专利名称：一种将蛋白质递送到细胞中的方法
技术领域：
本发明主要涉及将蛋白质递送到细胞中的方法。
背景技术：
对各种病症、疾病和状态的治疗途径可以设想将生物活性蛋白质递送到细胞中，从而使该蛋白质能够在细胞环境内执行其生物学功能。现存的将生物活性蛋白质递送到细胞中的方法包括例如显微注射[6，7]和电穿孔[8，9]的物理方法，该方法可证实难以应用在活体内。分子技术包括使蛋白转导域(PTD)与活性蛋白质结合从而介导蛋白质的细胞吸收。三个最活跃地研究的PTD源自Drosophilia anntennapedia肽、HSV-VP22蛋白和HIV-TAT蛋白转导基序。通过这些PTD穿过细胞膜的转导的发生机制目前尚未充分了解，但是研究已显示，肽和蛋白质的递送与PTD中正电荷赖氨酸和精氨酸残基的含量和分布密切相关[10，11] ο正在日益兴起的合理的给药研究中的另一途径涉及阳离子型脂质和聚合物。例如，聚乙烯亚胺(PEI)结合蛋白质通过离子电荷相互作用能够进入细胞[12]。蛋白质与PEI的结合必需在温和条件下进行从而使蛋白质免于变性。而且，PEI的细胞毒性也限制其在活体内的应用，特别是具有高分子量的PEI。因此，需要将蛋白质(包括生物活性蛋白质或抗体)递送到细胞中的另一途径。
发明内容
一方面，本发明提供了一种胶束-蛋白质复合物，其包含阳离子型聚合物的胶束，所述阳离子型聚合物具有通式I一 (W— X— Y— Z)p-(w' —V -V —V ),-的结构；和蛋白质，所述蛋白质具有用来与所述胶束复合的区域。所述蛋白质通过蛋白质与阳离子型聚合物之间的相互作用复合到所述胶束的外部。在通式I中，W、X、Y和Z各自独立地选自ORR'
--C——(CH^——--N————--N——jCH^一O--
LJ ；LΛ *LJ；
OO--O-C——----C-O——pH)--和不存在，其中 W、X、Y
LJ * LJ ·
和Z中只有一个为不存在，且W、X、Y和Z中至少一个为包含与R或V结合的氮的基团。而且，在通式I中，W' 'V 'Y'和Z'各自独立地选自·
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oo--0-C-(cH)----C-。-(cH)"]--和不存在，其中 W,、
L-I ； L-I ;
V , V和r中只有一个为不存在，且f、V、Y'和r中至少一个为包含与R"或Ri "结合的氮的基团。此外，在通式I中，R和R'各自独立地为H、烷基或杂烷基(heteroalkyl) ;R"和R'"各自独立地为疏水基；P和q各自独立地为大于零的整数；以及nums、!:、!]!'、n'、r' ,s'和C各自独立地为大于O的整数。在本发明提供的胶束-蛋白质复合物中，所述阳离子型聚合物可包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(胆留醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亚乙基)溴化铵]癸二酸酉旨} (poly {N-methyldietheneamine sebacate) -co- [ (cholesteryl oxocarbonylamidoethyl)methyl bis (ethylene) ammonium bromide] sebacate})。所述蛋白质可为寡妝、妝、多肽、全长蛋白质、蛋白质片段、蛋白质结构域(protein domain)或融合蛋白，并且可为生物活性的。在各种实施方式中，所述蛋白质可包括激素、受体配体、转录因子、转录增强子、转录抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生长因子、抗体或细胞毒性蛋白质。在特别的实施方式中，所述生长因子可包括神经胶质衍生的亲神经因子，所述细胞毒性蛋白质可包括凝集素A，以及所述抗体可包括赫赛汀(here印tin)。本发明提供的胶束-蛋白质复合物可进一步包含附加的治疗剂，其包括包含在所述胶束内部的药剂或者复合到所述胶束外部的药剂或核酸分子。另一方面，本发明提供了一种将蛋白质递送到细胞中的方法。该方法包括使如本申请所述的胶束-蛋白质复合物与细胞接触以使胶束-蛋白质复合物被吸收到细胞中。所述细胞可为体外细胞，或者可为体内细胞，所以该方法包括向被试者(包括例如人)施用所述胶束-蛋白质复合物。在一些实施方式中，所述蛋白质为生物活性蛋白质并且在递送到细胞中后保持生物活性。再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本申请所述的胶束-蛋白质复合物。所述药物组合物可进一步包含可药用的载体。又一方面，本发明提供了如本申请所述的胶束-蛋白质复合物用于将蛋白质递送到被试者的细胞中的用途。所述被试者可为人。在各种实施方式中，所述蛋白质为生物活性蛋白并且在递送到细胞中后保持生物活性。
结合附图，在回顾本发明的具体实施方式
的下列描述后，对于本领域普通技术人员来说，本发明的其它方面和特点将变得明显。
在图中，只通过实施例说明本发明的实施方式图I: P (MDS-共-CES)胶束/凝集素A复合物的粒度和ζ电势。各条件重复三次测试。用误差棒显示标准差。 图2:在用包含固定浓度的凝集素A和变化浓度的P (MDS-共-CES)的胶束/凝集素A复合物孵育后MDA-MB-231(a)、H印G2(b)、HeLa(c)和4T1 (d)细胞的生活力。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准差。图3:在用包含变化浓度的凝集素A和固定浓度的P (MDS-共-CES)的胶束/凝集素A复合物孵育后MDA-MB-231(a)、H印G2(b)、HeLa(c)和4T1 (d)细胞的生活力。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准差。图4:将P (MDS-共-CES)胶束介导的凝集素A和BioPorter介导的凝集素A递送到1^-1^-231(&)、抱 62(13)、抱1^((3)和4Tl(d)细胞中的比较研究。在含血清培养基中分别以(a) 20ppm、(b) 50ppm、(c) 40ppm 和(d) IOOppm 的固定浓度使用 P (MDS-共-CES)。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准差。
具体实施例方式本方法和组合物涉及生物可降解的阳离子胶束与蛋白质之间的复合物的形成，以及这种复合物用于将蛋白质递送到细胞内部的用途。以前，在美国专利申请第10/849，498号(公开为US 2005/0260276)中描述了新的阳离子核-壳胶束。该申请涉及生物可降解的阳离子核-壳胶束用于递送药物(包括在胶束内部封装的药物)以及递送核酸分子(包括与胶束外部结合的核酸分子)的用途。形成胶束的聚合物由具有连接到主链中季氨基(quaternary amino group)处的主链上的疏水侧基的亲水主链组成。该带电季氨基赋予聚合物聚阳离子性质、沿着主链分布的非中和正电荷。该聚合物还包含沿着主链的叔氨基(tertiary amino group),其可被质子化和去质子化，从而使该聚合物在生理环境中具有缓冲效应[14]。如在US 2005/0260276中所述，通过在胶束装配过程中用聚合物包合药物而将药物容易地封装在胶束内部。尽管一些疏水基可位于胶束外部，但是许多药物包含疏水部分，例如疏水环结构，从而使药物与趋向与胶束结构的内部分离的聚合物上的疏水侧基之间结
口 O同样，如在US 2005/0260276中所述，如DNA的核酸可以容易地与胶束外部结合。核酸是具有沿着分子主链有规则地分布的负电荷的柔性分子，并因此能够与胶束表面的轮廓相符并且与位于胶束外表面的阳离子电荷静电结合。相反，蛋白质可以折叠成复杂结构，包括球状结构，特别是在活性通常取决于蛋白质的构象折叠的生物活性蛋白质的情况下。蛋白质即使在具有负电荷区域时亦不会与聚阴离子核酸具有相同的电荷分布，并且往往是不能以与核酸相同的方式与胶束的表面一致。同样，蛋白质往往对环境(包括微环境)十分敏感，并且在不适宜的条件下可变性，导致生物活性丧失。尽管蛋白质伴随这些明显的困难，本发明人现已证实了先前所述的胶束能够令人惊讶地用于将蛋白质(包括折叠的生物活性蛋白质)递送到细胞中。在保留蛋白质可具有的生物活性的同时，所述核-壳胶束可用于将该蛋白质递送到细胞内部。细胞毒素凝集素A用作示范性的具有生物活性的蛋白质，并且如下列实施例I·所述，与BioPorter (包括阳离子脂质的商业可利用的蛋白质载体)相比，凝集素A被更加有效地递送到细胞中。同样，在通过胶束递送时凝集素A针对各种癌细胞系的细胞毒性比在通过BioPorter递送时的高得多。因此，本方法可导致蛋白质被非常有效地递送到细胞中的同时保持蛋白质可具有的任何生物活性。所述胶束-蛋白质复合物具有多种应用，包括体外应用、研究和人的医学应用。尽管将凝集素A用作示范性蛋白质，但是本发明所述的方法和复合物意欲延伸到通常蛋白质，包括抗体，例如赫赛汀；可以理解的是，本发明的方法和复合物不依赖于在该方法或复合物中所用的蛋白质的任何特定氨基酸序列或者生物活性。因此，提供了一种将蛋白质递送到细胞内部的方法。由生物可降解的、阳离子型两亲性聚合物(amphilic polymer)形成的胶束用作递送载体并且用来与要被递送的蛋白质形成复合物。然后，使该复合物与将要向其中递送蛋白的细胞接触。该复合物适当地带正电荷并且具有使复合物被胞吞的适当尺寸并因此被细胞吸收，从而将蛋白质递送到细胞中。首先，提供了与蛋白质复合的胶束。如US 2005/0260276中所述，示范性的胶束包含阳离子型聚合物。如上所述，该聚合物具有包含氨基的亲水主链。在形成聚合物主链的骨架的亲水分子中的氨基为叔氨基。所述叔氨基可根据PH被质子化或者去质子化，根据溶液条件影响净正电荷。然而，经由至少一部分叔氨基将疏水侧基连接到亲水主链上，其通过将这些氨基永久地转变成带正电荷的基团(即季氨基)，从而导致聚合物为阳离子型的(不管 pH)。所述阳离子型聚合物具有通式I的结构-(W-X-Y-Z)p- Qfi' -V -V -V )qW、X、Y和Z各自独立地选自
ORR'
--C——------N——JCH|----N——^CH 參一O--
LJ ;IJ ; LJ ;
权利要求
1.一种胶束-蛋白质复合物，其包括 阳离子型聚合物的胶束，该阳离子型聚合物具有通式I的结构 —(W-X-Y-Z)p- Qfi' -V —V —V )-； 和蛋白质，该蛋白质具有用来与所述胶束复合的区域； 所述蛋白质通过蛋白质与所述聚合物之间的相互作用复合到所述胶束的外部； 其中,在通式I中 W、X、Y和Z各自独立地选自
2.根据权利要求I所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质的用来与所述胶束复合的区域为负电荷区域、极性区域或疏水区域。
3.根据权利要求I或2所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述阳离子型聚合物包括聚{N-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(胆留醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亚乙基)溴化铵]癸二酸酯}。
4.根据权利要求I 3中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质为寡肽、肽、多肽、全长蛋白质、蛋白质片段、蛋白质结构域或融合蛋白。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质为生物活性蛋白质。
6.根据权利要求5所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质包括激素、受体配体、转录因子、转录增强子、 转录抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生长因子、抗体或细胞毒性蛋白质。
7.根据权利要求6所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述生长因子包括神经胶质衍生的亲神经因子，所述细胞毒性蛋白质包括凝集素A，以及所述抗体包括赫赛汀。
8.根据权利要求I 7中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其进一步包含附加的治疗剂。
9.根据权利要求8所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述附加的治疗剂为包含在所述胶束内部的药剂。
10.根据权利要求8所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述附加的治疗剂为复合到所述胶束外部的药剂或核酸分子。
11.一种将蛋白质递送到细胞中的方法，其包括 使根据权利要求I 10中任一项所述的胶束-蛋白质复合物与细胞接触以使所述胶束-蛋白质复合物被吸收到细胞中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述细胞为体外细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述细胞为体内细胞，并且所述方法包括向被试者施用所述胶束-蛋白质复合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述被试者是人。
15.根据权利要求11 14中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为生物活性蛋白质并且在递送到细胞中后保持生物活性。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求I 10中任一项所述的胶束-蛋白质复合物。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其进一步包含可药用的载体。
18.根据权利要求I 10中任一项所述的胶束-蛋白质复合物用于将蛋白质递送到被试者的细胞中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述被试者是人。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中，所述蛋白质为生物活性蛋白质并且在递送到细胞中后保持生物活性。
全文摘要
本发明提供了一种由阳离子型聚合物形成的胶束与蛋白质的复合物以及使用该复合物将蛋白质递送到细胞中的方法。
文档编号A61K38/45GK102895668SQ201210404380
公开日2013年1月30日 申请日期2008年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者杨义燕, 王勇, 阿什林灵智·李 申请人:新加坡科技研究局