抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，其免疫程序简单，既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，能有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该疫苗组合物的免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，血清抗体效价高，免疫期长，耗时少、费力少、对猪的侵害也小。该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。
【专利说明】抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于畜类生物制药【技术领域】，涉及一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的二联多价疫苗组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪气喘病又称猪支原体肺炎(Macoplasmal pneumoniae of swine, MPS)或猪地方性流行性肺炎(Swine Enzootic Pneumonia, SEP),是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病,普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。
[0003]猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染，感染通常开始于携带病原的母猪产胎时感染小猪。由于猪群集中管理技术的影响，感染在生命后期才变得明显。当断乳后把猪集中起来时，通常还可发现其它感染。在六周龄或更大的猪中常常观察到明显的疾病，感染猪的生长速度和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗贵并且需要长期使用。再感染也是一个问题。目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。
[0004]猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP),是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。该病在世界范围内分布广泛，常呈地方性流行，造成持续的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。由于APP血清型众多，且各个国家及地区流行的优势血清型各不相同，给该病的防治带来了极大的困难。我国已分离到1、2、3、4、5、7和8型，其中以7型最多，该病在我国不同省市流行的血清型不同。猪传染性胸膜肺炎主要是由感染猪直接传染给易感猪群的，能感染任何年龄的猪只，I~4月龄最易感，APP最主要的传播方式是通过感染猪呼出的小液滴进行的，这些小液滴随着气流漂移，当距离较近的易感猪呼入或直接接触到小液滴时就容易发病。猪传染性胸膜肺炎与猪传染性萎缩性鼻炎和猪气喘病一起成为当今大型养猪场的三大呼吸道传染病。该病以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，目前在多数工厂化的养猪国家均有发生。本病主要通过飞沫传播，也可通过接触传染。该病造成的猪只死亡、生长缓慢、饲料报酬降低及药物防治费用的增加，给世界各地的养殖业造成了严重的经济损失。
[0005]但是，迄今为止，尚没有能够同时防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎的二联组合疫苗。因此，目前需要研究开发一种安全有效、使用简便，并能同时防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎的二联组合疫苗。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎的二联疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原，免疫程序简单，既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该疫苗生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。
[0007]为此，本发明提供了一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其包括猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
[0008]在本发明中，所述猪肺炎支原体抗原包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的猪肺炎支原体抗原。
[0009]根据本发明，所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体细菌，或者含有猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。
[0010]本发明中所述用语“猪肺炎支原体全菌体”，是指猪肺炎支原体的完整细胞体。
[0011]在本发明的一个具体实施例中，所述猪肺炎支原体抗原选自勃林格殷格翰公司的猪支原体肺炎灭活疫苗(Ingeivacs M.hyo)、哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne、美国先灵德雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗(Myco Silencer? )、西班牙海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFendMH、梅里亚动物保健公司的猪克喘中的一种或几种。
`[0012]在本发明的一个优选的实施例中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的J株或HN0613株全菌体。优选所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的HN0613株全菌体。所述猪肺炎支原体 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期为2012年6月13日。
[0013]本发明中所述用语“猪肺炎支原体HN0613”，也称为“猪肺炎支原体HN0613株” (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)。
[0014]根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613灭活前含量为IO8~101QMHDCE/ml (MHDCE =猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即I MHDCE相当于I个猪肺炎支原体)。优选在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613抗原灭活前含量为2X109MHDCE/ml。
[0015]正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的支原体抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。[0016]因此，本发明中，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16SrRNA的同源性至少为80%的菌株。优选所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16SrRNA的同源性至少为90%的菌株。进一步优选的是，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性至少为95%~99%的菌株，更优选的是，所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性为98%~99%的菌株。即在不改变猪肺炎支原体16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪肺炎支原体，获得与本发明猪肺炎支原体16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
[0017]同样，在本发明中，所述胸膜肺炎放线杆菌抗原包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪传染性胸膜肺炎的免疫应答的胸膜肺炎放线杆菌抗原。
[0018]根据本发明，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。
[0019]本发明中所述用语“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全菌体”，是指猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的完整细胞体。
[0020]本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌”或“胸膜肺炎放线杆菌”(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。
[0021]同样，本发明中所述用语“猪胸膜肺炎放线杆菌抗原”，也称为“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原”或“胸膜肺炎放线杆菌抗原”。
[0022]在本发明的一个具体实施例中，所述胸膜肺炎放线杆菌抗原选自华中农业大学的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(1、2、7型)；专利文件CN 102058880中的传染性胸膜肺炎放线杆菌HT株(猪传染性胸膜肺炎HT株的分离、鉴定与定型试验，中国动物检疫，1999，16(2):7~9)、52株(保藏编号为 CGMCC N0.4215)、DY 株(保藏编号为 CGMCC N0.4216)中的一种或几种。
[0023]在本发明的一个优选的实施例中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。优选所述猪胸膜放线杆菌抗原为灭活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体。
[0024]所述胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(ActinobaciIIuspIeuropneumoniaeserotypeI strain LC, APP-1)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011458 ；所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5strainYC，APP-5)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011459 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型 YS 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype7 strain YS, APP-7)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期均为2011年12月9日。
[0025]根据本发明，在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清I型LC株含量为IO8~10lclCFU/ml，血清5型YC株含量为IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量为IO8~101(lCFU/ml。优选在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清I型LC株含量为109CFU/ml，血清5型YC株含量为109CFU/ml，血清7型YS株含量为109CFU/ml。
[0026]在本发明中，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原，其选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪瘟抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪圆环病毒抗原(PCV)、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)中的一种或几种。
[0027]根据本发明，所述疫苗组合物还包括疫苗辅剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗辅剂含量为10wt%~60wt%。
[0028]在本发明中，所述疫苗辅剂包括疫苗佐剂、防腐剂、代谢油混合物、稀释剂。其中，所述疫苗佐剂为氢氧化招胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel 01 (法国 SEPPIC)、蜂胶、ISA206(法国 SEPPIC)、ISA760VG (法国 SEPPIC)，优选卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)、Ge 101 (法国 SEPPIC)、ISA206 (法国 SEPPIC)、ISA760VG (法国 SEPPIC)，更优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、GelOl (法国SEPPIC),更优选卡波姆(Carbomer)(商品名 Carbopol)。
[0029]本发明进一步提供了一种根据本发明所述疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤:将抗原与疫苗辅剂混合制得抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
[0030]可任意选择的，在配苗步骤中，所述抗原还包括其它猪的病原体的附加抗原。
[0031]根据本发明方法，所述方法还包括在配苗步骤之前的抗原准备步骤，包括制备抗原，或者通过其他方法获得抗原，如直接购置抗原。所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪胸膜肺炎放线杆菌，并分别进行浓缩，获得猪肺炎支原体抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。优选所述制备抗原包括分别培养猪肺炎支原体和猪胸膜肺炎放线杆菌，并分别进行灭活、浓缩，获得猪肺炎支原体灭活抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌灭活抗原。
[0032]本发明还提供了一种 根据本发明所述的疫苗组合物在稀释PRSS疫苗中的应用。
[0033]本发明针对现有技术的不足提供了一种含有猪肺炎支原体与猪胸膜肺炎放线杆菌的二联多价疫苗组合物，该疫苗组合物免疫程序简单，能同时有效的防治猪支原体肺炎和猪传染性胸膜肺炎。该产品既可产生抗体，又同时具有攻毒保护，其免疫效果至少与分别注射单苗效果相当，副反应小，血清抗体效价高，免疫期长，耗时少、费力少、对猪的侵害也小。该疫苗组合物生产工艺简单，免疫成本低廉，实用性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是实施例1中猪肺炎支原体HN0613的狄氏染色结果图。
[0035]图2是实施例1中猪肺炎支原体HN0613的PCR鉴定结果图。
[0036]图2中附图标记的含义如下:1 Marker DL 2000 ；2病料分离株HN0613 ；3致病性试验分离株；4阴性对照。
[0037]图3是实施例1中猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR鉴定结果图
[0038]图3中附图标记的含义如下:I Marker ；2猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株；3猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株；4猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株。
[0039]mmm
[0040]猪肺炎支原体HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏编号:CCTCC NO:M 2012230。
[0041]胸膜肺炎放线杆菌血清I 型 LC 株(Actinobacillus pleuropneumoniaeserotypelstrain LC, APP-1),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCC NO:M2011458。
[0042]猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype5 strain YC, APP-5),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保减中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区洛咖山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCCN0:M 2011459。
[0043]猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(ActinobaciIIuspleuropneumoniaeserotype7 strain YS, APP-7),由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保减中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区洛咖山路16号武汉大学)进行 保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏编号:CCTCCN0:M 2011460。
[0044]为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并保藏。
【具体实施方式】
[0045]为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0046]实施例
[0047]实施例1:猪肺炎支原体HN0613的分离鉴定
[0048]1.材料与方法
[0049](I)材料
[0050]①病料来源
[0051]2006年从河南省各地采集疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共16份。
[0052]②培养基
[0053]猪肺炎支原体Friis培养基购自BD公司；猪血清购自GIBCO公司；酚红指示剂购自美国AMRESC0公司。
[0054]③试剂
[0055]生化试剂及化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
[0056]细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，狄氏染色试剂盒购自于重庆庞通医疗器械有限公司。生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。
[0057]④阴、阳性血清
[0058]兔抗猪肺炎支原体J株特异性血清，按参考文献方法制备(Meens，J.，Selke,M.，Gerlach, G.F.，2006.1dentification and immunological characterizationof conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 and Mhp651.Vet.Microbiol.116:85~95)。未免兔血清作为阴性血清。
[0059]2.方法[0060](I)病料处理
[0061]取疑似支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成I~2_3碎块，接种Friis肉汤，37°C培养，每日观察培养液PH值变化。培养液变色时，取第一代经0.45 ii m过滤器过滤的培养物0.5ml接种到
1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉汤培养基中，37°C继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面，置37°C，5% CO2条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤,培养基颜色变黄后取0.2ml培养物涂布于Frris平板固体培养基表面置37°C ,5% CO2条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Frris液体培养基所得的颜色变黄培养物保存于_70°C备用。
[0062](2)菌落狄氏染色
[0063]按参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M]，北京:北京农业大学出版社，1992:49~50，126~129，371~373)，采用无菌方法从固体培养基上切下菌落，放到载玻片上，在两边垫上竹签，滴上狄氏染色液后再盖上一块玻片，置于4°C染色30min后低倍镜下观察结果。
[0064](3) PCR鉴定及测序分析
[0065]用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。PCR引物参考文献进行合成(J.Caron, M.0uardani, and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46 Genes[J].Journal of clinical microbiology,2000,38(4):1390~1396)。 FSp36，5’ -GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’ Rsp36，5’ -GCCGCGAAATTAAATATTTTTAAITGCATCCTG-3’，上海生工合`成。PCR 反应体系:超纯水 34.5 y 1、10XPCR Buffer 5u I,dNTP 4 ill、引物各2 ill、模板2 ill、TaqDNA聚合酶0.5 ill。按下列参数进行PCR反应:预变性 94°C 3min ；94°C 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 90s，35 个循环后;72°C终延伸 IOmin0 扩增结束后取上述产物琼脂糖凝胶电泳检测。直接将有特异性条带的PCR产物及引物提交至上海生工进行测序分析。
[0066](4)生化试验:
[0067]生化试验参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M]，北京:北京农业大学出版社，1992:49~50，126~129，371~373)。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。
[0068](5)生长抑制试验(GIT)
[0069]Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的抗血清25 Ul吸附于灭菌的6mm滤纸片，将吸附有血清的滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有无菌落抑制环的产生。抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体阳性。
[0070](6)分离菌株的致病性[0071]将分离菌株培养物经气管注射I~2周龄健康易感猪3头，每头5ml (HN0613,108CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪按实施例1第2部分方法(4)中“生化试验”的方法进行猪肺炎支原体的分离，对分离株按实施例1第2部分方法(3)中“PCR鉴定及测序分析”的方法进行PCR鉴定。
[0072]3.结果
[0073](I)培养结果
[0074]16份病料中仅有1份病料接种的培养基7日后变黄色，过滤接种后5日培养液变黄，培养液均匀混浊，转接于含青霉素的Friis培养基变色后，革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色发现支原体样菌体。转接于固体培养基后，菌落生长入培养基内部。菌落呈典型煎荷包蛋状，与支原体菌落形态相符，命名为HN0613株猪肺炎支原体。
[0075](2)狄氏染色结果
[0076]在低倍镜下观察到，在Friis固体培养基的猪肺炎支原体的菌落被染成不褪色的中心深蓝色菌落(参见图1)，与支原体菌落染色特性相符。
[0077](3) PCR 鉴定
[0078]所提取的分离培养物模板经PCR扩增后，再经琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在750~1000bp之间接近1000bp的位置有一条带，与预期948bp相符(参见图2)。
[0079](4)序列测定与分析
[0080]将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中进行blast比较。结果显示，HN0613分离菌株P36基因序列与NCBI中公布的Mhp P36基因序列相应序列同源性为98%以上。测序结果见序列表。
[0081](5)生化及血清学鉴定
[0082]分离菌株生化反应与猪肺炎支原体生化特性相符(表1)。
[0083]表1 HN0613分离株生化及生长抑制试验结果表
[0084]
【权利要求】
1.一种抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其包括猪肺炎支原体抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体细菌，或者含有猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为猪胸膜肺炎放线杆菌全菌体，其选自灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪胸膜肺炎放线杆菌细菌，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或者含有猪胸膜肺炎放线杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一种或几种。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的J株或HN0613株全菌体； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌抗原为灭活形式的全菌体。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的HN0613株全菌体； 在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613灭活前含量为IO8~1kiMhdceAiI ； 所述猪肺炎支原体HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain)的保藏编号为:CCTCCNO:M 2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心； 所述猪胸膜放线杆菌抗原为灭活形式的血清I型LC株、血清5型YC株和血清7型YS株全菌体； 在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清I型LC株含量为IO8~101QCFU/ml，血清5型YC株含量为IO8~10lclCFU/ml，血清7型YS株含量为IO8~IOiciCFU/ml ； 所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株(Actinobacillus pIeuropneumoniaeserotypel strain LC)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011458 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清 5 型 YC 株(Actinobacillus pleuropneumoniae serotype5 strain YC)的保藏编号为=CCTCC NO:M 2011459 ;所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株(Actinobacilluspleuropneumoniae serotype7 strain YS)的保藏编号为:CCTCC NO:M 2011460 ;上述菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于: 所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性至少为80%的囷株； 在所述疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体HN0613抗原灭活前含量为2X 109MHDCE/ml ； 在所述疫苗组合物中，所述猪胸膜肺炎放线杆菌灭活前血清I型LC株含量为IO9CFU/ml，血清5型YC株含量为109CFU/ml，血清7型YS株含量为109CFU/ml。
6.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于:所述猪肺炎支原体抗原为与猪肺炎支原体HN0613的16S rRNA的同源性至少为95%~99%的菌株。
7.根据权利要求1~6中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体的附加抗原，其选自猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原、猪瘟抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒中的一种或几种。
8.根据权利要求1~7中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于:所述疫苗组合物还包括疫苗辅剂，并且，在所述疫苗组合物中，所述疫苗辅剂含量为10wt%~ 60wt%。
9.一种根据权利要求1~8中任意一项所述疫苗组合物的制备方法，包括配苗步骤:将抗原与疫苗辅剂混合制得抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物，其中，所述抗原包括猪肺炎支原体抗原和猪胸膜肺炎放线杆菌抗原。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:在配苗步骤中，所述抗原还包括其它猪的病原体的附加抗原。
11.一种根据权利要求 1~6中任意一项所述的疫苗组合物在稀释PRSS疫苗中的应用。
【文档编号】A61P31/20GK103623400SQ201210305034
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月24日 优先权日:2012年8月24日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司