专利名称：靶向HIV-1特异siRNA生物纳米粒及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有Hiv-I特异基因沉默作用的SiRNA生物纳米粒，本发明还涉及所述生物纳米粒的制备方法，以及在制备防治艾滋病药物方面的应用。
背景技术：
基因治疗是当前艾滋病治疗的新方法。RNA干扰(RNA interference, RNAi)又称为依赖于RNA的基因沉默机制，是通过双链RNA (double-strand RNA, dsRNA)特异性地抑制与其序列同源的靶基因mRNA表达的现象。即在胞质中，双链RNA引发了同源mRNA的降解，故也被称为转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。RNAi治疗AIDS的研究现状
siRNAs或miRNAs可以特异地结合靶mRNA，弓I起靶mRNA降解或翻译抑制，最终导致基因特异性沉默。RNAi技术很可能为抗HIV治疗的研究打开突破口。基因沉默靶点的确立HIV-I基因组编码区由9个开放读框组成，包括3个结构基因(gag、pol、env),2个调节基因(tat、rev)和4个辅助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非结构基因曾被认为不是HIV-I病毒复制所必需的“非必需基因”，但是近年来越来越多的研究表明HIV-I的非结构基因在病毒的致病机理、感染性、潜伏上都有着重要的作用，因此本发明将非结构基因作为抗病毒治疗的靶点。HIV-ITat蛋白不仅参与反式激活病毒的表达，还参与AIDS相关疾病的病理机理，如神经毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-I的病毒复制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以与Rev应答元件(Rev response element, RRE)结合,介导未拼接和不完全拼接的mRNA从胞核向胞浆内的转运，促进病毒结构蛋白和酶的合成，引发HIV基因表达由早期向晚期的转换。Vpr可以在病毒复制的早期，反式激活HIV-1LTR，促进病毒基因的表达；介导和增强整合前复合体的核转运；改变细胞基因的表达，诱导细胞周期G2/M期阻滞及细胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多妝样蛋白 3G(human protein apoliproteinB mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike~3G, AP0BEC3G)的抗病毒活性，增强 HIV-1 毒粒的感染力。研究显示，HIV的gag和nef基因均可以通过RNAi进行沉默，RNAi方法治疗艾滋病已经成为艾滋病治疗研究的热点，研究显示通过RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV复制。但其技术本身仍存siRNA稳定性差、容易降解、无靶向性等问题。以重组病毒载体方式导入的siRNA虽然稳定性较高，但是又带来导入效率及载体基因整合等问题。人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潜能，自身免疫原性低，取材方便。目前美国FDA已经批准其用于自身免疫疾病及基因治疗载体等多个方面的临床试验。
发明内容
本发明的目的是筛选出针对HIV-I非结构基因vpr，tat, vif, rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并将这些siRNAs序列构建到慢病毒载体，在干细胞及其他传代细胞中进行表达，制备一种含有对HIV特异性沉默的SiRNA的生物颗粒，以用于制备预防和治疗艾滋病的药物。本发明提供了一种靶向Hiv-I特异性SiRNA慢病毒为载体间充质干细胞内表达的siRNA生物纳米粒，经体外HIV活病毒攻击实验证实，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治疗。本发明有如下创新点其一，本发明首次发现了可使HIV-I非结构基因vpr，tat, vif, rev基因沉默的6个siRNAs序列本发明人针对HIV-I病毒基因组的vpr, tat, rev, vif基因的保守区域设计了 14条干扰RNA序列，经实验筛选，发现其中以下6条siRNA序列可以特异地靶向HIV-lvpr， tat, vif,rev
靶向siRXAs序列名称卬列兮序列
vprVpr—sh4SEQ ID MO: I gagtgaagc t gt tagacat
tatTat-1x4SEQ II) NO;2 gtgttgctttcattgccaa
Tal、rev tat and rev-1x6 SEQ ID NO:3 gacicaicaagcticicia
revrev-Ixl ISKQ ID XO:4 ggtggaatctcctacagta
￥ifvilMSEQ ID NO:5 tatcaagcaggacataaca
VifVif-2SEQ ID NO:6 agagactggcatttgggtc其二，本发明构建了含有HIV env基因的重组慢病毒载体，筛选到能够稳定表达HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env细胞系。该细胞系的名称为XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏号为XXXX所述细胞系可用于制备siRNA的生物纳米粒。由于gpl20蛋白对⑶4分子具有亲和性，使制备的siRNA生物纳米粒具有靶向性。其三，本发明制备了一种含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒该生物纳米粒载有上述靶向HIV-I特异性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQID NO:I SEQ ID NO:6。该生物纳米粒还具有以下特征I)大小在 10_500nm 之间；2)具有人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜；3)镶嵌病毒的膜蛋白gpl20。本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率。经此实验证实，该生物纳米粒可作为药物直接用于治疗和预防艾滋病。其五，本发明提供了上述含有HIV特异性siRNA的间充质干细胞生物纳米粒的制备方法
方法是将含有上述siRNA序列(I 6个)的双链DNA构建到永久性表达目的基因的重组慢病毒载体中，在293T细胞中包装出重组慢病毒；用收获的重组病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素筛选出表达siRNA的hMSC细胞系，经筛选表达siRNA的hMSC细胞系可以持续高效的表达siRNA ;体外连续收获细胞培养液，超速离心浓缩，获得含有siRNA的生物纳米粒。本发明的优点和效果本发明结合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的稳定性的同时避免载体整合带来的安全性问题。具体而言，选用针对HIV特异性的siRNA，以携带特异性的siRNA重组慢病毒将其导入到永生化的间充质细胞中，在细胞内转录复制，以吐胞的形式将带有永生化间充质细胞膜的siRNA生物纳米粒分泌到细胞外，经过浓缩纯化后，用于HIV-I的基因治疗。本发明方法提供的含有HIV特异性siRNA的生物颗粒具有以下优点
I、提高了稳定性利用生物膜包被的方式提高了 siRNA的稳定性；2、提高了安全性，适用范围广本方法与现有技术的病毒载体导入方式相比又大大提高了安全性。其中间充质干细胞制备的颗粒具有较为广泛的组织亲和性，同时免疫原性较低，从而适用范围更加广泛;3、更具有靶向性针对siRNA无靶向性的问题，本发明还构建了稳定表达HIV-1gp 120蛋白的永生化的间充质细胞株，由于gpl20蛋白对CD4分子具有亲和性使得制备的siRNA生物颗粒具有靶向性。4、可抑制HIV活病毒本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率，证实了其可直接作为防治艾滋病的药物，以及在HIV基因治疗方面具有的其它潜在价值。
图I是siRNA/miRNA真核表达载体结构图；A: siRNA/miRNA 真核表达载体 pSR-GFP/Neo ；B siRNA/miRNA 真核表达载体 pcDNA6. 2Gff/EmGFP-miR)；图2为倒置荧光显微镜下观察vpr特异性siRNA对GFP-Vpr融合蛋白表达的抑制情况；图3为流式细胞仪检测vpr特异性siRNA对GFP-Vpr融合蛋白表达的抑制作用，图中纵轴为抑制率(％)，横轴为siRNA样品编号；图4为实时荧光定量PCR技术对vpr mRNA拷贝数进行相对定量；图5为vpr特异性siRNA抑制假病毒在TZMBL细胞中的感染力(图中点为蓝斑)；图6为倒置突光显微镜下观察vpr特异性miRNA对Vpr_dsRed融合蛋白表达的抑制作用，图中control中细胞发出红色荧光；
图7为倒置荧光显微镜下观察tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用，图中亮点为细胞发出的红色荧光；图8为流式细胞仪检测tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用图中纵轴为抑制率(％)，横轴为siRNA样品编号；图9为Western Blot检测tat特异性siRNA对Tat-dsRed融合蛋白表达的抑制作用，图中上面条带为tat-red融合蛋白(40KD)，下面条带为GAPDH蛋白(39KD)；图10为实时荧光定量PCR技术对tatmRNA拷贝数进行相对定量，图中纵轴为抑制率(％)，横轴为对照和siRNA样品编号；图11为tat特异性siRNA抑制假病毒在TZMBL细胞中的感染力，图中纵轴为抑制率(％)，横轴为tat-siRNA样品编号，白色柱状图siRNA量为O. I μ g，灰色图siRNA量为
O.2μ g ； 图12为Western Blot检测tat特异性miRNA对Tat-daRed融合蛋白表达的抑制作用；图13为构建的重组慢病毒plvx-shRNAl和plvx_shRNA2 ；图14为建立的稳定表达siRNA间充质干细胞系；生物材料保藏信息保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏物名称稳定表达gpl20和gp41的间充质干细胞系hMSC_env保藏编号CGMCCNO. 6707保藏日期2012-10_2具体实施例方式以下实施例中所用的试剂、质粒等来源如下
权利要求
1.一种生物纳米粒，含有靶向Hiv-I特异性siRNA，所述SiRNA选自SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6所示序列的I 6种。
2.权利要求I所述的生物纳米粒，还具有以下特征 1)大小在10-500nm之间； 2)具有人间充质干细胞(HumanMesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜； 3)镶嵌病毒的膜蛋白gpl20。
3.权利要求I或2所述的生物纳米粒使HIV-I非结构基因沉默的功能，所述非结构基因选自vpr, tat, vif或rev中的一种或多种。
4.权利要求I或2所述的生物纳米粒在制备治疗和预防艾滋病药物中的应用。
5.权利要求I所述的生物纳米粒的制备方法，将含有SEQID NO: I SEQ ID N0:6所示序列的I 6种的双链DNA构建到永久性表达目的基因的重组慢病毒载体中，在293T细胞中包装出重组慢病毒；用收获的重组病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素筛选出表达siRNA的hMSC细胞系，经筛选表达siRNA的hMSC细胞系可以持续高效的表达siRNA ;体外连续收获细胞培养液，超速离心浓缩，获得含有siRNA的生物纳米粒。
6.SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6 所示序列的 siRNAs。
7.权利要求6所述siRNAs的功能，是使HIV-I非结构基因沉默，每个siRNA针对的靶向HIV-I非结构基因如下所示
8.一种可表达HIV-I跨膜蛋白gpl20hMSC-env细胞系，名称为hMSC-env，保藏编号为CGMCC NO. 6707。
9.权利要求8所述细胞系在制备siRNA的生物纳米粒中的应用。
全文摘要
本发明获得了一种含有靶向HIV-1特异性siRNA的生物纳米粒，该生物纳米粒具有HIV-1特异基因沉默作用。所述siRNA选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6种。本发明在人CD4+T淋巴细胞和人造血干细胞(Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC)中检测了获得的生物纳米粒对HIV活病毒的抑制效率，证实了其可直接作为防治艾滋病的药物。
文档编号A61P31/18GK102895675SQ20121041050
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者滕智平, 马晶, 郝彦哲, 杨怡姝, 孙晓梅, 曾毅 申请人:曾毅, 滕智平, 杨怡姝