专利名称：一种治疗性疫苗佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗性疫苗佐剂，更具体的说，涉及一种治疗性疫苗佐剂的组合物，其包含的抗白细胞介素10受体通过静电作用或π-π堆垛等物理作用吸附在氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)上。
背景技术：
慢性感染某些病毒可以引起癌症。感染人乳头瘤病毒可以引起宫颈癌，而乙型肝炎病毒感染与肝癌的发生有关。目前此类疾病尚无特效治疗药物。虽然预防慢性病毒感染的疫苗，如乙型肝炎病毒(HBV)疫苗、人乳头瘤病毒疫苗(HPV)已经在临床应用，但是针对已经感染慢性病毒病人的治疗性疫苗的研究，仍然处于起步阶段。治疗性疫苗是有效治疗慢性病毒感染所致癌症的研发热点和难点。治疗性疫苗至少由2种成分构成，其一是特异性抗原，其二是免疫佐剂，两种成分都会影响治疗性疫苗的治疗效果，因此，佐剂的研发在治疗性疫苗的发展中起至关重要的作用。·慢性病毒感染和肿瘤的发生、发展是其与机体免疫系统长期对抗的结果。为避免被机体免疫系统清除，病毒感染和肿瘤微环境逐渐发展成不利于免疫细胞功能的免疫抑制区。这一环境包括抑制细胞如调节T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、抑制性树突细胞；免疫抑制因子如IL10、TGFii等；肿瘤细胞膜上抑制分子如ro-i在肿瘤细胞的表达。机体产生的这些对病毒或肿瘤抗原的无效的体液和细胞免疫反应，往往可抑制固有和特异性免疫反应，影响治疗性疫苗的效率。研究发现乳头瘤病毒抗原暴露的小鼠可抑制治疗性疫苗细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。PV LI核壳蛋白(LlVLPs)致敏(prime)的小鼠，在接种携带HPV16E7CTL，HIV CTL决定簇的PV嵌和型LI的蛋白(L1E7，L1P18)治疗性疫苗后，与未致敏小鼠相比，其E7、HIV P18特异性的CTL细胞分泌IFN Y受到抑制。不同研究小组也观察到同样的现象。如果PV LI蛋白致敏(primed)的小鼠是ILlO缺陷鼠，在接种携带HPV16E7CTL决定簇的PV嵌和型LI的蛋白治疗性疫苗后，与未致敏小鼠相比，其E7特异性的CTL细胞产生IFN Y则不受到抑制。如果在免疫致敏小鼠时同时阻断IL10，E7特异性CTL也不受到抑制。DNA疫苗免疫时阻断IL10，可以提高疫苗诱导的T细胞反应，清除小鼠LCMV病毒感染。综上所述，ILlO与慢性病毒感染密切相关，治疗性疫苗如果在免疫时阻断IL10，可以提高疫苗诱导的T细胞反应，提高慢性人乳头瘤病毒感染治疗性疫苗的效率，清除慢性病毒感染，阻断宫颈癌的发生。类似的研究发现阻断IL10、肿瘤局部注射Toll样受体配体CpG可以抑制小鼠肠癌细胞、黑色素瘤细胞的生长。氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)是一种碳纳米材料，由石墨经化学氧化形成。GO由单层碳原子组成，边缘含有大量的羰基、羧基等含氧活性基团，可提供了一个PH依赖的阴性电荷表面和胶体稳定性，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，同时有利于化学功能化修饰，以达到在不同领域应用的目的。由于单原子层两个基面都可以吸附，具有其他纳米材料无法比拟的超高载药率，因此，微量GO可以吸附更多的药物、抗原或免疫刺激因子。有报道GO被用于承载化疗药物5-FU和阿霉素，可使药物缓慢释放，且发现荷瘤小鼠静脉注射GO，GO能蓄积在肿瘤部位，表明局部给予GO和化疗药物，比单独给予化疗药物，可以更长时间的维持免疫刺激强度和抗肿瘤药物浓度。GO对机体是安全的，小鼠静脉注射250 yg G0，也没有观察到明显副作用，具有良好的生物安全性。研究表明GO也可以有效地吸附单链DNA(ssDNA)，保护ssDNA免受酶的降解，这一特性提示GO可连接CpG，CpG是Toll样受体9的配体，常常作为佐剂和用来打破免疫抑制的环境。GO可以吸附化疗药、ssDNA、CpG等，使得GO可以成为一个可以打破免疫抑制环境的很好的候选载体。本发明采用GO吸附抗白细胞介素10受体抗体的治疗性疫苗佐剂，尚未见文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是采用GO吸附抗白细胞介素10受体抗体的治疗性疫苗佐剂，以作为慢性病毒感染性疾病及肿瘤等的治疗性疫苗的佐剂，例如人乳头瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌症等，这些疾病的治疗需要特异性细胞免疫应答以清除受感染的细胞或肿瘤细胞。本发明的技术方案是一种治疗性疫苗佐剂，其特征在于所述佐剂由氧化石墨烯·(GO)通过静电或-Ji堆垛等物理作用吸附抗白细胞介素10受体(anti-IL10R)抗体组成，其中GO和anti-IL10R的重量比为2 3。所述治疗性疫苗佐剂的疫苗类型包括T细胞疫苗、树突状细胞疫苗、多肽疫苗及核酸疫苗等，基于或主要基于细胞毒性T细胞(CTL)表位的疫苗。所述治疗性疫苗佐剂可应用于动物，也可应用于人体，特别适用于人乳头瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌症等治疗性疫苗中，可作为艾滋病、流感、结核、疟疾等其他需要细胞免疫应答的疾病的治疗性疫苗的佐剂。由于慢性病毒感染或肿瘤患者往往存在不同程度的免疫缺陷或免疫耐受，治疗性疫苗的目的是打破免疫耐受微环境，重建免疫应答，以清除受病毒感染的细胞或肿瘤细胞。治疗性疫苗普遍存在免疫原性弱等缺点，因此选择能增强机体免疫应答的佐剂显得就尤为重要。本发明研究证实，在慢性人乳头瘤病毒治疗性疫苗免疫时阻断IL10，可以提高疫苗诱导的T细胞反应，打破免疫耐受，而碳纳米材料GO强大的吸附能力可以吸附抗ILlO受体，不改变吸附抗体或刺激因子活性，并使承载的抗体和细胞因子长时间停留在免疫抑制微环境中，维持免疫刺激强度。在此系列研究基础上，本发明研制出一种可增强治疗性疫苗免疫应答的佐剂。即将碳纳米材料GO和抗白细胞介素10受体抗体按一定比例混合，使抗白细胞介素10受体抗体吸附在碳纳米GO材料上。研究结果表明，GO可以吸附抗IL-10受体抗体。吸附在GO上的抗IL-10受体抗体以PH依赖的方式缓慢释放，吸附的抗IL-10受体抗体在体内和体外均有生物活性。GO吸附抗IL-10受体抗体可以作为治疗性疫苗的佐剂，并运载到病毒感染细胞或肿瘤部位打破机体的免疫抑制环境。
图1，GO可以吸附Anti-ILlOR抗体。图2，吸附在GO上的Anti-ILlOR抗体体外可控释放。图3，G0/Anti-IL10R抗体体外可以提高LPS刺激的小鼠脾细胞产生IL_12p40水平。
图4，G0/Anti-IL10R抗体在体内有生物活性。
具体实施例方式实施例IGO可以吸附抗小鼠IL-10受体抗体。为了研究GO是否可以吸附IL-10受体(anti-IL10R)抗体，在200μ I G0(3mg/ml)中加入150μ I抗小鼠anti-IL10R抗体(6mg/ml)，涡漩混勻，然后4°C吸附过夜。PBS洗3次去除未吸附的抗体，IOOOOrpm离心5min后用200 μ I PBS重悬微粒。显微镜下观察GO/anti-IL10R颗粒变得更大和聚集，见图1A，PBS重悬后上清中可检测到蛋白，见图1B，提示anti-IL10R抗体可被吸附在GO上。采用直接ELISA法测定GO吸附的抗体。即每孔分别加入含有10 μ I GO、GO/anti-IL10R 和不同浓度 anti-ILlOR 抗体的 ELISA 包被液(ebioscience,美国)100 μ 1， 包被 ELISA 板(Nunc，丹麦)，4°C 过夜。0. I % PBST 洗涤 5 次后加 ELISA assay dilutebuffer (ebioscience,美国)室温下阻断Ih,再用0. 1% PBST洗漆5次后每孔加入100 μ II 1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP (Sigma，美国)，室温下孵育lh。每孔加入100 μ I IXTMB底物(ebioscience,美国)，避光显色后用stop buffer (ebioscience,美国)终止反应。在450nm波长处用酶标仪(Spectramax,美国)测量各孔的吸光度。包被G0/anti-IL10R抗体的孔可以检测到抗大鼠抗体，而包被GO的孔检测不到抗大鼠抗体，证实GO可以吸附抗小鼠anti-IL10R 抗体，见图 1A。进一步米用Western Blot测定抗大鼠抗体抗体和Y干扰素IFN Y。即取10 μ IG0/anti-IL10R、IFN Y及相应对照品，加入SDS-PAGE上样缓冲液后上样，12% SDS-PAGE凝胶电泳(Bio-Rad公司，美国)后转移到PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)，再用I : 1000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体来结合抗小鼠anti-IL10R抗体或I : 250稀释的大鼠抗小鼠IFNy抗体来结合小鼠IFNy，结合了小鼠IFNy的一抗再用I : 1000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体(二抗)(Sigma公司，美国)孵育PVDF膜来结合,最后发光鉴定(Amersham,Arlington Heights,以色列)。在G0/Anti-IL10抗体中可以检测到anti-IL10R抗体,而G0/IFN Y不能检测到，进一步证实GO可以吸附anti-IL10R抗体，见图1B。根据本研究的实验资料，3mg GO可以吸附I I. 5mg anti-ILlOR抗体，同样的,通过ELISA和Western Blot检测证实GO可以吸附IFN Y，I μ g GO可以吸附60pg IFN Y，见图1C。实施例2吸附在GO上的Anti-ILlOR抗体以PH依赖的方式缓慢可控释放。G0/anti-IL10R抗体被加入不同PH的PBS和DMEM培养基中，保持在37°C，缓慢旋转。在不同时间点收集上清，采用总蛋白测定方法来检测被释放到PBS中的anti-IL10R抗体。结果不同时间点收集的上清中均没有检测到蛋白，考虑到释放的量太少，超过了总蛋白测定方法的检测极限，见图2A。采用检测灵敏度更高的Western blot对上清进行检测，结果上清可以检测anti-IL10R抗体，在PH 6时信号最强，结果表明吸附在GO上的anti-IL10R抗体以PH依赖的方式缓慢释放，见图2B。肿瘤的微环境往往低PH，而Anti-ILlOR抗体的释放的量在低PH比pH7. 4更大，提示在肿瘤部位应用GO吸附Anti-ILlOR抗体可有更好治疗效果。实施例3GO/anti-ILIOR抗体体外可以提高LPS刺激的小鼠脾细胞产生IL_12p40和IFN-Y水平，GO吸附anti-ILlOR和IFNy在激发免疫应答方面有协同作用。C57BL/6小鼠腹腔用IOOng LPS刺激，取I X IO6脾细胞，分别用I μ I GO, GO/对照抗体，60/&11衍-11^101 (60&)，60/正^^ (GOb)和 G0/anti IL10R/IFNy (GOc)刺激处理，用ELISA法测定刺激后小鼠脾细胞体外产生IL12p40和IFN- Y的水平。GO不能刺激小鼠脾细胞产生IL12，LPS可刺激脾细胞产生IL12p40，中和ILlO可以提高IL12p40的产生。GO/Anti-ILlOR抗体能够提高脾细胞产生IL12p40和IFN-Y的水平，表明吸附的anti-IL10R抗体在体外有生物活性，见图SA15Anti-ILlOR抗体和IFNy被同时吸附在GO上，吸附在GO/anti-IL10R 上的 anti-IL10R 抗体浓度与 G0/Anti-IL10R/IFN Y 中的 anti-IL10R 抗体浓度均是相同的，为1.5mg/ml。G0/Anti-IL10R和G0/IFN Y均能提高LPS刺激小鼠脾细胞产生IL12p40的水平，而当GO同时吸附anti-IL10R和IFN Y，脾细胞可产生更多的IL12p40，采用流式检测⑶llc+MHC 11+树突状细胞⑶86的表达(MFI)较单独G0/Anti_IL10R、GO/·IFNy要高，见图3B。GO吸附anti-IL10R和IFN Y在激发免疫应答方面有协同作用，可以诱导产生更强的免疫应答强度。实施例4G0/Anti-IL10R抗体在体内有生物活性，且GO吸附的Anti-ILlOR抗体比未吸附的Anti-ILlOR抗体更能提高疫苗的T细胞免疫反应。C57BL/6 (H_2b)雌性小鼠，6_8周，购自中山大学实验动物中心。每组小鼠5只，皮下采用50 μ g OVA+15 μ gLPS致敏，7天后进行激发免疫，分别皮下注射 50 μ g0VA+15μ gLPS+10μ 1G0,50 μ g0VA+15μ gLPS+10μ lG0/anti-IL10R,50 μ gOVA+15 μ gLPS+10 μ Ianti-ILlOR, 50 μ g0VA+15 μ gLPS+NRS (正常大鼠血清)。6 天后取小鼠脾细胞，采用ELISP0T方法检测特异性CD8+T细胞应答。即单个脾脏细胞或淋巴结悬液加入预先包被了抗IFN- Y抗体(BD Harlingen公司，美国)膜上96孔板(Millipore公司，美国)，然后加入不同浓度的多肽，多肽与细胞在37°C作用18小时后，加入生物素化的抗IFN- Y抗体(BD Harlingen公司，美国)，亲和素-辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich公司，美国)和DAB (Sigma-Aldrich公司，美国)来检测抗原特异性分泌IFN- Y的细胞，结果通过 ELISP0T 计数仪 ELR02 (AIDAutoimmun Diagnosticka GMbH 公司，德国)来计数。结果表明小鼠采用G0/anti-IL10R较单独anti-ILlOR抗体，激发更多OVA特异性的⑶8+T细胞应答，表明吸附在GO上的G0/anti-IL10R抗体在体内具有生物活性。见图4。
权利要求
1.一种治疗性疫苗佐剂，其特征在于所述佐剂由氧化石墨烯(GO)通过静电或π-π堆垛等物理作用吸附抗白细胞介素10受体(anti-IL10R)抗体组成，其中GO和anti_IL10R的重量比为2:3。
2.根据权利要求I的治疗性疫苗佐剂，所述疫苗类型包括T细胞疫苗、树突状细胞疫苗、多肽疫苗及核酸疫苗等，基于或主要基于细胞毒性T细胞(CTL)表位的疫苗。
3.根据权利要求I的治疗性疫苗佐剂，所述佐剂可应用于动物，也可应用于人体，特别适用于人乳头瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌症等治疗性疫苗中，可作为艾滋病、流感、结核、疟疾等其他需要细胞免疫应答的疾病的治疗性疫苗的佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种治疗性疫苗佐剂。所述佐剂由碳纳米材料氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)吸附抗白细胞介素10受体抗体组成。氧化石墨烯GO吸附的抗白细胞介素10受体可以打破免疫抑制环境，提高治疗性疫苗诱导的特异性T细胞应答。碳纳米材料GO吸附的抗白细胞介素10受体缓慢释放，维持免疫刺激强度。因此，本发明的佐剂可以作为慢性病毒感染性疾病及肿瘤等的治疗性疫苗的佐剂。例如人乳头瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌症等，这些疾病的治疗需要特异性细胞免疫应答以清除受感染的细胞或肿瘤细胞。
文档编号A61P37/04GK102872458SQ201210410638
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者王跃建, 刘晓松, 倪国颖, 陈姝, 张斌, 吴校连 申请人:佛山市第一人民医院, 刘晓松