刻灭菌或溶解于无菌可注射水或其他无菌稀释剂。
[0034]根据本发明，该医药组合物较佳为经口投药，其中该组合物可为固体或液体形式。固体组合物包括锭剂、丸剂、胶囊、分散性粉剂、颗粒及其类似物。口服组合物亦包括漱口药及舌下片剂。胶囊包括硬胶囊及软胶囊。在此类口服固体组合物中，一或多活性化合物可自行混合，或与稀释剂、结合剂、散解剂、润滑剂、安定剂、助溶剂混合，接着以习知方法制剂成配制品。当需要时，此等配制品可以涂布剂涂布，或可以二或多种涂布层涂布。另ー方面，口服液体组合物包括医药上可接受之液态溶液、悬浮液、乳液、糖浆、药酒，及类似物。在此类组合物中，一或多活性化合物可被溶解、悬浮或乳化在通用稀释剂中(如纯化水、乙醇或其等之混合物等等)。除了此类稀释剂，前述组合物亦可含有润湿剂、悬浮剂、乳化剤、甜味剂、调味剂、香料、保存剂及缓冲液及其类似物。
[0035]在下列具体实施例中，本发明将被更特定地描述。值得注意的是，下列所述本发明之具体实施例仅系用于说明，并非为详列或限缩本发明范围至所揭露之特定形式。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]出于阐释本发明的目的，在图式中显示当前较佳的实施例。然而，应理解的是，本发明不限于图式中之较佳实施例。
[0037]图1显示本发明之煮饭花根之醇类不溶性萃取物之制备流程示意图。
[0038]图2显示本发明之煮饭花根之水不溶性萃取物之制备流程示意图。
[0039]图3提供普路兰(Pullulan)多醣标准品P-800、P-200、P-50及P-10水溶液等量混合的HPLC分析图。
[0040]图4提供普路兰(Pullulan)多醣标准品P-400、P-100、P-20、P_5水溶液等量混合的HPLC分析图。
[0041]图5提供本发明之醇类不溶性(509ffit0H-1nsol)萃取物之HPLC分析图。
[0042]图6提供本发明之醇类可溶性(509ffit0H-Sol)萃取物之HPLC分析图。
[0043]图7提供本发明之水不溶性(H20-1nsol)萃取物之HPLC分析图 。
[0044]图8A、图8B和图8C显示本发明之醇类不溶性萃取物(509ffit0H-1nsol)对于第二型糖尿病小鼠之葡萄糖耐受性的影响，其中图8A至C分别表示小鼠于治疗第0周、第I周及第2周之腹腔注射葡萄糖前后各时间点血糖值之变化情形。
[0045]图9显示本发明之醇类不溶性萃取物(509ffit0H-1nsol)对于第二型糖尿病小鼠之骨骼肌之肝醣含量的影响，其中P」显示本发明之醇类不溶性萃取物所生功效与负对照组相较，具有统计上显著之差异(P值〈0.05)。
[0046]图1OA和图1OB显示本发明之醇类不溶性萃取物(509ffit0H-1nsol)对于第二型糖尿病小鼠之葡萄糖耐受性之影响，其中图1OA提供经ロ喂与葡萄糖前后各时间点血糖值之变化情形；及图1OB提供血液中葡萄糖利用率之统计结果(AUC:曲线下面积)。
[0047]图1lA和图1lB显示本发明之醇类不溶性萃取物(509ffit0H-1nsOl)对于第二型糖尿病小鼠之蔗糖耐受性之影响，其中图1lA表示经ロ喂与蔗糖前后各时间点血糖值之变化情形；及图1lB提供血液中葡萄糖利用率之统计结果(AUC:曲线下面积)。
[0048]图12A和图12B显示本发明之醇类可溶性萃取物(509ffit0H-Sol)对于第二型糖尿病小鼠之静脉注射葡萄糖耐受性之影响，其中图12A及图12B分别表示于第7及14天所测得各时间点血糖值之变化情形。
【具体实施方式】
[0049](一)制备实例
[0050]制备实例I (こ醇不溶性萃取物)
[0051]取需要量之煮饭花根干燥粉末，加入约干燥粉末总重量之10倍体积水进行萃取；将过滤所得滤液进行减压浓缩至剩下原滤液体积之约1/3，再加入与该浓缩滤液等体积之95%こ醇溶液进行第二次萃取，经过滤后保留滤液为こ醇可溶性萃取物并收集不溶物为こ醇不溶性萃取物，准备进行高效液相层析仪(High-Performance Lipid Chromatography ；HPLC)分析。图1为こ醇不溶性萃取物之制备流程示意图。
[0052]制备实例2 (水不溶性萃取物)
[0053]依制备实例I之萃取步骤进行萃取得こ醇不溶性萃取物，加入适量水至该不溶物进行第三次萃取，并离心取得其沉淀物后，再加入该沉淀物之约40至50倍体积之水进行第四物萃取，并离心以获得其上清液并进行过滤，经过滤后收集不溶物为水不溶性萃取物，准备进行HPLC分析。图2为水不溶性萃取物之制备流程示意图。
[0054]HPLC 分析
[0055]以分子筛选层析法(size exclusion chromatography)分析样品，并使用凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)管柱,将成份依分子量由大至小依序冲提。同时与标准品比较滞留时间(RT)，用以预估分子量(丽)。[0056]1.标准品溶液之配制:将8个普路兰(pullulan)多醣标准品(P_5、-10、-20、-50、-100、-200、-400、-800)分别配置成lmg/mL水溶液，加水缓和搅拌后置冷藏(4°C )隔夜，以确保其吸水膨胀后溶解成水溶液。以0.45 ii m滤膜过滤后供HPLC分析。
[0057]I1.萃取物溶液之配制:将待测样品以水各配制成3mg/mL水溶液，室温下不溶者视情况加热搅拌(30分钟，起泡)后，冷却并冷藏(4°C )隔夜。以0.45 y m滤膜过滤后供HPLC分析。
[0058]II1.HPLC 条件:
[0059]仪器:日立L-71OOHPLC 帮浦(Hitachi L-7100 HPLC Pump);注射体积:50 y I ;分析管柱:Shodex OHpak SB-804HQ, 10 u m,8X300mm ;排阻极限(exclusion limit):1，000, 000 ;管柱温控器:Eldex CH-150, 30°C ;流动相冰；流速:lmL/min ;以及蒸发光散色查看器:Sedere Sedex 75 ELSD,45°C,3.0 巴。
[0060]V1.分析结果:
[0061]⑴标准品
[0062]标准品P-800、P-200、P-50及P-10水溶液等量混合的HPLC分析图如图3所示，P-400.P-100.P-20及P-5混合的HPLC分析图如图4所示。各标准品所对应之分子量及其滞留时间显示于表1:
[0063]表1
[0064]
【权利要求】
1.一种治疗糖尿病的组合物，其系包含煮饭花(Mirabilis jalapa L.)根的醇类不溶性萃取物，该萃取物的特征在于其HPLC分析图于滞留时间为4.27及5.36分钟具有吸收峰，其中HPLC分析条件如下:仪器:日立L-7100 HPLC帮浦(Hitachi L-7100 HPLCPump);注射体积:50 u I ;分析管柱:Shodex OHpak SB-804HQ, 10 u m, 8X 300mm ;排阻极限(exclusion limit):1,000,000 ;管柱温控器:Eldex CH-150, 30°C ;流动相:水；流速:1ml/min ;以及蒸发光散色查看器:Sedere Sedex 75 ELSD, 45°C, 3.0巴。
2.根据权利要求1的组合物，其中该醇类不溶性萃取物系由包括下列步骤的方法所制得: 将煮饭花根或干燥的煮饭花根，经水萃取得粗萃物；再以醇类溶液自该粗萃物分离出ー醇类不溶性萃取物。
3.根据权利要求2的醇类不溶性萃取物，其系由包括下列步骤的方法所制得: (i)以水加热煮饭花根或干燥之煮饭花根，并将其过滤而形成第一滤液； (ii)浓缩步骤(i)所述第一滤液以获得ー浓缩滤液，并与醇类溶液混合形成一混合液；及 (iii)过滤步骤(ii)所述混合液以获得第二滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根的醇类不溶性萃取物。
4.根据权利要求3的醇类不溶性萃取物，其中该浓缩滤液系与等体积之95%(v/v)以上醇类溶液混合。
5.根据权利要求4的醇类不溶性萃取物，其中该醇类溶液系甲醇或こ醇。
6.根据权利要求5的醇类不溶性萃取物，其中该醇类溶液系こ醇。
7.一种治疗糖尿病的组合物，其系包含煮饭花根的水不溶性萃取物，该萃取物的特征在于其HPLC分析图于滞留时间为4.85及5.58分钟具有吸收峰，其中HPLC分析条件如下:仪器:日立L-7100HPLC帮浦(Hitachi L-7100 HPLC Pump);注射体积:50 U I ;分析管柱:Shodex OHpak SB-804HQ, 10 u m,8X300mm ;排阻极限(exclusion limit): 1，000，000 ;管柱温控器=Eldex CH-150, 300C ;流动相:水；流速:lml/min ;以及蒸发光散色查看器=SedereSedex 75 ELSD，45°C，3.0 巴。
8.根据权利要求7的组合物，其中该水不溶性萃取物系由包括下列步骤的方法所制得: 将煮饭花根或干燥的煮饭花根，经水萃取得粗萃物；以醇类溶液自该粗萃物分离出ー醇类不溶性萃取物；再以水进行两次萃取并分离出一水不溶性萃取物。
9.根据权利要求8的水不溶性萃取物，其系由包括下列步骤的方法所制得: (i)以水加热煮饭花根或干燥之煮饭花根，并将其过滤而形成第一滤液； (ii)浓缩步骤(i)所述第一滤液以获得ー浓缩滤液，并与醇类溶液混合形成一混合液； (iii)过滤步骤(ii)所述混合液以获得第二滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根的醇类不溶性萃取物； (iv)以水溶解步骤(iii)所述不溶物并离心以收集其沉淀物； (v)再以水溶解步骤(iv)所述沉淀物并离心以获得一上清液；及 (vi)过滤步骤(V)所述上 清液以获得第三滤液及ー不溶物，并收集该不溶物为煮饭花根的水不溶性萃取物。
10.根据权利要求9的水不溶性萃取物，其中该浓缩滤液系与等体积之95%(v/v)以上醇类溶液混合。
11.根据权利要求10的水不溶性萃取物，其中该醇类溶液系甲醇或こ醇。
12.根据权利要求11的水不溶性萃取物，其中该醇类溶液系こ醇。
13.一种预防或治疗糖尿病的医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1的醇类不溶性萃取物或权利要求7的水不溶性萃取物；以及ー医药上可接受的载剂。
14.一种权利要求1的醇类不溶性萃取物或权利要求7的水不溶性萃取物用于制备预防或治疗糖尿病的药物的用途。
【文档编号】A61K125/00GK103585202SQ201210287012
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月13日 优先权日:2012年8月13日
【发明者】叶集焕, 徐兆民 申请人:资元堂生物科技股份有限公司