专利名称：治疗病毒感染的靶向给药组合物及方法
技术领域：
本发明概括地涉及生物活性材料领域。更具体而言，本发明所涉及的生物活性材料适用于治疗包括人类细胞在内的应激的细胞，特别是受病毒感染应激的细胞。
背景技术：
在治疗过程中与药物有关的两个常见问题是药物毒性问题和抗药性问题，药物毒性使患者身体虚弱；出现抗药性问题时则需要更大剂量的药物，从而放大了药物毒性的问题，由此经常导致死亡。解决药物毒性的一个方法是仅对染病细胞靶向给药。许多研究者正在致力于开发用于转运药物的抗体并取得了可喜的进展。但抗体也并非是不存在问题的，例如，抗体常常与正常组织结合，而且它们也会损伤血管(如血液渗漏综合症)或造成严重的变态反应(如过敏)。
对于恶性肿瘤细胞，利用药物，包括对这些细胞具有毒性的药物进行治疗已不是什么新鲜事。Faulk的美国专利4,886,780；4,895,714；5,000,935；和5,108,987以及Stjernholm等人的美国专利4,590,001中描述了将细胞毒性材料或造影成像材料缀合于蛋白、主要是运铁蛋白上，用于治疗肿瘤细胞或使肿瘤细胞显影的方法。这些专利公开了制造和使用这些材料的有效方法。
众所周知，应激细胞，如受病毒感染或肿瘤侵袭的人类细胞，需要更多的营养物质，例如铁等物质。细胞通过增加营养物质载体的受体的数目来增加这些营养物质的传输量，例如，就铁而言其营养物质载体为运铁蛋白。现在已弄清楚在应激细胞中，营养物质载体之受体数量的增加相对保持恒定，并且增加的幅度也要大于非应激细胞，而在非应激细胞中，受体数量的增加为间歇式的，并且增加的幅度相对较小。上述专利以及其他一些文献公开了利用肿瘤细胞中受体、特别是运铁蛋白受体数量增加这一现象，将造影成像材料或药物或者将两种材料同时转运至应激细胞内。
现尚无一项研究去探究是否所有的应激细胞均上调了运铁蛋白受体的数量，而所有正常细胞均下调了运铁蛋白受体的数量，但是来自各方面的数据说明所有正常细胞均下调了运铁蛋白受体的数量。例如，未成熟的红细胞(即正母红细胞和网状细胞)在其表面上存在运铁蛋白受体，但成熟红细胞中没有(Lesley J，Hyman R，Schulte R和Trotter J.鼠科造血祖代细胞中的运铁蛋白受体的表达.Cell Immunol 1984；8314-25)。循环系统中的单核细胞也没有上调运铁蛋白受体的数量(Testa U，Pelosi E和Peschle C.运铁蛋白受体.Crit RevOncogen 1993；4241-276)，而巨噬细胞(包括肝巨噬细胞)通过噬红细胞作用以运铁蛋白依赖性的方式获得所需的大部分铁(Bothwell T A，Charlton RW，Cook JD和Finch CA.人体的铁代谢，Blackwell Scientific，Oxford，1979)。事实上，体内研究表明网状内皮系统几乎不从血浆运铁蛋白中得到铁(有关综述参见Ponka P和Lok CN.运铁蛋白受体在健康和疾病中的作用，Int J BiochemCell Biol 1999；311111-1137)。细胞因子如γ干扰素下调了巨噬细胞运铁蛋白受体的数量(Hamilton TA，Gray PW和Adams DO.体外试验中采用γ-干扰素可以调控鼠腹膜巨噬细胞中的运铁蛋白受体表达，Cell Immunol 1984；89478-488)，推测这种限制铁吸收的机制可以作为杀灭细胞内寄生物的一种解释(Byrd TF和Horowitz MA.γ-干扰素激活的人类单核细胞下调运铁蛋白受体数量以及通过限制铁吸收抑制胞内Legionella pneumophila的生长，J ClinInvest 1989；831457-1465)。
在休眠的淋巴细胞中，不仅运铁蛋白受体数量被下调，而且也检测不到运铁蛋白受体的基因(Kronke M，Leonard W，Depper JM和Greene WC.与人类T型淋巴细胞生长和分化有关的连续基因表达.J Exp Med 1985；1611593-1598)。与之相反，受激淋巴细胞在G1后期上调了运铁蛋白受体的数量(Galbraith RM和Galbraith GM.促分裂原刺激的人类外周血液淋巴细胞中运铁蛋白受体的表达细胞激活和相关代谢事件的关系.Immunology 1983；133703-710)。随c-myc原致肿瘤基因的表达以及随后的IL-2受体的上调，出现了运铁蛋白受体的表达(Neckers LM和Cossman J.促分裂原刺激的人类外周血液淋巴细胞中运铁蛋白受体的诱导是DNA合成和细胞分化所必需的并且受白介素-2的调控.Proc Nat Acad Sci USA 1983；803494-3498)，同时伴随铁调控蛋白结合能力的明显增加(Testa U，Kuhn L，Petrini M，Quaranta MT，Pelosi E和Peschle C.激活淋巴细胞和单核细胞-巨噬细胞提取液中铁调控元素结合蛋白的差动调控.J Biol Chem 1991；2663925-3930)，这种增加稳定了运铁蛋白受体的mRNA(Seiser C，Texieira S和Kuhn LC.白介素-2依赖的运铁蛋白受体mRNA的转录和转录后调控.J Biol Chem 1993；26813,074-13,080)。对于T型和B型淋巴细胞这种现象均存在(Neckers LM，Yenokida G和James SP.运铁蛋白受体在人类B型淋巴细胞激活中的作用.JImmunol 1984；1332437-2441)，并且是一种IL-2依赖的应答(Neckers LM和Trepel JB.运铁蛋白受体表达和细胞生长的控制.Cancer Invest 1986；4461-470)。
在上述文献中研究最为深入的材料是运铁蛋白-多柔比星缀合物，多柔比星是一种众所周知的有效细胞毒性分子。尽管多柔比星可有效抑制肿瘤，由于其心血管毒性是累积性的，所以就每个患者而言，多柔比星有一个最大的总剂量。已经发现运铁蛋白-多柔比星缀合物在令人吃惊的低剂量条件下就可以有效杀灭人体中各种类型的肿瘤细胞，包括抗药性的肿瘤细胞。
对于严重的病毒感染，如人免疫缺陷病毒(HIV)的感染，已知的现行治疗方法包括阻断病毒赖以进入细胞的细胞受体；干扰融合机制；以及干扰被病毒抢夺的细胞酶，如蛋白酶和逆转录酶。这些治疗方法以及其中所采用的药物虽管可以延长严重患病者的生命，但却不能完全治愈。众所周知，这些材料售价昂贵，世界上的很多地方都承担不起。此外，采用这些材料治疗所伴生出的复杂的给药方案和不良的副作用也给患者带来了担负。
因此，对于一些大家普遍关注的疾病，如HIV感染所导致的AIDS，需要治疗它们的材料，由于费用更低并且副作用更少，这些材料显得更为有效。对于其他一些造成社会负担的各种病毒，如细胞巨化病毒、腺病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒等所导致的病毒感染，对其治疗材料也存在着现实的需求。此外，对于能够杀灭这些病毒或者能够杀灭多种恶性肿瘤同时又完全不必使用细胞毒性材料的药物也存在着现实的需求。
当前FDA批准的所有治疗AIDS的药物均被设计用来进攻HIV在T型淋巴细胞内生命周期的特定阶段(De Clercq，Clin Microbiol Rev 1995；8200)。因此，为取得对抗AIDS战斗的胜利，现在药学中只有两种办法。其一是使用逆转录酶抑制剂(核苷类药物和非核苷类药物)，以便在RNA反专录为DNA期间阻断病毒的复制(Cratlin等人，Virology 1998；24487)。所有核苷类逆转录酶抑制剂均为前药，需要在细胞内代谢成为活性的三磷酸类似物(Lavie等人，Nature Med 1997；3922)，而且使用它们经常会出现抗药性的问题(Hazuda& Kuo，Nature Med 1997；3836)。另一种方法涉及与病毒体成熟期间gag和gag-pol多蛋白加工有关的蛋白酶的抑制剂(Gulnik等人，Vit & Hormones.2000；58213)，但是使用蛋白酶抑制剂治疗也经常出现抗药性(Olsen等人，JBiol Chem 1999；27423699)。出现抗药性是抗病毒药物所面临的主要问题之-(Calvez，Antiviral Therapy 1998；3(Supp 14)5)。
除基于病毒生命周期进行设计的经典药物之外，另外一种方法以AIDS病毒宿主细胞-T型淋巴细胞的免疫生物学为基础(Ho等人，Nature 1995；373123)。最近的两项研究认为这是一种有前途的方法。第一，已经证明移植进AIDS患者体内的HIV致敏的CD8 T型淋巴细胞可消除病毒血症(Drodic等人，Nature Med 1999；534)。第二，将带有HIV蛋白酶激活位点的caspase-3酶原转染入HIV感染的T型淋巴细胞中可引发细胞凋亡，但转染入未感染病毒的细胞中则不能引发细胞凋亡(Vocero-Akbani等人，Nature Med 1995；529)。这些报道说明有可能通过选择性杀灭受病毒感染的细胞对HIV感染进行控制。
对于AIDS患者一个已经明确的结论是，这些疾病的免疫缺陷是因为CD4淋巴细胞的缺乏所致，这种细胞是HIV感染的T型淋巴细胞的亚群(Officeof AIDS Research.Ann Intern Med 1998；1281057)。AIDS患者中这些细胞缺乏的原因是病毒引发一个酶介导的程序性细胞死亡的过程，通过所谓的细胞凋亡反应清除这些细胞(Cicala等人，Proc Natl Acad Sci USA 2000；971178)。以血浆HIV RNA水平为指标，病毒杀灭感染细胞后病毒血症加重(Report ofNIH Panel，Ann Inern Med 1998；128(NO.12，pt 2)1057)，当采用抗逆转录病毒的药物杀灭感染细胞时病毒血症减轻(Katzenstein等人，N Engl J Med 1996；3351091)，并且病毒血症减轻伴随有临床症状的改善(O′Brien等人，N Engl JMed 1996；334426)。
Kast等人的美国专利6,242,176公开了一种向乳突瘤病毒感染的细胞中转运药物活性成分的方法。在这种方法中使用了一种复合物，其中包括药物活性成分和可识别CD 16的配体。在配体和细胞中的CD 16充分结合的条件下将这种复合物与乳突瘤病毒感染的细胞接触。药物活性成分被带至感染细胞附近，并被转运至其中。利用这种方法可以将药物活性物质靶向转运至感染细胞中。这样就可以将多种药物活性成分以相对较高的浓度转运至感染细胞中，同时避免了因这些药物作用于正常细胞所引起的相关副作用。
靶向给药的优点在于提高了药效，同时降低了用药量，从而降低了药物的毒副作用并且减轻了正常细胞受损的程度，所有这些作用特点均有效地降低了治疗费用，同时提高了患者看护的质量。靶向给药也避免了抗药性的出现，这是因为抗药性是由于药物非特异性进入细胞所引发的(Marbeuf-Gueye C，Ettori D，Priebe W，Kozlowski H和Garnier-Suillerot A.蒽环霉素摄入的动力学与肿瘤细胞中抗药因子表达多抗药性蛋白或P-糖蛋白间的相关性.BiochemBiophy Acta 1999；1450374-384)。由于运铁蛋白-药物缀合物通过受体特异性的途径特异性地进入细胞(Klausner RD，van Reuswoude J，Ashwell G，KempfC，Schechter AN，Dean A和Bridges K.K562细胞中受体介导的运铁蛋白的胞吞作用，J Biol Chem 1983；2584715-4724；Berczi A，Ruthner M，Szuts V，FritzerM，Schweinzer E和Goldenberg H.多柔比星-运铁蛋白缀合物通过受体介导的运铁蛋白的胞吞作用对K562细胞铁摄入的影响作用，Euro J Biochem 1993；213427-436)，它们可绕过抗药性机制，如抗药性细胞中的外流泵进行传输。
发明内容
本发明提供一种用于治疗病毒如细胞巨化病毒、腺病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒感染的材料。这种材料含有一种针对感染细胞的靶向剂以及一种与靶向剂缀合的成分，其中靶向剂如运铁蛋白和钴胺传递蛋白等，用于结合被感染细胞上调的受体，而靶向剂与受体结合后，与靶向剂连接的成分能够抑制缀合物离开细胞。已经证明这种材料可诱导被病毒感染的细胞发生细胞凋亡。本发明还提供一种治疗受病毒感染患者的方法以及含有这种缀合物的组合物。
图1显示了用运铁蛋白-多柔比星(TR-DOX)缀合物抑制人血液细胞中HIV-1病毒ROJO株的剂量-应答曲线。
图2显示了肝炎B病毒(HBV)感染的人肝脏细胞接触浓度渐增的运铁蛋白-多柔比星(TR-DOX)缀合物所得的剂量-应答曲线。
图3显示了运铁蛋白-多柔比星(TR-DOX)缀合物对于生活在人肺细胞中的细胞巨化病毒(CMV)的作用。
具体实施例方式
采用一种治疗细胞、特别是应激细胞的缀合物可以满足以上讨论的各项需求，在一个实施方案中，这种缀合物含有一种载体和一种与该载体缀合的材料，其中，载体对于应激细胞中表达数量和频度升高的受体具有亲和力，载体与细胞表面中被上调的受体结合后，与该载体缀合的材料能够抑制缀合物离开细胞。
载体可以是任何适用的材料，这种材料对于应激细胞中表达数量和频度升高的受体具有亲和力。优选地，载体为运铁蛋白。
与载体连接的药剂可以是任何一种药剂，只要能购达到增加载体对受体亲合力目的即可。增加亲合力的机制可以不同，例如，药剂与细胞表面的磷脂结合或载体的立体构型重组，只要在载体和受体结合后，这种作用机制的结果可以干扰载体的正常置换即可。当前，最有名的这种药剂就是多柔比星。当然，可以采用任何适用的并可以达到所需效果的材料。
可以采用任何能够防止其相互分离的机制实现药剂和载体的连接，同时最起码要达到在载体进入相应受体的位置后具有加大亲合力的作用。目前对于运铁蛋白-多柔比星缀合物研究最为充分的连接机制是采用戊二醛连接子，但是就载体/药剂连接而言，可以采用任何适用的材料。
本发明基于以下令人吃惊和意想不到的发现已为人所熟知的将多柔比星转运至细胞上用于杀灭细胞的运铁蛋白-多柔比星材料并没有采取常规的多柔比星毒性机制，如DNA插入杀灭细胞。现已发现，与缀合物接触的细胞采取了细胞凋亡式的死亡模式，而不是采取单独采用多柔比星治疗癌细胞时所出现的细胞坏死的模式。
本发明的基础基于以下观察结果病毒血症因循环系统中被感染CD4 T淋巴细胞数目下降而减轻(Betts等人，AIDS Res Hurn Retrovir 1999；151219)，患者的健康状况也因病毒血症的减轻而好转(Wenfurt等人，Medical Care 2000；38404)。有鉴于此，降低病毒负载量的-种机制是使用HIV-1特异性的溶细胞性CD 8 T淋巴细胞(Lubaki等人，J Acquk Imm Def Synd 1999；2219)。另一种去除特定靶细胞的机制是将细胞毒性药物和/或抗逆转录病毒药物的蛋白缀合物靶向转运至表面具有载体蛋白受体的细胞之上，这与以下情况基本类似，已经发现使用人运铁蛋白-多柔比星缀合物可以杀灭表面具有运铁蛋白受体的人肿瘤细胞(Barabas等人，J Biol Chem 1992；2679437)。事实上，运铁蛋白-多柔比星缀合物的结合反应具有显著的特异性，甚至在没有细胞的情况下该缀合物也可以和纯化的运铁蛋白受体结合(Ruther等人，1993；5435)。此外，与未缀合的运铁蛋白和细胞质膜上运铁蛋白受体间的结合相比，运铁蛋白-多柔比星缀合物和细胞质膜上的运铁蛋白受体结合更为强烈，这可能是因为缀合物与质膜中的成分间存在其他相互作用(Szuts等人，J Receptor Res1993；131041)。
本发明采用了人运铁蛋白的药物缀合物，用于向被病毒如HIV感染的细胞靶向给药。本发明有效的主要原因是HIV感染的CD4 T型淋巴细胞上调了细胞表面上运铁蛋白受体的数量(Ohno等人，Virolgy 1997；238305)。此外，运铁蛋白的药物缀合物之所以能够有效对抗HIV感染的T型淋巴细胞还有其它几个原因。其一，包括多柔比星在内的许多细胞毒性药物(Ferraro等人，Cancer Res2000；601901)可诱导细胞凋亡(Debatin，Tox Lett 2000；112/11341)，说明多柔比星-运铁蛋白缀合物是诱导运铁蛋白受体数量上调的细胞凋亡的有效缀合物。其二，运铁蛋白受体的激活，如采用运铁蛋白-多柔比星缀合物激活与药物诱导的细胞凋亡有关(Leardi等人，Brit J Haematol 1998；102746)，而且与钙离子通道控制相关(Sainte-Marie等人，Eur J Biocherm 1997；25068987)，钙离子通道的控制被认为与细胞凋亡的效应器途径有关(Lepple-Wienhues等人，Proc Natl Acad Sci USA 1999；9613795；以及Hueber，NatureCell Biol 2000；2E23)。其三，虽然运铁蛋白受体和诱导细胞凋亡的Fas受体(APO-1/CD 95)位于细胞表面(Findley & Zhou，Leukemia 1999；13147)，但是当运铁蛋白缀合物被转运至运铁蛋白受体上调的细胞上之后，缀合物被结合并最终被胞吞(Berczi等人，Eur J Biochem 1993；213427)，从而利用细胞表面以及细胞内被激活的机制为杀灭细胞提供了可能性(Barabas等人，J BiolChem 1992；2679437)。
从体内清除T型淋巴细胞的免疫生物学方法是引发一个被称为细胞凋亡的程序性细胞死亡的途径(Pinkoski & Green，Cell Death & Dif 1999；61174-1181)。在胸腺或外周循环系统中可以发生这种现象(Le Bon等人，IntImmunol 1999；11373)。虽然细胞凋亡有几种机制，它们都起到了从体内清除特定细胞的作用(Martinez & Kraus，Int Rev Immunol 1999；18527)。本发明是一种清除被HIV感染的T型淋巴细胞的新方法。这种方法的策略是通过经细胞凋亡的克隆缺失清除被感染的T型淋巴细胞。采用向被感染细胞靶向给药细胞毒性和/或抗逆转录病毒药物的药物-蛋白缀合物可以达到这一目标。
本发明缀合物靶向给药的功能来自缀合物中的蛋白，这种蛋白与HIV感染的淋巴细胞中被上调的受体有结合亲和力(Ohno等人，Virology 1997；238305)。此外，药物-运铁蛋白缀合物中的药物可以是甲氨蝶呤，已知这种药物可以造成激活的外周循环系统淋巴细胞凋亡和克隆缺失(Genestier等人，JClin Invest 1998；102322)。与肿瘤细胞中运铁蛋白受体存在于细胞表面的情况不同(Yeh等人，Vox Sang 1984；46217-223)，在感染细胞(Ohno等人，Virology 1997；238305)和抗原刺激的T型淋巴细胞(Bayer等人，J LeukocBiol 1998；6419)中细胞表面不存在运铁蛋白受体，而且运铁蛋白受体在正常，成熟和休眠的细胞中也不存在(Berczi等人，Arch Biochem Biophy 1993；300356)。因此，正常细胞将不受影响，甲氨蝶呤-运铁蛋白缀合物只清除感染的T型淋巴细胞。
实现本发明的对HIV感染细胞靶向给药的方法是使用运铁蛋白，在血液中这种蛋白用于转运铁。可以从血浆中分离，从供应商处购买或采用重组技术(Ali等人，J Biol Chem 1999；27424066)得到运铁蛋白。为构成药物-蛋白缀合物，必须对运铁蛋白进行修饰，使得运铁蛋白具有偶联抑制细胞药物或抗逆转录病毒药物的能力。药物可以是细胞凋亡引发剂，如甲氨蝶呤，具有细胞毒性的抗生素，如多柔比星或烷基化试剂，实际上可以采用任何化合物，包括植物毒素，如蓖麻毒素，以及细菌突变毒素，如修饰的白喉毒素(Laske等人，Nature Med 1997；411039)。几种偶联方法如戊二醛偶联(Berczi等人，Arch Biochem Biophys 1993；300356)、二硫键偶联(Sasaki等人，Jap J Can Res1993；84191)和苯甲酰腙偶联(Berczi等人，J Pharm Sci 1998；87338)已经被用于在运铁蛋白上偶联其他化合物。偶联方法的多样性允许在运铁蛋白上缀合多种细胞毒性药物，在药物和运铁蛋白分子之间建立起永久的或可解离的键。偶联反应完成后，优选采用色谱法将药物-蛋白缀合物从未偶联的药物和游离的运铁蛋白中分离出来。
缀合过程的具体技术细节可以变化，但是，对于所有缀合过程的要求是(a)在病毒感染细胞的结合和杀灭试验中有活性，(b)不结合和杀灭明显数量的正常细胞。根据这些要求，以下是制备本发明缀合物的优选实施方案按照化学计量量，利用多柔比星(DOX)仅有的一个氨基，即3′-氨基和戊二醛(GLU)两个反应性基团中的一个反应，进行具有预定分子比例的、基本为均质的运铁蛋白-多柔比星缀合物的大量合成。因此，第一步是将DOX的盐水溶液滴加到GLU的盐水溶液中，其中GLU的盐水溶液含有溶剂如DMSO或其他适用的冷冻保护剂，使得DOX和GLU的最终摩尔比为1∶1。所得DOX-GLU溶液于室温下避光搅拌3小时。
在上述反应中DOX和GLU的摩尔数相等，使得最终所得的DOX-GLU溶液中既没有游离的DOX也没有游离的GLU。但是，如果一分子GLU和两分子DOX反应生成DOX-GLU-DOX，则溶液中可能存在游离的GLU，但通过向二价GLU溶液中滴加一价DOX，利用质量作用动力学可以将这种可能性降至最低。对于反应物的体积没有限制，所以可以制备大量的均质DOX-GLU。
缀合反应的第二步是将DOX-GLU滴加至运铁蛋白(TRF)的盐水溶液中。TRF可以是不含铁的(脱铁运铁蛋白)和被铁饱和的(全铁运铁蛋白)。通过适当调整TRF的体积可以得到理想的DOX-TRF摩尔比。所得TRF-GLU-DOX溶液于室温下避光搅拌20小时。与DOX和GLU的反应不同，DOX-GLU和TRF的反应并不仅局限于一个结合位点，DOX-GLU中的GLU成份可以和TRF分子中任何一个赖氨酸上的ε-氨基反应。
结合至TRF上的DOX分子的数目由第二步反应决定。例如，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为7.2∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有2.5分子DOX。但是，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为4.0∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有1.4分子DOX。类似地，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为2.5∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有0.9分子DOX。以此可根据需要大量制备DOX/TRF为预定比例的TRF-GLU-DOX。
缀合反应的下一步是添加乙醇胺或其他适用于清除过量连接子的物质，然后离心并进行渗析。虽然从理论上讲DOX和TRF消耗了所有的GLU，还需向最终的反应混合物中加入乙醇胺以结合所有未反应的GLU。避光反应30分钟。最终溶液于2000rpm下离心10分钟，用100倍过量的盐水渗析6小时，共二次，然后用Hepes缓冲盐水按同样配比渗析三次，所得TRF-GLU-DOX备用。
缀合物的生物化学表征如文献(39)所述，利用HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳可以确定TRF-GLU-DOX缀合物的均匀性。同样，利用分光光度法可以确定DOX和TRF的分子比。反复测定的结果表明TRF-GLU-DOX缀合物具有一致的均匀性。此外，在这些缀合物的制备中不必采用色谱法，因为没有出现聚集和分解现象。这样就允许大量制备均质的运铁蛋白-药物缀合物，从而增加了产量并降低了成本。
在其他类型的运铁蛋白-药物缀合物中，TRF和DOX损耗所产生的花费已经成为阻碍其应用的一个因素。例如，采用改变药物和/或蛋白的方法(如巯基化法)使得DOX和TRF的产率下降。采用溶剂系统和用于建立酸稳定的和酸敏感的连接的色谱法也使得产率下降。DOX和TRF之间的GLU键是酸稳定的，依据本发明所制备的TRF-DOX缀合物中DOX和TRF的产率高。事实上，与其他方法相比，有效的缀合物的产率增加了近5倍。
此前，对于基本为均质的且具有预定药物/运铁蛋白比例的缀合物尚无大量制备的方法。此外，其他的方法利用色谱来消除聚集和获得富含均质缀合物的组分。这些方法降低了产率，增加了成本，并且缺乏预设分子比例的能力。
另外一种方法是将1ml运铁蛋白(0.5mM)和1ml多柔比星的盐水溶液(其中多柔比星浓度为8.5mM，氯化钠浓度为150mM)混合4分钟，然后加入1ml戊二醛的盐水溶液(其中戊二醛浓度为21.5mM，氯化钠浓度为150mM)并混合4分钟。后一反应为偶联反应，加入0.8ml乙醇胺盐水溶液(其中乙醇胺浓度为37.2mM，氯化钠浓度为150mM，Hepes缓冲盐浓度为10mM)(pH8)并涡旋振荡4分钟终止反应。然后将反应混合物(3.8ml)转移至渗析管(截止分子量为12,000-14,000)中，采用0.5L Hepes缓冲盐水，于5℃下避光渗析3小时。更换Hepes缓冲盐水后，至少再渗析一次。此后于4℃下离心(1600g)混合物10分钟，采用2.6×34cm Sepharose CL-4B柱对上清液进行色谱分离，流速为22ml/小时，色谱柱用Hepes缓冲盐水预平衡，于5℃下用blue dextran、运铁蛋白和细胞色素C标定。洗脱液检测波长为280nm，每3.8ml收集一次。通过运铁蛋白和多柔比星的标准曲线计算每份中运铁蛋白和多柔比星的浓度，运铁蛋白的检测波长为280nm和多柔比星的检测波长为295nm。经改动后，这种偶联方法可用于制备其他药物的运铁蛋白缀合物，如甲氨蝶呤和/或抗逆转录病毒药物的运铁蛋白缀合物，或者核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)，如去羟肌苷(ddI，Videx)、拉米夫定(3TC，Epivir)、司他夫定(d4T，Zerit)、扎西他滨(ddC，Hivid)、以及齐多夫定(AZT，Retrovir)，非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，如地位韦啶(Rescriptor)、洛韦胺和奈伟拉平(Viramune)，以及蛋白酶抑制剂，如茚地那韦(Crixivan)、奈非那韦(Viracept)、利托那韦(Norvir)和沙奎那韦(Invirase)。
纯化得到纯的药物-蛋白缀合物之后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测以确定其分子量，而且也可以确定一分子蛋白所携带药物分子的数量。对于其他体系中药物-蛋白缀合物的研究已经证明功能药物/蛋白的比例在约0.1∶4.0之间(Berczi等人，Arch Biochem Biophs 1993；300356)。缀合后，缀合物表征中的重要步骤是确定(a)是否与肿瘤细胞表面的受体结合，但不与被感染细胞结合，以及(b)缀合物是否能杀灭癌细胞同时正常细胞不受损害。可采用流式细胞计进行结合试验，并采用微培养技术进行杀灭试验，以确定游离药物和药物-蛋白缀合物半数杀灭培养肿瘤细胞的浓度。对于其他体系中药物-蛋白缀合物的研究表明，与药物-蛋白缀合物相比，需要10倍量的游离药物方能杀灭同样数量的细胞。而且对于有效的缀合物而言，杀灭未感染细胞的数目应降至最低。
虽然本发明的描述中以运铁蛋白作为载药蛋白，众所周知人体内还存在其他可与感染细胞受体结合的蛋白。如果这种受体在感染细胞中活化而在正常细胞中无活性，那么任何可与这种受体结合的蛋白或其他分子(即配体)均可被用于运载本发明中所采用的药物。这种蛋白的一个实例是运钴胺素蛋白，用于将维生素B12转运至人体细胞中的运钴胺素蛋白受体之上(Seetheram，Ann Rev Nutr 1999；19173)。其他实例包括但不限于促生长素抑制素、表皮生长因子样分子以及非蛋白类靶向剂如叶酸样分子。
当药物-蛋白缀合物被制备、纯化、表征并且确认具有细胞结合和杀灭功能后，并且当结合和杀灭试验表明缀合物仅结合和杀灭肿瘤细胞，对正常细胞无害时，对缀合物进行分装和灭菌。可采用任何适当的方法，包括但不限于照射，如采用铯放射源，或采用微孔过滤技术进行灭菌。
本发明另一方面提供一种用于治疗病毒感染的试剂盒，其包含带有铁的运铁蛋白以及运铁蛋白-抗病毒药物缀合物。在给药抗病毒药物前，利用带有铁的运铁蛋白饱和运铁蛋白受体，以保护患者体内具有运铁蛋白受体的正常细胞。
本发明还提供一种确定感染细胞对于抗病毒药物的敏感性的方法，其中包括对于所述感染细胞分别，逐份给药由多种不同抗病毒药物与运铁蛋白的缀合物。为此目的，可以制备出含有多种不同缀合物的试剂盒。
本发明还提供一种组合物以及这种组合物的使用方法，其中在“鸡尾酒”组合中含有缀合物和至少一种游离(未缀合)抗病毒药物。
本发明的缀合物按有效剂量对动物给药。在病毒感染的治疗中，有效剂量是对降低病毒浓度有效的剂量。可以根据患者的年龄、体重和症状以及抗病毒药物的药代动力学确定均质缀合物的用药量。有效治疗所需的缀合物量将低于单独使用抗病毒药物时的需要量，而且取决于所使用的抗病毒药物。例如，对于体重为150磅(68kg)的人来说，运铁蛋白-多柔比星缀合物的剂量在0.5-50mg/28天之间。在28天期间，可以将这些药物分为更小的份进行给药。
本发明的药物组合物可以通过多种途径给药，包括但不限于口服、局部给药、直肠给药、经眼给药、阴道给药、经肺如利用气溶胶给药、或非肠道给药，包括但不限于肌注、皮下给药、腹膜内给药、动脉给药和静脉给药。组合物可单独给药，或与药学中常规的载体或赋形剂复合。对于口服给药而言，组合物可以采取片剂、胶囊、锭剂、药片、粉剂、糖浆、酏剂、水溶液和混悬剂等制剂形式。对于非肠道给药而言，一般要求制备灭菌的均质缀合物的水溶液，溶液的pH需作调整和缓冲。对于静脉给药，应控制溶剂溶液的浓度以达到等渗的要求。对于经眼给药，可以采用已知的给药工具，如涂药器或滴管将膏剂或滴剂加入。对于经肺给药，应选择适于形成气溶胶的稀释剂和/或载体。优选地，本发明的缀合物采用非肠道给药，即通过灌注或注射静脉给药或腹膜内给药。
以下描述本发明的优选实施方案。显然，对于本领域的普通技术人员而言，在阅读了以下方面描述后可能会提出改进或调整方案，所有这些改进或调整方案均被认为处于本发明权利要求所规定的范围之内。
实施例1均质的运铁蛋白-多柔比星缀合物的制备按照化学计量量，利用多柔比星(DOX)仅有的一个氨基，即3′-氨基和戊二醛(GLU)两个反应性基团中的一个反应，进行具有预定分子比例的，基本为均质的运铁蛋白-多柔比星缀合物的大量合成。因此，第一步是将DLU滴加至DMSO中，同时用冰水浴冷却。接下来将DOX的盐水溶液滴加到GLU+DMSO的盐水溶液中，使得DOX和GLU的最终摩尔比为1∶1。所得DOX-GLU溶液于室温下避光搅拌3小时。
在上述反应中DOX和GLU的摩尔数相等，使得最终所得的DOX-GLU溶液中既没有游离的DOX也没有游离的GLU。但是，如果一分子GLU和两分子DOX反应生成DOX-GLU-DOX，则溶液中可能存在游离的GLU，但通过向二价GLU溶液中滴加一价DOX，利用质量作用动力学可以将这种可能性降至最低。对于反应物的体积没有限制，所以可以制备大量的均质的DOX-GLU。
缀合反应的第二步是将DOX-GLU滴加至运铁蛋白(TRF)的盐水溶液中。TRF可以是不含铁的(apo-transferrin)和被铁饱和的(holo-transferrin)。通过适当调整TRF的体积可以得到理想的DOX-TRF摩尔比。所得TRF-GLU-DOX溶液于室温下避光搅拌20小时。与DOX和GLU的反应不同，DOX-GLU和TRF的反应并不仅局限于一个结合位点，因为DOX-GLU中的GLU成份可以和TRF分子中任何一个赖氨酸上的ε-氨基反应。
结合至TRF上的DOX分子的数目由第二步反应决定。例如，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为7.2∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有2.5分子DOX。但是，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为4.0∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有1.4分子DOX。类似地，如果DOX-GLU和TRF的起始比例为2.5∶1.0，最终所得的TRF-GLU-DOX溶液中每分子TRF上含有0.9分子DOX。以此可根据需要大量制备DOX/TRF为预定比例的TRF-GLU-DOX。
缀合反应的下一步是添加乙醇胺，然后离心并进行渗析。虽然从理论上讲DOX和TRF的反应消耗了所有的GLU，但还需向最终的反应混合物中加入乙醇胺以结合所有未反应的GLU。避光反应30分钟。最终溶液于2000rpm下离心10分钟，用100倍过量的盐水渗析6小时，共二次，然后用Hepes缓冲液按同样配比渗析三次，所得TRF-GLU-DOX备用。
缀合物的生物化学表征利用HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳可以确定TRF-GLU-DOX缀合物的均匀性。同样，利用分光光度法可以确定DOX和TRF的分子比。反复测定的结果表明TRF-GLU-DOX缀合物具有一致的均匀性。此外，在这些缀合物的制备中不必采用色谱法，因为没有出现聚集和分解现象。这样就允许大量制备均质的运铁蛋白-药物缀合物，从而增加了产量并降低了成本。
在其他类型的运铁蛋白-药物缀合物中，TRF和DOX损耗所产生的花费已经成为阻碍其应用的一个因素。例如，采用改变药物和/或蛋白的方法(如巯基化法)使得DOX和TRF的产率下降。采用溶剂系统和用于建立酸稳定的和酸敏感的连接的色谱法也使得产率下降。DOX和TRF之间的GLU键是酸稳定的，依据本发明所制备的TRF-DOX缀合物中DOX和TRF的产率高。事实上，与其他方法相比，TRF的产率几乎翻了一倍(90％对50％)，DOX的产率增加了近5倍。
此前已知用于制备运铁蛋白-多柔比星缀合物的方法都不能大量地制备基本为均质且具有预定药物/运铁蛋白比例的缀合物。此外，其他的方法利用色谱来消除聚集物并获得富含均质缀合物的组分。这些方法降低了产率，增加了成本，并且缺乏预设分子比例的能力。
实施例2抗病毒活性本发明对于对抗不同病毒的效能进行了研究。这些病毒包括细胞巨化病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)和HIV。结果对于HIV病毒的作用效果特别好。
例如，如图1所示，采用TR-DOX缀合物得到了抑制人血液细胞中HIV-1病毒ROJO株的剂量-应答曲线。在实验室的测试系统中，TR-DOX缀合物对于AIDS病毒具有强烈的作用，其所采取的浓度建议TR-DOX缀合物可以作为治疗AIDS患者体内HIV的有效药物。
类似地，图2显示了乙型肝炎病毒(HBV)感染的人肝脏细胞接触浓度渐增的运铁蛋白-多柔比星(TR-DOX)缀合物所得的剂量-应答曲线。同样，已经发现浓度非常低的TR-DOX缀合物基本上就可以完全抑制HBV。
最后，本发明就运铁蛋白-多柔比星(TR-DOX)缀合物对于生活在人肺细胞中的细胞巨化病毒(CMV)的作用进行了研究，并且再一次证明了TR-DOX缀合物对于CMV的强烈作用。图3显示了TR-DOX缀合物对抗CMV的剂量-应答曲线。
本发明对于TR-DOX缀合物和更昔洛韦(一种被广泛使用的抗病毒药物)的相对效能进行了直接的对比，以半数抑制CMV的浓度计，发现TR-DOX缀合物的效能要比更昔洛韦强200倍。
权利要求
1.一种治疗被病毒感染的细胞的方法，其包括对所述细胞给药有效剂量的、含有运铁蛋白和抗病毒药物的缀合物，所述抗病毒药物选自可诱导细胞凋亡的化合物、抑制病毒复制的化合物、具有细胞毒性的抗生素、烷基化试剂、植物毒素、以及细菌突变毒素。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗病毒药物选自多柔比星、甲氨蝶呤、核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、蓖麻毒素和修饰的白喉毒素。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒、细胞巨化病毒和肝炎病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述病毒为人免疫缺陷病毒。
5.一种治疗被病毒感染的患者的方法，其包括对所述患者给药有效剂量的、含有靶向剂和抗病毒药物的缀合物，所述抗病毒药物选自可诱导细胞凋亡的化合物、抑制病毒复制的化合物、具有细胞毒性的抗生素、烷基化试剂、植物毒素、以及细菌突变毒素，而所述靶向剂选自运铁蛋白和钴胺传递蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括在给药缀合物之前给药结合铁的运铁蛋白。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述抗病毒药物选自多柔比星、甲氨蝶呤、核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂以及蛋白酶抑制剂。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒、细胞巨化病毒和肝炎病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病毒为人免疫缺陷病毒。
10.如权利要求5所述的方法，其还包括给药游离的抗病毒药物。
11.一种包含均质缀合物和载体的组合物，其中所述缀合物含有病毒感染细胞的靶向剂和抗病毒药物，所述抗病毒药物选自抑制病毒复制的化合物、烷基化试剂、植物毒素、以及细菌突变毒素，而所述靶向剂选自运铁蛋白和钴胺传递蛋白。
12.如权利要求11所述的组合物，其还包含游离的抗病毒药物。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所述靶向剂为运铁蛋白。
14.如权利要求11所述的组合物，其中所述抗病毒药物选自核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
15.一种包含均质缀合物、未缀合的抗病毒药物和载体的组合物，其中所述缀合物含有病毒感染细胞的靶向剂和抗病毒药物，而所述抗病毒药物选自可诱导细胞凋亡的化合物，所述靶向剂选自运铁蛋白和钴胺传递蛋白。
16.一种含有靶向剂和抗病毒药物的缀合物，其中所述抗病毒药物是可抑制病毒复制的化合物，而所述靶向剂选自运铁蛋白和钴胺传递蛋白。
17.如权利要求16所述的缀合物，其中所述靶向剂为运铁蛋白。
18.如权利要求16所述的缀合物，其中所述抗病毒药物选自核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
19.一种制备具有预定药物/蛋白比例的缀合物的方法，其包括a)将药物溶液滴加到摩尔过量的连接子分子的溶液中，使一分子药物和一分子连接子分子连接构成药物/连接子复合体；b)将药物/连接子复合体加到蛋白中，制备具有预定药物/蛋白比例的缀合物，其中所述药物为抗病毒药物。
20.如权利要求19所述的方法，其还包括清除过量的连接子。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述连接子选自戊二醛、苯甲酰腙、马来酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
22.一种确定感染细胞对于抗病毒药物的敏感性的试剂盒，其中包含两种和更多种分别含有蛋白靶向剂和抗病毒药物的缀合物，其中所述抗病毒药物选自可诱导细胞凋亡的化合物、抑制病毒复制的化合物、具有细胞毒性的抗生素、烷基化试剂、植物毒素、以及细菌突变毒素，而且所述缀合物含有不同的抗病毒药物。
全文摘要
运铁蛋白或钴胺传递蛋白与抗病毒药物所构成的缀合物适用于治疗病毒感染。适用的抗病毒药物选自可诱导细胞凋亡的化合物、抑制病毒复制的化合物、具有细胞毒性的抗生素、烷基化试剂、植物毒素以及细菌突变毒素。优选通过戊二醛实现运铁蛋白或钴胺传递蛋白与抗病毒药物的偶联。
文档编号A61K47/42GK1529612SQ02814241
公开日2004年9月15日 申请日期2002年5月15日 优先权日2001年5月15日
发明者佩奇·W.·福克, 佩奇 W. 福克 申请人:福克医药公司