用于靶向哺乳动物中的脂肪细胞的方法和组合物的制作方法

用于靶向哺乳动物中的脂肪细胞的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提出了用于治疗剂的诊断、成像或靶向中以治疗肥胖症／肥胖相关病症的方法和组合物，其中这些组合物和方法鉴别并使用肽以在体外和体内选择性地靶向哺乳动物中的脂肪组织基质细胞。
【专利说明】用于靶向晡乳动物中的脂肪细胞的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月30日提交的第61 / 469，345号美国临时申请的权益，该临时申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
【技术领域】
[0003]本公开涉及可用于靶向治疗剂的递送的方法和组合物。更具体地说，本公开涉及用于鉴别并使用在体内和体内选择性地靶向哺乳动物中的脂肪组织的肽的组合物和方法。
[0004]背景
[0005]干细胞移植被公认为一种在临床前试验中加强组织再生的方式，并且这个策略正在被调动到临床中(Kolonin 和 Simmons, Nat.Biotechnol.27，252-253，2009)。干细胞疗法将大大得益于靶向特定器官中的间质基质细胞(MSC)的能力以供成像或治疗应用。MSC为包含多能成体祖细胞的混合细胞群体(Bianco等人，CellStem Cell2, 313-31 9，2008)。由于这些细胞能够分化成间质谱系，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，因此其通常被称作间质干细胞(Pittenger 等人，Science284, 143-147,1999 ；Prockop, Science276, 71-74,1997)。最新研究揭示了 MSC发挥维持血管完整性的血管周细胞(周细胞)的功能(Crisan等人，Cell Stem Cell3, 301-313，2008 ;Tang 等人，Science322, 583-586,2008 ；Traktuev等人，Circ.Res.102，77-85，2008)。
[0006]使用经过移植的MSC的临床前研究和临床试验支持这些细胞的治疗潜力并表明这些细胞在疾病过程中也被激活以参与组织修复和再生。然而，MSC用于细胞疗法的临床应用需要追踪并控制这种塑性细胞群体的能力，这是因为关于其促进癌症的能力存在安全性担忧(Zhang 等人，Cancer Res.69，5259-5266，2009)。
[0007]MSC最初从骨髓基质中分离并且基于其成纤维细胞形态而被称为成纤维细胞集落形成单位(CFU-F) (Friedenstein`, Haematol.Blood.Transfus.25,19-29,1980)。从那时起，已在大多数成体器官中鉴别出MSC，其中白色脂肪组织(WAT)为MSC的最大储藏器，这些细胞被称为脂肪基质细胞(ASC:Gimble 等人，Circ.Res.100，1249-1260，2007 ；Daquinag等人，Trends in Pharmacol.Sc1.22,1-8, 2011) ? 虽然 WAT 主要由脂肪细胞组成，但 ASC构成基质/血管部分(SFV)中的大多数细胞，该基质/血管部分还含有内皮细胞(EC)和浸润造血细胞(Hausman等人，Obes.Rev.2，239-254，2001)。已揭示ASC为展现与骨髓MSC相当的多能性和增殖能力，同时也具有鲜明而独特的特征的多能祖细胞的丰富来源(Rodeheffer 等人，Celll35, 240-249，2008 ；Tang 等人，2008，同上；Zuk 等人，2001，TissueEng.7，211-228)。
[0008]对MSC与其他组织组分的细胞间相互作用介导组织重塑的机制的当前了解受特异性MSC标记物缺乏所限制。虽然许多细胞表面分子，包括血小板源性生长因子受体-β (PDGFRP)、CD146、CD44、CD90、CD105、CD73、CD29 和 Stro-1,已用于 MSC 的阳性选择，但其中每一者也在其他细胞类型上表达(Bianco等人，2008，同上；Gimble等人，2007，同上；Nie等人，Stem Cells26，2735-2745，2008)。MSC(包括来自WAT的那些)可以基于泛白细胞标记物⑶45缺乏而区别于造血细胞，并且基于泛内皮细胞标记物⑶31 / PECAM-1缺乏而区别于内皮细胞(EC) (Bianco等人，2008，同上；Rodeheffer等人，2008，同上)。因为⑶34在体内若干器官的血管周MSC上表达，所以⑶34+⑶45-⑶31-免疫表型已用于分离MSC与其他细胞(Gimble等人，2007同上；Tang等人，2008，同上Jraktuev等人，2008，同上；Zhang等人，2009，同上)。然而，因为这种特征不会区分不同组织中的MSC，所以迫切需要用于其他组织中的ASC和MSC的前瞻性分离和追踪的新标记物并且其总体上限制了干细胞移植的领域。
[0009]此外，脂肪相关病症包括(但不限于)肥胖症、体重和体组成紊乱，包括影响体脂肪和体重调节的饮食和其他病症，这代表了所有工业化国家中的主要健康问题。在发达国家中肥胖症的患病率很高。例如，截止2002年，约30%的美国人是肥胖的(国家健康与营养问卷调查(National Health and Nutrition Examination Survey))。肥胖症是相对于瘦体重存在过量体脂肪的病状，并且被定义为体质指数(重量/高度2)高于30kg /m2 (KopeIman，Nature404 =635-643,2000)。肥胖症与显现许多严重疾病的风险增加相关联，这些疾病包括(但不限于)2型糖尿病、中风、高血压、冠状动脉病、某些癌症、某些组织中的慢性纤维化、脂肪性肝病、慢性静脉功能不全、深静脉血栓形成、关节炎、呼吸问题(如阻塞性睡眠呼吸暂停)和胆囊疾病(如胆石病)，以及其他并发症(Willett等人，N.Engl.J.Med.341 =427-434,1999) ? [0010]进一步注意到，基质细胞是支持器官的实质细胞功能的结缔组织细胞。纤维化是一个病理过程,其包括作为对组织损伤的反应,结缔组织形成疤痕并过度产生细胞外基质。融合性纤维化可以除去正常结构和潜在器官或组织的功能。纤维化病症包括(但不限于)皮肤中的病理性疤痕形成，如胶质疤痕和肥厚性疤痕；肝和胆囊的硬化；心脏、眼睛和肾脏、肺部和骨髓中的纤维化、胃肠道中与癌症如肉瘤和血管外皮细胞瘤相关的纤维化，以及硬皮病。其他纤维化病症包括坏血病和自体免疫病症，如类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮，并且其遗传病症的实例尤其包括马凡氏综合症(Marfan syndrome)、埃勒斯-当洛斯综合症(Ehlers-Danlos syndrome)、洛伊-迪茨综合症(Loeys-Dietz syndrome)、弹性假黄瘤、成骨不全、进行性肌肉骨化症以及自发性气胸。
[0011]上文所提到的疾病相关性解释了肥胖症的经济费用据估计超过1000亿美元的原因(Daniels, Am.J.Nurs.106:40_49，2006)，这个费用据估计多达总卫生保健费用的7 %(Seidell, Int.J.0bes.Relat.Metab.Disord.19(增刊 6):S13_S16，1995)。
[0012]哺乳动物中的体组成的调节是一个复杂过程，其涉及食欲和能量消耗的调节。对人类体组成和体重内稳定的了解不足。肥胖症的流行病学强有力地显示了这种病症展现出遗传特征，并且对人类双胞胎的研究强有力地表明对体组成和体重的控制的实质性遗传基础，据估计遗传率约为80-90%。人类肥胖症和动物模型的遗传学研究证实了肥胖症由食物摄入、食物诱导的能量消耗以及脂质与瘦体合成代谢之间的平衡的缺陷性调节的复杂相互作用引起。因此，肥胖症不仅仅是消极行为的结果，即，自主摄食过量的结果，而且由饮食模式、新陈代谢以及神经/新陈代谢相互作用的差异引起。这些差异似乎在某种程度上是因为基因表达在水平和基因产物的活性方面有差异(Friedman等人，Mamm.Genomel:130-144，1991)。
[0013]用于控制体重的当前方法包括节食和手术程序。然而，节食常常不能取得成功，并且由美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的少数肥胖症治疗剂，如芬特明(Phentermen)、芬氟拉明(fenfluramine)、诺美婦(Meridia)、罗氏鲜(Xernical)、奥利司他(Orlistat)、芬特明盐酸盐(Adipex-Ρ)、苯甲曲秦(Bontril)和苯丁胺(1nomin)，具有不可接受或危险的副作用，并且那些已经得到批准的少数治疗剂已退出市场。用于减轻体重的手术方法，如吸脂术、胃绕道手术或束带手术，具有许多风险。目前可用的体重控制方法无一令人满意并且需要体重减轻和控制的改进方法。
[0014]除了人类群体中的肥胖症问题以外，伴侣动物(如狗和猫)中的肥胖症问题也日益增加(German，J.Nutr.136:1940S-1946S, 2006)。在美国，据估计所有狗和猫中25-40%超重或肥胖。如同在人类中一样，肥胖症可能对伴侣动物的健康和寿命具有有害影响。另外，减少或除去市售牲畜饲料中体组成和体重操控剂的使用的能力不仅在饲养者的成本节约方面而且对消费者并且总体上对社会都具有显著效用。因此，操控体组成和体重并治疗人类和伴侣动物的体组成紊乱(例如(但不限于)肥胖症)的能力和增大牲畜体型的能力具有广泛效用并代表重大机遇。
[0015]糖尿病为与体组成紊乱(具体来说，肥胖症)和代谢综合征相关的当前不能治愈的长期病症，使得显现由不良血糖控制引起的其他病理性病状的风险大大增加。慢性、短期风险包括(但不限于)低血糖症、感染，以及与高血糖症相关的病症(如酮酸中毒)。由糖尿病引起的长期并发症包括(但不限于)心脏病、中风、高血压、血管病、视觉缺陷、肾病变和神经病变。根据2005年由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所进行的调查，在美国有超过两千万人患有糖尿病，并且糖尿病群体的百分比正迅速增加。2005年在美国，150万人被诊断出患有糖尿病。一些研究预测，到2020年全世界有约2.5亿人罹患糖尿病(O' Rahilly,BMJ, 314 =955-959,1997)。这种病症的最普遍形式是胰岛素依赖性糖尿病(IDDM或I型)和非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM或II型)。由于糖尿病有高发病率，并且许多相关并发症引起不可逆的损伤，因此治疗成本在美国超过任何其他单一疾病。在2002年，超过1320亿美元花费在治疗的直接和间接成本上，其中约920亿美元用于直接医疗成本(Hogan等人，Diabetes Care26:917-932,2003)。
[0016]最近，肥胖症已成为诱使癌`症患者因晚期癌症进展而死亡的因素之一(参见例如 Daquinag 等人，Vascular targeting of adipose tissue as an ant1-obesityapproach.Trends in Pharmacol Sc1.22,1-8, 2011 ;Zhang 等人 Adipose-tissue derivedprogenitor cells and cancer, World Journal ofStem Cells(Topic Highlight),2 (5):103-113,2010 ;Bellows 等人，Influence of BMI on Level of Circulating ProgenitorCells, Obesity,在线；Flegal 等人 Cause-specific excess deaths associated withunderweight, overweight, and obesity.JAMA.298，2028-2037，2007 ；Roberts 等人Biological mechanisms linking obesity and cancer risk:new perspectives.Annu RevMed.61:301-316, 2010)。患有前列腺癌和乳房癌的患者的存活率由于肥胖症而比其他癌症有所降低。WAT对癌症进展具有直接影响(Vona-Davis等人，Adiposity，type2diabetesand the metabolic syndrome in breast cancer.0bes Rev ;8:395_408，2007)，作为分泌炎症和代谢综合征中所牵涉的众多可溶性脂肪因子的有效内分泌器官(Rosen等人，Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis.Nature ；444:847-853,2006)。类胰岛素生长因子(IGF)为可直接剌激肿瘤细胞增殖的那些因子。痩素(Leptin)、白介素-6 (interleukin-6)以及各种其他激素和炎性细胞因子也可以起作用(Baillargeon.0bestity adipokines and prostate cancer (review).1nt J Oncol ；28:737-745 2006)。然而，提出这些因子在癌症中的作用的临床和实验数据仍有争议。例如，在动物模型中，切除循环的IGF-1已显示对前列腺肿瘤生长没有影响(Anzo等人，Targeted deletion of hepatic Igfl in TRAMP mice leads to dramatic alterationsin the circulating insulin-like growth factor axis but does not reduce tumorprogression.Cancer Res ；68 (9):3342-9, 2008)。因此，必须考虑替代机制。
[0017]与生理功能是用来储存过量能量的WAT相对比，棕色脂肪组织(BAT)负责以热量的形式消耗能量。WAT与BAT之间的细致平衡是在设计靶向疗法中应考虑到的重要问题。啮齿动物模型所得的许多结果指示BAT具有对抗肥胖症的病理结果的保护作用。在成人中发现BAT的意义在于可能有用以治疗肥胖症和相关病症的新方法。ASC是产生BAT的祖细胞类型之一(Elabd 等人 Human multipotent adipose-derived stem cells differentiateinto functional brown adipocytes.Stem Cells27, 2753-2760, 2009)。更重要的是，白色脂肪细胞可以在培养物中和体内直接转化为BAT样表型(Cint1.Transdifferentiationproperties of adipocytes in the adipose organ.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297，977-986，2009)。在小鼠中，扩充WAT内的残余BAT “补片(patch) ”可能导致几乎所有的脂肪库存在减少WAT的情况下变成BAT样的。脂肪细胞生理学对血管结构状态的明显依赖性表明血管靶向剂可以被设计成将WAT转化为BAT，而不会完全破坏组织，作为更符合生理并更安全的抗肥胖症治疗。激活现有残余BAT的增生、血管形成和/或新陈代谢的药理学方法的发展在理论上可以使WAT / BAT平衡倾斜并用于治疗肥胖症。
[0018]总之，脂肪相关体组成和体重紊乱(如肥胖症和糖尿病)代表了主要的健康问题。考虑到脂肪相关体重紊乱的严重性、患病率和复杂性，极大地需要鉴别参与体组成和体重控制的基因和蛋白质，并开发用以治疗脂肪相关体组成紊乱、肥胖症、代谢综合征和糖尿病的新药物和疗法。针对脂肪组织(WAT和BAT)中的不同类型细胞(如ASC)的靶向治疗和成像模态可以有益于肥胖症、癌症和纤维化中的生物医学应用。
发明概要
[0019]本发明所公开的方法和组合物是部分基于可以用于辅助诊断、预防和/或治疗哺乳动物的脂肪相关病症的某些肽的发现和鉴别，这些脂肪相关病症例如(但不限于)体组成紊乱、体重紊乱、糖尿病、肥胖症或代谢综合征以及癌症和纤维化。
[0020]在本发明的一些实施方案中，靶向肽包含选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列，其中所述肽结合于基质细胞。在本发明的另一个实施方案中，靶向肽包含SEQ IDN013和SEQ ID N014的WAT7氨基酸序列SWKYWFGE。在本文所描述的其他实施方案中，蛋白质组合物包含靶向肽，并且在另一个实施方案中，蛋白质组合物包含WAT7氨基酸序列。
[0021]在一些实施方案中，靶向肽完全由D-氨基酸组成；在其他实施方案中，靶向肽完全由L-氨基酸组成；并且在其他实施方案中，靶向肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或其组合 ο
[0022]在本发明的一些实施方案中，蛋白质组合物包含WAT7，其中WAT7由D-氨基酸组成，并且其中所述组合物结合于脂肪组织、纤维化组织或肿瘤组织中的基质细胞。在蛋白质组合物的一些其他实施方案中，WAT7选择性地结合于ASC细胞表面上的ADCN。
[0023]在本发明的蛋白质组合物的一些实施方案中，靶向肽偶合于选自包含以下各项的群组的效应剂:成像剂、细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、融合蛋白、细胞生长抑制剂、杀细胞剂、放射性同位素、ACS细胞分化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤剂、抗生素剂、酶、化学治疗剂、抗血管生成剂或其组合。在蛋白质组合物的一些实施方案中，靶向肽和效应剂由D-氨基酸组成；在蛋白质组合物的其他实施方案中，靶向肽由L-氨基酸组成，并且效应剂包含D-氨基酸；在蛋白质组合物的其他实施方案中，靶向肽由L-氨基酸组成，并且效应剂包含L-氨基酸。
[0024]在本文所公开的蛋白质组合物的一些实施方案中，靶向肽偶合于效应剂并诱导白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织。在其他实施方案中，效应剂激活白色脂肪组织中的b3-肾上腺素能受体。在蛋白质组合物的一些实施方案中，效应剂为由D-氨基酸组成的肽。
[0025]在制备用以靶向脂肪组织的蛋白质组合物的方法的一个实施方案中，所述方法包括:使效应剂偶合于靶向肽，其中靶向肽包含选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列；并且其中所述靶向肽选择性地靶向细胞脂肪组织。在其他实施方案中，效应剂和靶向肽由D-氨基酸组成。在其他实施方案中，效应剂由L-氨基酸组成；并且靶向肽由D-氨基酸组成。
[0026]在本文所公开的制备蛋白质组合物的方法的一些实施方案中，偶合包含用连接部分使所述效应剂连接于所述靶向肽；在其他实施方案中，连`接部分包含氨基己酸、(ch2)4、(CH2)5, (CH2)6, (CH2)7, (CH2)8或其组合。在本文所公开的制备蛋白质组合物的方法的一些实施方案中，效应剂是选自包含以下各项的群组:细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、成像剂或其组合。
[0027]在将效应剂递送到脂肪组织的方法的一些实施方案中，所述方法包括:使包含以下各项的蛋白质组合物暴露于包含脂肪组织的细胞群体:偶合于肽的效应剂，其中所述肽包含长度小于100个氨基酸的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含脂肪组织靶向肽部分，所述部分具有选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列。在其他实施方案中，蛋白质组合物包含连接子，并且所述连接子可以包含氨基己酸、(CH2)4、(CH2)5, (CH2)6,(CH2) 7、(CH2)8或其组合。在一些实施方案中，靶向肽基序由D-氨基酸组成。在其他实施方案中，效应剂和所述靶向肽由D-氨基酸组成。在本文所描述的将效应剂递送到脂肪组织的方法的一些实施方案中，所述剂包含:细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、成像剂或其组合；并且在其他实施方案中，所述剂由D-氨基酸组成。
[0028]在将效应剂递送到脂肪组织的方法的一些实施方案中，所述暴露包含:使受试者暴露于所述蛋白质组合物以治疗肥胖相关病症，其中所述病症包含肥胖症、纤维化、癌症或其组合；并且在其他实施方案中，所述细胞群体在哺乳动物受试者中；在其他实施方案中，细胞群体在人类受试者中；在一些其他实施方案中，细胞群体为薄的组织切片。
[0029]将效应剂递送到脂肪组织的方法的一些实施方案进一步包含基于蛋白质组合物与所述脂肪组织的所述选择性结合来检测所述群体中的脂肪基质细胞。在将效应剂递送到脂肪组织的方法的其他实施方案中，肥胖相关病症为体组成紊乱、体重紊乱、肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病、代谢综合征、纤维化、癌症或其组合。
[0030]在一个实施方案中，所公开的肽包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的群组的氨基酸序列，其中所述肽结合于肺组织。在其他实施方案中，所公开的蛋白质组合物包含有包含选自SEQ ID NO:17-24的序列或其组合的肽。在其他实施方案中，蛋白质组合物由D-氨基酸组成。在蛋白质组合物的一些实施方案中，肽偶合于成像剂、细胞毒性剂、促细胞凋亡剂或其组合。
[0031]在本文所公开的蛋白质组合物的一些实施方案中，组合物包含靶向肽和效应剂，其中所述效应剂包含:短杆菌肽(gramicidin)、娃皮素(magainin)、蜂毒素(mellitin)、防御素(defensing)、杀菌妝(cecropin)、(KFAKFAK) 2、(KFXAKFXAK) 2、(KHexAKHexAK) 2、(KLAKLAK) 2、(KLAKKLA) 2、(KAAKKAA) 2、(KLGKKLG) 3、血管紧张素(angiotensin)、层粘连蛋白肽(laminin peptide)、纤连蛋白肽(fibronectin peptide)、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12(interleukinl2)、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白(thrombospondin)、2_ 甲氧基雌二醇(2-methoxyoestradiol)、增殖蛋白相关蛋白(proliferin-related protein)、甲酉先胺基三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、多硫戍聚糖(pentosan polysulphate)、血管生成素
2(angiopoietin2) (Regeneron)、干扰素-α、除莠霉素 A (herbimycin A)、PNU145156E、16K催乳素片段(16K prolactin fragment)、利诺胺(Linomide)、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可碱(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP470、内皮抑素(endostatin)、紫杉醇(paclitaxel)、阿库汀(accutin)、血管抑素(angiostatin)、西多福韦(cidofovir) >长春新碱(vincristine)、博莱霉素(bleomycin)、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素(minocycline)、5_氟尿嘧唳、博莱霉素、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡钼(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺钼(cisplatin ；CDDP)、环憐酸胺(cyclophosphamide)、放线菌素 D (dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(etoposide ;VP16)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)、诺维本(navelbine)、亚硝基脲、匹可霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫西芬(tamoxifen)、泰素(taxol)、替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的水性形式)、反钼(transplatinum)、长春碱(vinblastine)和甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱、烧化齐?、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、亚硝基脲、激素剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶、生物反应调节剂、植物生物碱(plant alkaloid)、多烯紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉醇、泰素、长春碱、长春新碱、长春瑞滨(vinorelbine)、PPAR-Y激动剂噻唑烧二酮、罗格列酮(rosiglitazone)、突光团、螯合金属络合物、放射性同位素、荧光标记物、脲酶、碱性磷酸酶、脂质体、微囊体、微粒、纳米粒子、磁珠、微型装置(microdevice)、博莱霉素、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素(亚德里亚霉素(Adriamycin))、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))和依达比星(idarubicin)、钼配位络合物、蒽二酮(anthracenedione)、经取代的脲、甲肼衍生物、安口丫P定(amsacrine)、L-天冬酰胺酶和维甲酸(tretinoin)、卡钼、顺钼(顺式-DDP)、米托蒽醌(mitoxantrone)、羟基脲、丙卡巴肼、IgFc融合蛋白、酶融合蛋白、突光蛋白、发光蛋白或其组合和类似物。
[0032]因此，本文所描述的实施方案包含打算解决与诊断、预防和/或治疗脂肪相关病症的现有技术方法相关的各种不足的特征和优点的组合。上文所描述的各种特征以及其他特性将在本领域技术人员阅读以下发明详述之后并通过参考附图显而易见。
[0033]附图简述
[0034]图1描绘MSC导向肽的筛选。㈧描绘导向器官特异性MSC群体的肽的筛选的示意图。三种经噬菌体展示的环状肽文库的混合物用于4轮同步多器官生物淘选。在每一轮选择中，使红系细胞(TER119+)、内皮细胞(⑶31+)和造血细胞(⑶45+)免疫耗竭，然后使用FACS从WAT、肺、骨髓和骨骼肌收集CD34+CD31-CD45-细胞(MSC)。(B)与结合于对照器官的MSC的噬菌体-肽平行地定量、扩增、汇集结合于WAT MSC(ASC)的噬菌体-肽，并用于下一轮生物淘选。在连续轮次中噬菌体转化单位(TU)的回收率增加反映了导向个别靶器官的MSC的噬菌体-肽富集。(C)以WAT⑶34+⑶31-⑶45-细胞上回收的TU与肺⑶34+⑶31-⑶45-细胞上回收的TU的比率针对独立地注射到小鼠中的个别噬菌体-肽克隆评估ASC导向的相对特异性。Fd-Tet:对照无插入噬菌体。所示值是三次重复测量的平均值 +SD0 [0035]图2描绘导向ASC的环状WAT7肽(SEQ ID NO:13)的验证。图A-D是在从静脉内注射有噬菌体展示WAT导向肽WAT7 (SEQ ID N0:13和14)或肺导向肽LU2(SEQ ID NO:19)的小鼠得到的经过福尔马林(formalin)固定的WAT和肺的石蜡切片中的共焦抗噬菌体(红色)和抗⑶31 (亮绿色)免疫荧光。数字通道合并后的红色信号指示噬菌体在非内皮细胞血管周细胞上的定位(箭号)，对于WAT7(SEQ ID NO:13)观测到定位于WAT(A)中而非肺(B)中，并且对于LU2(SEQ ID NO:19)观测到定位于肺(D)而非WAT (C)中。图E-J说明静脉内注射后I小时生物素化肽WAT7的生物分布，其通过检测链霉亲和素_Cy3(红色)的共焦显微术揭示并与通过免疫荧光检测的I3DGFRii (红色)、⑶31 (亮绿色)或⑶45 (绿色)的组织表达对比。注意以与在ASC(F-G)上表达的TOGFRP重叠的模式，环状WAT7 (SEQID NO:13)特异性地与血管周WAT细胞(E)的相关性(箭号)。如同TOGFRP —样，WAT7不与⑶31+内皮细胞(E)或⑶45+造血细胞⑶相关。在肺中未检测到WAT7 (I)，不过富含PDGFR β +LSC(J)。核 T0PR03 染色是蓝色。比例尺:100 μ Μ。
[0036]图3描绘作为WAT7结合蛋白的核心蛋白聚糖(decorin)的纯化。(A)将共价连接于EDC琼脂糖的半胱氨酸环化合成肽WAT7 (SEQ ID NO:13)和WAT2(SEQ ID NO:3:对照)与从小鼠ASC得到的膜蛋白提取物一起孵育。洗涤后，用WAT2 (级分1-4)、WAT7 (级分5_8)和0.1M pH2.5甘氨酸(级分9-12)连续洗脱结合于WAT7亲和柱的蛋白质；对于WAT2亲和柱来说，肽洗脱的顺序颠倒。通过Bradford分析法测量每个级分中的蛋白浓度并绘制随0D595吸光度而变的曲线。(B)将从每个级分得到的脱盐蛋白质涂布于塑料上并暴露于噬菌体展示的WAT7或WAT2。7/7:WAT7亲和/ WAT7-噬菌体；2 / 7:WAT2亲和/ WAT7-噬菌体；7/2:WAT7亲和/ WAT2-噬菌体；2 / 2:WAT2亲和/ WAT2-噬菌体。基于宿主细菌感染后的TU回收率来定量噬菌体结合:WAT7亲和级分5的WAT7噬菌体结合增加指示WAT7-结合蛋白的洗脱。(C)通过梯度4-15 % SDS-PAGE解析从WAT7亲和级分I (对照)和5得到的蛋白质。凝胶的考马斯染色(Coomassie staining)显示了用WAT7特异性洗脱的40kDa条带(箭号)。质谱法将相应蛋白质鉴别为DCN。
[0037]图4描绘WAT中核心蛋白聚糖的过度表达。具有用内皮细胞特异性抗⑶31抗体(亮绿色)复染的抗小鼠DCN或抗小鼠TOGFRii抗体(红色)的经过福尔马林固定的石蜡包埋小鼠组织的共焦免疫荧光显示了 DCN (箭号)和TOGFRii (箭头)都在WAT中的血管周细胞(ASC)上表达(A、D)。发现DCN表达与肺(B)中的血管仅有很少关联并且在骨髓(C)中无法检测到，而I3DGFRii在肺基质(E)和骨髓(F)中普遍表达。蓝色:核T0PR03染色。比例尺:100μΜ。[0038]图5说明DCN裂解片段(Λ DCN)是ASC上的WAT7受体。(A)从具有DCN抗体的小鼠WAT亚群提取的膜相关蛋白和可溶性蛋白的免疫印迹，其显示了 ADCN(箭号)由ASC而不是由脂肪细胞特异性地表达。具有肌动蛋白抗体的凝胶的对照免疫印迹显示了同等蛋白上样。(B)从小鼠膜WAT SVF提取物得到的ADCN的亲和纯化。凝胶的考马斯蓝染色鉴别抗DCN IgG的轻链与重链之间的预期40kDa条带(箭号)。(C)与全长小鼠和人类DCN比对的⑶中分离的ΔDCN的埃德曼降解微序列(Edman degradation microsequence)。指示先前所报告的蛋白酶裂解位点，从而促成前肽和核心DCN的加工。未示出对应于mDCN的氨基酸56-295的序列。(D)测量WAT7与经过细菌纯化的重组小鼠ADCN的结合，通过ELISA与经过细菌纯化的重组全长核心小鼠DCN(mDCN)、全长糖基化小鼠DCN(mDCN*)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA相比。绘制0D450吸光度随肽浓度而变的曲线，其显示了剂量依赖性ADCN-WAT7和mDCN-WAT7结合。示出三个重复孔的平均值土 SD ;*P〈0.05。(E)从小鼠WAT SVF提取的总细胞和细胞膜相关蛋白的抗DCN免疫印迹，其显示了 Λ DCN(箭号)与细胞膜相关。(F) ADCN于小鼠ASC表面上的暴露，其通过用生物素化试剂处理细胞来评估。对生物素化蛋白(用链霉亲和素珠分离)进行抗DCN免疫印迹法，揭示了 ADCN(箭号)在新鲜分离的ASC上而不是经过培养的ASC上经历生物素化。(G)用慢病毒(Ientivirus)表达GFP (载体)、全长核心小鼠DCN-GFP融合体(DCN)或小鼠Λ DCN-GFP融合体(ADCN)稳定转导的3T3-L1细胞。GFP免疫荧光显示GFP-ADCN融合体的细胞表面定位。比例尺:10 μ Μ。
[0039]图6描绘通过模拟抵抗素(resistin)的WAT7与ADCN的结合。㈧上图:凝胶的考马斯染色，其显示了 GST(I)和重组GST融合肽1411(2)、14了2(3)、14了7(4)、1^2(5)的纯化，与以下对照平行分析:KGGRAKD肽(6)、抑制素蛋白(prohibitin protein) (7)和WLGEWLG肽。中图:具有抗WAT7抗体的相同凝胶的免疫印迹。下图:具有从用于产生抗WAT7抗体的兔得到的免疫前血清的相同凝胶的免疫印迹。(B)从小鼠培养的3T3-L1成纤维细胞、培养的ASC、培养的LSC以及从具有抗WAT7抗体的WAT、骨髓或肺新鲜分离的细胞中提取的总蛋白的免疫印迹检测了特异性13kDa蛋白(箭头)。(C)具有从WAT提取物得到的抗WAT7抗体的小鼠蛋白的亲和纯化。凝胶考马斯染色揭示关于抗WAT7IgG的轻(L)和重(H)链的相同13kDa蛋白，鉴别为抵抗素。(D)测量FLAG标记的抵抗素和对照蛋白(BAP)与经过细菌纯化的重组小鼠ADCN的结合，通过ELISA与经过细菌纯化的重组全长核心小鼠DCN(mDCN)、his6标记的对照蛋白CLIC4 (Ctrl-prot)、全长糖基化小鼠DCN(mDCN*)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA比较。绘制0D450吸光度随FLAG标记的蛋白浓度而变的曲线，其显示了剂量依赖性ADCN /抵抗素结合。
[0040]图7说明Λ DCN表达对前脂肪细胞的影响。对用慢病毒表达GFP (载体)、全长核心小鼠DCN-GFP融合体(DCN)或小鼠ADCN-GFP融合体(ADCN)稳定转导的3T3-L1细胞进行功能分析法。(A)通过MTT分析法测量在指定时间点5，000个粘附细胞的增殖。示出三个重复孔的平均值士 SD ;*Ρ〈0.05。(B)通过转移小室(Transwell)分析法测量的25，000个预饥饿细胞通过5μ M孔隙朝向10% FBS的迁移。12小时后，将转移小室底部的细胞固定，染色并计数。所示值为三个重复孔的平均值土SD ;*Ρ〈0.05。(C)下图:在诱导脂肪生成后10天通过用相差显微术检测的脂滴累积而测量的脂肪细胞分化。比例尺:10 μ Μ。
[0041]图8Α为同步体内噬菌体展示筛选的示意性描述。在每一轮选择中，静脉内施用噬菌体，同时从η个靶组织回收，扩增，汇集并用于下一轮选择。在稍后的轮次中噬菌体转化单位(TU)的回收率增加反映了选择优先导向靶器官的肽。 [0042]图8Β说明通过流式细胞测量术对MSC的鉴别。示出代表性皮下WAT分析。对表达⑶34+的活细胞进行门控(左散点图)，然后基于⑶31和⑶45表达进行门控(右散点图)，将⑶34+⑶45-⑶31-ASC鉴别为Q3中的紫色事件。Ql中的紫色事件对应于⑶34+⑶45-⑶31+内皮细胞。Q2和Q4中的事件对应于⑶45+造血细胞。
[0043]图9Α说明使用噬菌体-细胞结合分析法评估噬菌体展示筛选中分离的若干肽的选择性。分析表达肽 WATl (SEQ ID NO:1 和 2)、WAT2(SEQ ID NO:3 和 4)、WAT7 (SEQ ID NO:13 和 14)、LU2 (SEQ ID NO:19 和 20)、mPep (SEQ ID NO:35 和 36)的噬菌体或无插入噬菌体(Fd-Tet)对以下各项的结合:(1)4T1.2细胞，从人类乳腺癌得到的内皮细胞；(2)小鼠3T3-L1细胞(可以分化成类脂肪细胞表型的前脂肪细胞系)；(3)从WAT得到的原代小鼠SVF细胞；(4)从肺得到的原代小鼠SVF细胞；以及(5)从WAT得到的人类ASC细胞的第4代(从左到右的条棒)。在37C下加入指定肽-噬菌体以及无插入Fd-tet对照噬菌体(IO8TU),持续I小时。用RPMI / I % BSA洗涤3次后，用匀化器使细胞急速下降。使用所回收的噬菌体感染K91大肠杆菌，并在四环素(tetracyline)选择后，对集落进行计数以定量平均转化单位(TU)。示出三个个别涂板土SEM(误差条)的平均值。
[0044]图9B说明使用噬菌体-细胞结合分析法评估噬菌体展示筛选中分离的若干肽的选择性。分析表达肽 WATl (SEQ ID NO:1)、WAT2 (SEQ ID NO:3)、WAT7 (SEQ ID NO:13)、LU2 (SEQ ID NO: 19), mPep (SEQ ID NO:35)的噬菌体或无插入噬菌体(Fd-Tet)对未传代的人类WAT SVF的结合。在37°C下加入指定肽-噬菌体以及无插入Fd-tet对照噬菌体(IO8TU)，持续I小时。用RPMI / 1% BSA洗涤3次后，用匀化器搅匀(dounce)细胞。使用所回收的噬菌体感染K91大肠杆菌，并在四环素(tetracyline)选择后，对集落进行计数以定量平均转化单位(TU)。示出三个个别涂板土SEM(误差条)的平均值。
[0045]图10说明靶向的嵌合细胞毒性肽的结构，其中导向或靶向环状肽经连接子偶合于细胞毒性肽/促细胞凋亡肽。
[0046]图 11 说明 WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO:13_SEQ ID NO:31)全 D 肽(0.01mM、0.05mM和0.1OmM)的剂量依赖性体外杀死活性并由此说明称为WAT7 (SEQ ID NO:13)的ASC导向肽靶向培养物中原代小鼠ASC的有效杀死的能力，如使用锥虫蓝排除法可视化。
[0047]图12 说明细胞凋亡是经过 WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO:13_SEQ ID NO:31)全 D 肽处理的细胞的死亡原因的验证。使用AP0-TRACE试剂(Sigma)和流式细胞测量术来检测经过处理的细胞中的细胞凋亡诱导以验证细胞凋亡是细胞死亡的机制。示出经过未靶向的细胞凋亡肽处理的细胞和经过WAT7靶向的细胞凋亡肽处理的那些细胞。
[0048]图13示出了用2mg对照或用靶向的细胞毒性肽WAT7_KLAKLAK2 (SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:31)全D肽处理后48小时的肥胖小鼠。可以看出，经过靶向的细胞毒性肽WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽处理的小鼠中脂肪组织的量减少。[0049]图14示出了用靶向的细胞毒性肽WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽处理已消耗掉皮下WAT中所存在的ASC(图F对图E)，但对腹膜内WAT的影响显著更大(图H对图G)，而且促使肿瘤坏死(如图B对图A和图D对图C中所示)。
[0050]图15 说明通过用细胞毒性 WAT7-KLAKLAK2(SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全 D 肽处理而诱导的细胞凋亡被限制在靶组织。使用AP0-TRACE试剂(Sigma)和流式细胞测量术来检测皮下和腹膜内WAT细胞中而不是从肾或外周血得到的细胞中的细胞凋亡诱导。非靶向的细胞凋亡的缺少指示细胞毒性嵌合肽对蛋白水解有抗性。
[0051]图16说明(A)从具有针对小鼠DCN的抗体的小鼠WAT、肺和骨髓(B.M.)中提取的膜相关蛋白和可溶性蛋白的免疫印迹。指示非糖基化核心DCN(箭头)和WAT特异性同工型(箭号)的迁移。具有ANX2A抗体的凝胶的对照免疫印迹显示了同等膜蛋白上样。(B)通过ELISA测量WAT7 (上图)和WAT2对照(下图)肽与重组核心小鼠DCN(mDCN)、糖基化牛DCN(bDCN*)和BSA的结合。绘制0D450吸光度随肽浓度而变的曲线，其显示了剂量依赖性 mDCN-WAT7 结合。
[0052]序列表简述
[0053]序列表提供结合哺乳动物脂肪组织和肺组织的肽的氨基酸序列。结合于白色脂肪组织(WAT1-8)的半胱氨酸环化肽的氨基酸序列呈现于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中。相应非半胱氨酸环化肽呈现于SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12和14中。
[0054]结合肺组织(LU1-4)的半胱氨酸环化肽的氨基酸序列呈现于SEQ ID NO:17,19,21和23中，而相应非半胱氨酸环化肽呈现于SEQ ID NO: 18、20、22和24中。
[0055]先前所公开的脂肪结合肽(半胱氨酸环化)的氨基酸序列以SEQ ID NO:25呈现，而相应非半胱氨酸环化肽序列以SEQ ID N0:26呈现。
[0056]各种对照肽的氨基酸序列以半胱氨酸环化肽形式呈现于SEQ ID NO ,21和29中，而相应非半胱氨酸环化对照肽呈现于SEQ ID NO:28和30中。各种已知细胞毒性肽和/或促细胞凋亡肽的氨基酸序列以半胱氨酸环化肽形式呈现于SEQ ID NO:31和33中，而相应非半胱氨酸环化肽呈现于SEQ ID NO:32和34中。
[0057]称为mP印的肽的氨基酸序列以半胱氨酸环化肽形式呈现于SEQ ID NO:35中，而相应非半胱氨酸环化肽呈现于SEQ ID NO:36中。
[0058]发明详述
[0059]定义
[0060]在本公开中，除非另有特别规定，否则单数的使用包括复数，词语“一个(种)”意味着“至少一个(种)”，并且“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式(如“包括了”和“已包括”)的使用没有限制性。而且，除非另有特别规定，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分和包含一个以上单元的要素或组分。
[0061]本文所用的章节标题仅仅是出于组织目的，并且不应视为限制所描述的主题。本申请中所引用的所有文献或文献部分，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍和论文，特此出于任何目的通过引用整体明确并入本文中。在所并入的文献和类似材料中的一者或多者以与一个术语在本申请中的定义相矛盾的方式定义那个术语的情况下，以本申请为准。
[0062]如本文所用并 且除非另有指示，否则术语脂肪相关病症包括(但不限于)白色或棕色脂肪组织的病症、脂肪相关体组成或体重紊乱，其包括(但不限于)与体重相关的病症，如肥胖症、脂肪营养不良、代谢综合征，以及与体重增加、维持体重减轻、体重减轻后体重反弹的风险相关的病状，以及相关的血糖紊乱、糖尿病、高血压、纤维化病状和癌症。
[0063]如本文所用并且除非另有指示，否则术语“治疗(treat / treating /treatment) ”和“疗法”涵盖在患者罹患白色脂肪相关病症的同时所发生的行为，其减轻如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱的一种或多种症状或影响的严重性。在上下文允许的情况下，术语“治疗”也指代为了确保如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱的风险增加的个体能够在如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱发作之前接受适当手术和/或其他医疗干预而采取的行为。如本文所用并且除非另有指示，否则术语“预防(prevent/preventing / prevention) ”涵盖在患者开始罹患如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱之前所发生的行为，其延迟如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱的发作，和/或抑制或减轻其严重性。
[0064]如本文所用并且除非另有指示，否则术语“管理(manage / managing /management)”涵盖在已经罹患如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱的患者中预防、延迟这种疾病、病症或病状复发，或减轻这种疾病、病症或病状复发的严重性。该术语涵盖调节如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱的开始、发展和/或持续时间，或改变患者对脂肪相关体组成或体重紊乱作出反应的方式。
[0065]如本文所用并且除非另有规定，否则化合物的“治疗有效量”为足以在治疗或管理如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱方面提供任何治疗效益或使与如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱相关的一种或多种症状延迟或减到最小的量。化合物的治疗有效量意味着单独或与一种或多种其他疗法和/或治疗剂组合的化合物的量，其在治疗或管理如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱方面提供任何治疗效益。术语“治疗有效量”可以涵盖缓和如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱，改善或减轻如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱，改善总体疗法，或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。
[0066]如本文所用并且除非另有规定，否则化合物的“预防有效量”为足以预防或延迟如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱或者与如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱相关的一种或多种症状的发作，或预防或延迟其复发的量。化合物的预防有效量意味着单独或与一种或多种其他治疗和/或预防剂组合的化合物的量，其在预防如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱方面提供预防效益。术语“预防有效量”可以涵盖预防如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱，改善总体预防，或增强另一种预防剂的预防功效的量。“预防有效量”可以在例如脂肪组织相关病症发展之前开立。[0067]如本文所用，“患者”或“受试者”包括能够罹患本文所描述的如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪组织相关体组成或体重紊乱的有机体，如人类和非人类哺乳动物。优选的人类动物包括人类受试者。如本文所用的术语“非人类哺乳动物”包括所有哺乳动物，例如，啮齿动物、小鼠、大鼠等；以及非人类灵长类动物、伴侣动物和牲畜，例如，绵羊、狗、奶牛、马等。
[0068]如本文所用，“靶向肽”为包含氨基酸的连续序列的肽，其特征在于选择性定位到器官、组织或细胞类型。选择性定位可以例如通过以下所公开的方法来确定，其中将推定靶向肽序列并入到在噬菌体的外表面上展示的蛋白质中。将已经过遗传工程改造以表达众多具有不同氨基酸序列的这些靶向肽的这种噬菌体的文库施用受试者之后，从该受试者收集一种或多种器官、组织或细胞类型并鉴别在那个器官、组织或细胞类型中所发现的噬菌体。如果表达靶向肽序列的噬菌体在一个组织或器官中与对照组织或器官相比展现出较高结合的话，那么就认为这种噬菌体选择性地定位到那个组织或器官。优选地，靶向肽的选择性定位应使得噬菌体在靶器官、组织或细胞类型中的富集是在对照器官、组织或细胞类型中的两倍或更多倍。使得在靶器官中富集是在对照器官、组织或细胞类型中的至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍或更多倍的选择性定位为更优选的。或者，展现出选择性定位的表达靶向肽序列的噬菌体优选地显示出在靶器官中的富集与对照器官相比增加，此时将从靶器官回收的噬菌体再注射到第二宿主中以供另一轮筛选。在第三轮筛选之后可以展现出进一步富集。用以确定选择性定位的另一种替代方式为表达推定靶向肽的噬菌体所展现的在靶器官中的富集优选地是表达非特异性肽或未经遗传工程改造以表达任何推定靶向肽的对照噬菌体的两倍，更优选地是三倍或更多倍。“靶向肽”和“导向肽”在本文中同义使用。
[0069]如本文所用，“噬菌体展示文库”意味着已经过遗传工程改造以在外表面上表达一组推定靶向肽的噬菌体的集合。在优选实施方案中，将编码推定靶向肽的DNA序列框内插入到编码噬菌体封套蛋白的基因中。在其他优选实施方案中，推定靶向肽序列一部分是所有二十种氨基酸的随机混合物，并且一部分是非随机混合物。在某些优选实施方案中，噬菌体展示文库的推定靶向肽在靶向肽序列内的固定位置处展现一个或多个半胱氨酸残基。半胱氨酸可以用于例如形成环状肽。
[0070]“大分子复合物”是指在排`列方面可以随机、有序或部分有序的分子的集合。该术语涵盖生物有机体，如噬菌体、病毒、细菌、单细胞病原性有机体、多细胞病原性有机体以及原核或真核细胞。该术语也涵盖分子的无生命装配体，如脂质体、微囊体、微粒、纳米粒子、磁珠和微型装置。唯一的要求是复合物含有多于一个分子。这些分子可以是相同的，或可以彼此不同。
[0071]靶向肽的“受体”包括(但不限于)结合于靶向肽的任何分子或大分子复合物。受体的非限制性实例包括肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、表位、脂质、碳水化合物、多分子结构、一个或多个分子的特定构象，以及形态解剖学实体(morphoanatomic entity)。在优选实施方案中，“受体”是靶器官、组织或细胞类型内形成血管的细胞的腔表面上所存在的天然产生的分子或分子复合物。
[0072]提供用于产生选择性靶向肽的组合物和方法。在一些实施方案中，提供对脂肪组织具有选择性或特异性的特定靶向肽，包括(但不限于)SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18 或 SEQID NO:19 ;并且在其他实施方案中，对脂肪组织具有选择性的靶向肽可以用于选择性或特异性地将治疗剂递送到靶组织，如脂肪组织。在某些实施方案中，所述方法涉及对特定靶细胞、组织或器官(如脂肪)具有选择性或特异性的靶向肽的制备和鉴别。脂肪靶向肽包括(佃不限于)CKGGRAKDC(SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26 和 SEQ ID N0:l_16)。对照肽包括(但不限于)CARAC (SEQ ID NO:27 和 28)或 CGDKAKGRC (SEQ ID NO:29 和 30)。[0073]白色脂肪代表独特的组织，其如同肿瘤一样，可以迅速增生并扩充(Wasserman，Handbook of Physiology, Renold 和 Cahill 编，第 87-100 页，American PhysiologicalSociety, Washington, D.C.，1965 ；Cinti, Eat.Weight.Disord.5:132-142, 2000)。对脂肪组织的研究揭示了其高度血管化。多个毛细血管与每个脂肪细胞接触，表明血管结构对维持脂肪质量的重要性(Crandall等人，Microcirculation4:211-232,1997)。脂肪组织增生可能依靠血管生成，这类似于肿瘤。如果是这样的话，那么破坏脂肪新生血管结构可以防止肥胖症的发展，而靶向现有脂肪血管可以潜在地促使脂肪衰退。使用脂肪靶向肽的方法可以包括诱导重量减轻，治疗肥胖症或其他脂肪相关病症，例如(但不限于)癌症和纤维化的成像或治疗。
[0074]公开以下两项的组合:体内噬菌体展示技术(如以下文献以及其他文献中所描述:美国专利申请 US20090104117、US20060094672、US20060239968、US20090221505、US20080176792、US20080124277、US20100172864、US20040170955、US20010046498,以及Kolonin等人，Nature Medicine ； 10,625-32, 2004)与用于分离导向所关注器官中的选择性细胞群体的肽的荧光激活细胞分选(FACS)。这种体内选择系统与噬菌体展示文库组合使用以鉴别器官、组织或细胞类型-靶向肽。在噬菌体表面上表达转基因肽的噬菌体展示文库可以通过将随机寡核苷酸插入到编码噬菌体表面蛋白的cDNA中，产生以许多变换展示独特肽的噬菌体粒子的集合来产生。噬菌体展示是噬菌体文库表达例如并入到噬菌体外壳蛋白中的一组具有规定长度的随机肽序列的技术，并且结合于靶分子、细胞、组织(例如脂肪组织)或器官的肽序列是通过将噬菌体展示文库与标靶一起孵育并选择结合的肽来鉴别。洗掉未结合的噬菌体，并且将结合的噬菌体洗脱并收集。可以扩增所收集的噬菌体，并进行进一步结合/扩增周期以富集肽库中选择性和/或特异性地结合于标靶的那些肽。在每个周期下，富集库中含有针对所关注标靶的靶向肽的噬菌体部分。在若干周期之后，可以通过DNA测序来表征个别噬菌体克隆以鉴别靶向肽序列(生物淘选，参见例如 US20050187161 以及 Pasqualini 和 Ruoslahti, Nature380:364-66,1996 ；Arap 等人，Science279:377-80,1998)。
[0075]将噬菌体展示文库静脉内(1.V.)施用小鼠之后，从个别器官回收噬菌体。基于在噬菌体外表面上表达的特异性靶向肽序列，回收能够选择性导向脂肪组织的噬菌体。通过这种方法已鉴别多种器官和肿瘤导向肽(参见例如美国专利文献:US20060094672、US20080124277、US20090104117、US20090221505 和 US20100172864)。
[0076]以下特定实例提供这种方法当应用于白色脂肪(adipose / fat)组织(WAT)时的有效性的显示，然而，本领域技术人员应认识到，这种技术可以应用于棕色脂肪组织(BAT)并且甚至应用于从各种组织和器官得到的其他细胞类型。WAT含有充足供应的周细胞性脂肪基质细胞(ASC)，其属于间质干细胞(MSC)的类别。MSC具有⑶34+⑶31-⑶45-细胞表面特征。MSC和ASC的多能性质以及其高增殖速率和迁移能力意味着其可以是有益的和病原性的。ASC已显示负责肥胖症中的脂肪组织扩充，而且促进癌症进展并可能促进伴有纤维化的其他疾病(Zhang 等人，Cancer Res.69:5259-5266,2009)。
[0077]为了显示体内噬菌体展示技术与FACS筛选方法的该组合的成功性，在活小鼠中筛选针对ASC标记物的肽文库。筛选包含环状CX7C、CXS(^P CX9C (其中C代表半胱氨酸并且X代表任何残基)的随机肽文库的混合物。将噬菌体-肽文库注射到动物中并进行4轮体内同步多器官生物淘选以富集WAT导向肽。在每一轮选择中，静脉内施用噬菌体并从WAT和对照器官的基质/血管部分(SVF)回收，扩增，汇集，并且用于下一轮。使用FACS消耗掉结合于内皮细胞(⑶31+)和造血细胞(⑶45+)的噬菌体-肽并收集结合于⑶34+⑶31TD45_ASC的噬菌体-肽。在每个后续轮次中噬菌体转化单位(TU)的回收率增加显示了噬菌体富集，这反映了选择导向WAT和其他靶器官的⑶34+⑶31TD45—细胞的噬菌体-肽。
[0078]结果为使用包括在内以供反选择的对照器官来鉴别当体内注射时导向ASC，而不导向MSC的肽。所筛选的器官包括肺、骨、骨髓和骨骼肌。指定为WAT7 (序列CSWKYWFGEC和SffKYffFGE:分别为SEQ ID NO:13和14)的一种特定肽显示最确定的ASC靶向模式，而肽LU-2(序列CESGFPTVGC:SEQ ID NO:19和20)被选作靶向肺中的MSC的对照肽。
[0079]个别噬菌体-肽克隆导向WAT的⑶34+⑶31_CD45_细胞的特异性通过注射到小鼠中来显示。带有WAT-7肽的噬菌体的结合与肺MSC的结合相比在ASC上高度富集(见图1C)。相比之下，所测试的α5β I导向肽mPep(Nie等人，2008，同上)和其他对照肽并未展示出任何WAT特异性。
[0080]WAT7 为环状八肽(氨基酸序列 CSffKYffFGEC 和 SffKYffFGE (SEQ ID NO: 13 和 14)，其当全身施用时导向ASC，而不导向其他器官中的MSC。WAT7可以经由末端CYS部分来环化。WAT-7用作引诱物来以生物化学方式纯化相应ASC表面受体，将其鉴别为先前所忽视的核心蛋白聚糖(DCN)蛋白同工型，即缺乏糖基化位点的溶蛋白性裂解片段。已确定，这种截短DCN (称为Λ DCN (deIta-DCN))由ASC过度表达并且暴露于细胞表面上，由此提供新ASC标记物。另外，通过扭转想法并且筛选模拟WAT-7的蛋白质，将抵抗素鉴别为WAT中的ADCN的内源性配体。前脂肪细胞中ADCN`的异常表达诱导与先前以抵抗素所报道的一致的表型，这支持以下结论:抵抗素-ADCN相互作用控制信号传导级联，这些信号传导级联控制ASC的命运。可以全身注射所公开的肽以消耗选择性细胞群体。在下文的实施例中，详细描述靶向白色脂肪组织(WAT)中的脂肪干细胞(ASC)的肽。ASC靶向可以有益地作为肥胖症、癌症和纤维化的疗法。
[0081]使用肽作为靶向肽并且产生例如偶合于显示靶组织(包括(但不限于)脂肪组织)的选择性和/或特异性结合的促细胞凋亡杂合肽的体内细胞靶向杂合肽先前已有报道(参见例如美国专利申请公布US20090104117、US20060094672, US20060239968、US20090221505、US20080176792、US20080124277 和 US20100172864)。这些杂合肽是由两个功能结构域组成的合成肽:结合于在所关注细胞上差异性表达的受体的导向(细胞靶向)结构域和引起使肽内化的细胞发生凋亡性死亡的细胞毒性结构域。导向肽典型地为7到8个氨基酸的长度并且为环状(由两个二硫键键合的半胱氨酸限制)。细胞毒性结构域为两亲性肽序列KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO:31)，指定为(KLAKLAK)2，其在受体介导的细胞内化后破坏线粒体膜并且促使程序性细胞死亡(细胞凋亡)。这些细胞毒性肽还包括包含具有式(FXR)n的那些的细胞毒性肽，其中n=4、6、8和10，并且其中F为苯丙氨酸，Fx为环己基-丙氨酸并且Hex为6碳烷基链残基，实例为(KFAKFAK)2、(KFxAKFXAK)2和(KHexAKHexAK) 2,以及例如以下文献中所描述的那些:Horton, KL和Kelley, S0.EngineeredApoptosis-1nducing Peptides with Enhanced Mitochondrial Localization andPotency.J.Med.Chem.52, 3293-3299, 2009 ；Yousif, L.F., Stewart, K.M., Horton, K.L.和Kelley, S.0.Mitochondria-Penetrating Peptides:Sequence Effects and ModelCargo Transport.ChemBioChem, 10:2081-2088,2009 ；Kelley SO, Stewart KM, MourtadaR.Development of novel peptides for Mitochondrial drug delivery:amino acidsfeaturing delocalized lipophilic cations.Pharm Res.Nov ；28 (11):2808-19,2011.Epub2011 年 8 月 11 日；Horton, KL, Pereiral, MP, Stewart, KM, Fonseca SB 和 Kelley,S0.Tuning the Activity of Mitochondria-Penetrating Peptides for Delivery orDisruption, ChemBioChem, 13 (3), 476-485, 2012.在线公布:2012 年 I 月 11 日。
[0082]然而，这些杂合肽的成功性先前已受限制，并且可能与毒性相关联，这是因为导向结构域和所公布的Gly-Gly连接子在传统上由L-氨基酸组成，这些L-氨基酸在体内可能经历蛋白水解。蛋白水解使活性杂合肽还原并且可能最终导致各种子肽释放，其中一些子肽可能代表杂合肽的靶向或效应部分。例如(但不限于)促细胞凋亡肽，如dKLAKLAK2(SEQID NO:31)的效应肽而非靶向肽的可能释放，可能导致有害反应，如肾中毒。另外，因蛋白水解所致的不稳定性会增加用于注射以获得治疗水平所必需的肽量。因此，现有技术的效应肽的临床功效和安全性受限制。
[0083]此外，因为包含早先描述的连接子区域的甘氨酸不会呈D型存在，所以全D促细胞凋亡肽的合成先前并不可能，直到如本文所描述用氨基己酸替换连接子才可能。另外，先前尚未尝试从D型氨基酸构建导向/靶向肽结构域，这是由于关注到从L型(其中肽经过原始分离)到D型的转变可能导致构象变化，这会使得与靶受体不相容和识别损失以及相应的导向损失。然而，如本文所描述的这些全D肽以及现有技术的L肽可以导向靶细胞。
[0084]在一些实施方案中，组合物包括经过分离的肽，其包含选自由SEQ ID NO:1_16组成的群组的氨基酸序列，其中所述肽结合于脂肪组织。在一些实施方案中，蛋白质组合物包含选自由SEQ IDNO:1-16组成的群组的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，蛋白质组合物完全由D-氨基酸组成。在一些其他实施方案中，蛋白质组合物包含偶合于成像剂的肽。在一些实施方案中，靶向肽偶合于细胞毒性剂或促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，蛋白质组合物包含偶合于诱导白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织的试剂的肽。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽经连接子偶合于试剂或其他肽。在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。在一些实施方案中，连接子包含(CH2)4、(CH2)5, (CH2)6,(CH2)7, (CH2)8或其组合。在一些实施方案中，试剂激活白色脂肪组织上的b3-肾上腺素能受体。在一些实施方案中，试剂为肽；并且在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽经连接子偶合于试剂或其他肽。在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。
[0085]在一些其他实施方案中，经过分离的核酸组合物包含编码选自由SEQ ID NO:1_16组成的群组的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含经过分离的核酸分子，并且在一些其他实施方案中，表达载体包含经过分离的核酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体。
[0086]在一些实施方案中，将细胞毒性肽、细胞凋亡肽、反式发育(transdevelopmental)肽或成像肽递送到脂肪组织的方法包括(a)偶合于具有选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列的靶向肽，其中所述靶向肽选择性地结合脂肪细胞。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽经连接子肽偶合，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。
[0087]在一些其他实施方案中，将化合物或试剂递送到脂肪组织的方法包括:a)获得选择性地结合于脂肪组织的肽，其中所述肽的长度小于100个氨基酸并且包括具有选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列的脂肪组织靶向基序，其中肽偶合于希望靶向脂肪组织的化合物或试剂jPb)使肽暴露于疑似含有脂肪组织的细胞群体。在一些实施方案中，肽包含连接子。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽和试剂都是由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，偶合经连接子肽发生，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。在一些实施方案中，试剂包含细胞毒性肽或促细胞凋亡肽。在一些实施方案中，试剂包含成像剂。在一些实施方案中，(b)包括使受试者暴露于肽以治疗脂肪相关病症。在一些实施方案中，细胞群体在人类受试者中。在一些实施方案中，细胞群体为薄的组织切片。在其他实施方案中，方法进一步包括检测所述群体中的脂肪干细胞。在一些实施方案中，脂肪相关病症为体组成紊乱、体重紊乱、肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病、代谢综合征、纤维化或癌症。
[0088]在其他实施方案中，经过分离的肽包含选自由SEQ ID NO: 17-24组成的群组的氨基酸序列，并且其中所述肽结合于肺组织。在一些实施方案中，蛋白质组合物包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的群组的氨基酸序列，并且在一些实施方案中，蛋白质组合物完全由D-氨基酸组成。在其他实施方案中，提供蛋白质组合物，其中肽偶合于成像剂。在一些实施方案中，提供蛋白质组合物，其中肽偶合于细胞毒性剂或促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，偶合经连接子肽发生，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。
[0089]在嵌合细胞毒性肽组合物的`一种例示性组合物中，两个结构域中的所有氨基酸都已经由D-对映异构体构建，并且由此对体内蛋白水解有抗性，从而允许在全身施用后肽发挥长期作用。连接两个结构域的连接子为氨基己酸(Ahx):NH-(CH2) 5-C0，其在体内也不会经历蛋白酶裂解。对于在下文的实施例中使用来说，嵌合肽在商业上生产(例如，由Anaspec、Bachem或Celtek生产)并且通过常规肽化学法(“梅里菲尔德合成法(Merrifieldsynthesis)”)合成。
[0090]如下文的实施例中所描述，首先在体外使用经过处理和未经过处理的原代鼠类ASC 培养物的锥虫蓝染色来显示由 Celtek(Celtek Bioscience, Nashville, TN37210)合成的WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽的细胞毒性活性。使用Apo-Trace (Sigma, St.Louis, USA)和流式细胞测量分析,显示祀向WAT7的促细胞凋亡肽确实诱导经过处理的ASC细胞的细胞凋亡和细胞死亡(参见下文的实施例8)。为显示WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽的体内活性和功效，将2mg肽注射到小鼠中，并且在用WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO:31)全D肽处理后48小时在WAT中检测细胞死亡。在肾中和外周血中没有鉴别出细胞死亡，并且甚至在肽剂量加大(至多100毫克/公斤体重)的情况下仍没有达到MTD。这些发现明显地显示了使用靶向肽使细胞毒性结构域靶向脂肪组织的功效，这种靶向肽是使用所公开的方法鉴别并且由于全D氨基酸组成而具有较高稳定性。在一些实施方案中，对脂肪组织中的血管生成性血管结构具有选择性的靶向肽可以用于治疗肥胖相关病症，例如用于减轻体重或用于预防体重增加。通过使抗血管生成部分或毒性部分连接于脂肪靶向肽，可以选择性地抑制供应新脂肪组织的血管，从而防止新的脂肪沉积体生长并且潜在地除去现有的脂肪沉积体。因为棕色脂肪组织血管化程度更高，所以基于血管结构的靶向方法非常有效地将治疗试剂递送到BAT以激活该组织。
[0091]在某些实施方案中，替代治疗剂可以连接于靶向肽或融合蛋白以选择性地递送到例如白色脂肪组织。适合于使用的试剂或因子可以包括诱导细胞凋亡、细胞死亡、细胞停滞和/或抗血管生成的任何化合物。细胞凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育的基本过程，从而维持成体组织中的内稳定，并且抑制癌形成。这些肽的偶合和使用的实例包括(但不限于)美国专利申请 US20090104117、US20060094672、US20060239968、US20090221505、US20080176792和US20080124277。本公开的范围内所涵盖的促细胞凋亡剂的非限制性实例包括短杆菌肽、蛙皮素、蜂毒素、防御素、杀菌肽、(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO:31)、(KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO:32)、(KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO:33)或(KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO:34)。
[0092]在某些实施方案中，包括施用连接于抗血管生成剂的靶向肽，抗血管生成剂如血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、甲酰胺基三唑、CM101、马立马司他、多硫戍聚糖、血管生成素2 (Regeneron)、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156EU6K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、ΤΝΡ470、内皮抑素、紫杉醇、阿库汀、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
[0093]在某些实施方案中，施用连接于细胞毒性剂的靶向肽。这些细胞毒性化学治疗剂包括(但不限于)5-氟尿嘧啶、博莱霉素`、白消安、喜树碱、卡钼、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、匹可霉素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫西芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反钼、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱，或前述物质的任何类似物或衍生物变体。大多数化学治疗剂属于以下类别:烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲、激素剂、天然产物、混杂剂(miscellaneous agent),以及其任何类似物或衍生物变体。
[0094]天然产物一般是指最初从天然来源分离，并且鉴别为具有药理活性的化合物。这些化合物、其类似物和衍生物可以通过本领域技术人员已知的任何技术从天然来源分离，以化学方式合成或以重组方式产生。天然产物包括以下类别，如有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶和生物反应调节剂。这些天然产物的实例包括(但不限于)可以抑制细胞分裂或有丝分裂所需的任一种蛋白质合成的植物生物碱和其他天然剂，例如(但不限于)多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、泰素、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。[0095]化学治疗剂和施用方法、剂量等为本领域技术人员所熟知(参见例如"Physicians Desk Reference", Goodman&Gilman' s" The Pharmacological Basisof Therapeutics〃和〃Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版,第 1035-1038页和第1570-1580页，相关部分通过引用并入本文中)，并且可以与根据本文的公开内容所公开的组合物组合。取决于所治疗的受试者的病状，将必要地发生一些剂量变化。负责施用的人员在任何情况下将决定用于个别受试者的适当剂量。本文还描述了特定化学治疗剂和剂量方案的实例。当然，本文所描述的所有这些剂量和试剂都是例示性而非限制性的，并且技术人员可以针对特定患者和应用而使用其他剂量或试剂。介于这些点之间的任何剂量或其中可引出的范围也预期包括在某些实施方案中。 [0096]在一些实施方案中，靶向WAT的肽可以用于递送促使ASC细胞分化成BAT或促使WAT变成BAT的化合物或试剂。可以用PPAR-Y激动剂使ASC分化成棕色脂肪细胞(Elabd等人Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into functionalbrown adipocytes.Stem Cells27，2753-2760，2009)。因此，在一些实施方案中，靶向PPAR-Y路径的化合物或试剂，例如(但不限于)噻唑烷二酮类药物(如罗格列酮)，也可以偶合于所描述的靶向肽并且用于调节脂肪生成以治疗或预防脂肪相关体组成或体重紊乱，如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症。
[0097]白色脂肪细胞也已经在培养物中和体内直接转化为BAT样表型(Cint1.Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297,977-986, 2009)。这种转化是通过交感神经系统刺激来推动，如低温和通过激活WAT中的b3-肾上腺素能受体而触发的信号转导级联。因此，在一些实施方案中，激活肾上腺素能的化合物或试剂可以偶合于所描述的肽以靶向WAT而使其转化为BAT，并且由此加以使用以治疗或预防脂肪相关体组成或体重紊乱，如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症。
[0098]在一些实施方案中，所公开的肽或蛋白质可以连接于用于各种患病器官、组织或细胞类型的成像和诊断的成像剂。肽或蛋白质经过标记或与用作成像剂的荧光团或放射性示踪剂偶联。许多适当成像剂在本领域中是已知的，使用螯合金属络合物、放射性同位素、荧光标记物或酶使成像剂连接于蛋白质或肽的方法也是已知的，这些螯合金属络合物、放射性同位素、荧光标记物或酶的存在可以使用比色标记物(例如(但不限于)脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶)来检测。
[0099]在一些实施方案中，成像偶联物也将使用放射性同位素加双标记以通过核方法组合成像并且制成独特的环状结构并针对结合亲和力和药代动力学进行优化。这些试剂可以通过本领域技术人员已知的众多方法施用，包括(但不限于)经口施用、吸入、皮下(sub-q)、静脉内(1.V.)、腹膜内(1.P.)、肌内(1.M.)或鞘内注射，或如下文更详细描述。在一些实施方案中，本文所描述的方法和组合物可以单独使用或与其他技术组合使用，以诊断脂肪相关病症的发病并监测和引导脂肪相关病症的的疗法。
[0100]在一些实施方案中，靶向肽可以用于引导分子的无生命装配体的递送，这些无生命装配体如脂质体、微囊体、微粒、纳米粒子、磁珠和微型装置，其呈单独或组合形式，含有抗微生物活性和细胞毒性活性的抗生素或与这些抗生素偶合，抗生素包括(但不限于)博莱霉素、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)、普卡霉素(光辉霉素)和依达比星。可以使用所公开的靶向肽递送的其他类型的细胞毒性剂包括(但不限于)钼配位络合物、蒽二酮、经取代的脲、甲肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和维甲酸。钼配位络合物包括如卡钼和顺钼(顺式-DDP)的化合物。一种例示性蒽二酮是米托蒽醌。一种例示性的经取代的脲是羟基脲。一种例示性甲肼衍生物是丙卡巴肼(N-甲肼;MIH)。这些实例没有限制性，并且预期任何已知的细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或杀细胞剂可以连接于本发明所公开的靶向肽并施用至被靶向的器官、组织或细胞类型。可以用于各种实施方案中的所需靶向肽、细胞毒性肽或杂合肽氨基酸序列包括本文所描述的氨基酸序列，以及其类似物和衍生物。实际上，在一些实施方案中，可以使用由特定核苷酸序列编码的任何所需肽氨基酸序列，也可以使用编码所需肽氨基酸序列的所有或任何部分的任何多核苷酸序列。遗传密码的简并性质也是众所周知的，并且，因此，每个编码靶向肽、细胞毒性肽或杂合肽氨基酸的核苷酸序列一般代表熟知的核酸“三联体”密码子，或在许多情况下代表可以编码氨基酸的密码子。因而，如本文所预期，本文所描述的靶向肽、细胞毒性肽或杂合肽氨基酸序列当与遗传密码一起时(参见例如"Molecular Cell Biology〃，第109页表4-1 (Darnell等人编,W.H.Freeman&Company, New York, NY, 1986)) —般代表可以编码这些氨基酸序列的核酸序列的所有各种变换和组合。
[0101]这些功能上等效的靶向肽、细胞毒性肽、成像肽或杂合肽氨基酸序列包括(但不限于)由核苷酸序列编码的氨基酸序列内氨基酸残基的加入或取代，但其会引起沉默变化(silent change),由此产生功能上等效的基因产物。可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行氨基酸取代。举例来说:非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括 精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0102]或者，可以基于氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)来进行氨基酸取代。每种氨基酸已基于其疏水性和电荷特征而赋予亲疏水性指数。其为:异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。在赋予蛋白质相互作用性生物功能方面使用亲疏水性氨基酸指数在本领域中有所了解(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157:105-132,1982)。据知，在某些情况下，某些氨基酸可以取代具有类似亲疏水性指数或分数的其他氨基酸，并且仍保持类似的生物活性。在基于亲疏水性指数进行改变时，在某些实施方案中，包括亲疏水性指数在±2以内的氨基酸取代；而在其他实施方案中，包括亲疏水性指数在士 I以内的氨基酸取代；并且在其他实施方案中，包括亲疏水性指数在士
0.5以内的氨基酸取代。
[0103]或者，可以基于亲水性来进行氨基酸取代，特别是在由此产生的生物功能性蛋白质或肽旨在用于免疫学实施方案中的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性所主导)与其免疫原性和抗原性相关联，即，与蛋白质的生物特性相关联。以下亲水性值已被赋予这些氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 士 I);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷酰胺(+0.2);甘氨酸(O);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5 士 I);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。在基于类似亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在士 2以内的氨基酸取代；在某些实施方案中，包括亲水性值在±1以内的氨基酸取代；并且在某些实施方案中，包括亲水性值在±0.5以内的氨基酸取代。还可以基于亲水性鉴别来自初级氨基酸序列的表位。
[0104]全长多肽或肽、或肽的截短或突变型式与不相关的蛋白质、多肽或肽融合的融合蛋白的使用可以基于本文所描述的所需肽编码核酸和/或氨基酸序列来设计。这些融合蛋白包括(但不限于)=IgFc融合体，其使蛋白质或肽稳定并延长体内半衰期；与可使融合蛋白锚定细胞膜的任何氨基酸序列的融合体；或与提供标记物功能的酶、荧光蛋白或发光蛋白的融合体。
[0105]在一些实施方案中，靶向肽可能连接于基于脂质体或脂质复合物的递送系统。这些技术的实例描述于〃Liposomes:A Practical Approach " (Torchilin 和 Weissig 编，Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2003)以及美国专利第 4，594，595 号、第 5，459，127 号、第 5，948，767 号和第 6，110，490 号中。
[0106]在某些实施方案中，融合蛋白可以通过利用选择性地结合于所表达的融合蛋白的抗体而容易地纯化。在替代实施方案中，融合蛋白可以通过以下方式纯化:将肽编码核酸序列亚克隆到重组质粒或其一部分中，以转译方式与由六个组氨酸残基组成的氨基末端(N末端)或羧基末端(C末端)标签(“His标签”,参见例如Janknecht等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88 =8972-8976,1991)融合。将从表达这种构建体的细胞得到的提取物加载到Ni2+次氮基乙酸-琼脂糖柱上，并且用含咪唑缓冲液选择性地洗脱组氨酸标记的蛋白质。
[0107]虽然所描述的所需肽氨基酸序列可以通过化学方式合成(参见例如"Proteins:Structures and Molecular Principles"(Creighton编，W.H.Freeman&Company,New York,NY, 1984))，但大的多肽序列可通过重组DNA技术，使用本领域中所熟知的用于表达含有编码所需肽的核酸序列的核酸的技术来产生。这些方法可以用于构建含有肽编码核苷酸序列以及适当转录和转译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组(参见例如〃Molecular Cloning, A Laboratory Manual",同上,和"Current Protocols in Molecular Biology〃，同上)。或者,编码所需肽编码核苷酸序列的RNA和/或DNA可以通过化学方式,使用例如合成器来合成(参见例如"OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach"(Gait 编，IRL Press, Oxford, United Kingdom,1984))。
[0108]可以利用多种宿主表达载体系统来表达肽编码核苷酸序列。当所需肽或多肽可溶或为可溶性衍生物时，可以在不分泌肽或多肽的情况下从宿主细胞培养物中，即从宿主细胞中回收肽或多肽，并且在宿主细胞分泌肽或多肽的情况下从培养基中回收。然而，适合的表达系统还涵盖经过工程改造的宿主细胞，其表达锚定于细胞膜中的所需多肽、肽或功能等效物。所需肽从这些表达系统中的纯化或富集可以使用适当清洁剂和脂质微团以及本领域技术人员所熟知的方法来实现。此外，这些经过工程改造的宿主细胞本身可以在不仅希望保留肽的结构和功能特征，而且希望评估生物活性(例如，在某些药物筛选分析法中)的情况下使用。
[0109]在某些应用中，短暂表达系统是所希望的。然而，对于重组蛋白质或肽的长期、高产量生产来说，稳定表达一般是优选的。例如，可以对稳定表达所需蛋白质、多肽、肽或融合蛋白的细胞系进行工程改造。胜过使用含有病毒复制起点的表达载体，可以使用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择标记物控制的DNA使宿主细胞转化。在引入外来DNA之后，使经过工程改造的细胞在富集培养基中生长约1-2天，然后换到选择培养基中。重组质粒中的可选择标记物赋予抗选择性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长形成聚点(foci)，继而可以克隆并扩充到细胞系中。有利的是，这种方法可用于对表达所需基因产物或其部分的细胞系进行工程改造。这些经过工程改造的细胞系可以特别适用于筛选和评价影响所需蛋白质、多肽或肽的内源性活性的化合物。
[0110]可以使用许多选择系统，包括(但不限于)单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cellll =223-232,1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:2026-2034,1962)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy 等人，Cell22 =817-823,1980)基因，其可以分别用于tk_、hgprt_或aprt_细胞中。抗代谢物抗性也可以用作针对以下基因进行选择的基础:二氢叶酸还原酶(dhfr)，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:3567_3570，1980，和 O ' Hare 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:1527-1531,1981);鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan 和 Berg，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78:2072-2076,1981);新霉素磷酸转移酶(neo),其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colbere-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1-14，1981);和潮霉素B磷酸转移酶(hpt)，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene30:147-156，1984)。
[0111]可以用于提供所公开的方法中使用的组合物的目的的宿主细胞/表达系统包括(但不限于)微生物，如用含有所需肽编码核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis));用含有所需肽编码核苷酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pas`toris));用含有所需肽编码核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus ；CaMV);烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus ；TMV))感染，或用含有所需肽编码核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，C0S、CH0、BHK、293、3T3)，其具有含有所需肽编码核苷酸序列和来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。
[0112]在细菌系统中，许多不同表达载体宜取决于打算用于所表达的所需基因产物的用途而选择。例如，当将要产生大量的这种蛋白质时，例如为了产生包含所需肽的医药组合物，或为了形成针对蛋白质的抗体，可能需要引导高水平的容易纯化的融合蛋白产物的表达的载体。这些载体包括(但不限于):大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther和MUller-Hill，EMBO J.2:1791-1794,1983)，其中所需肽编码序列可以个别地接合到框内具有IacZ编码区的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye, Nucleic Acids Res.13:3101-3110,1985，以及 Van Heeke 和 Schuster，J.Biol.Chem.264:5503-5509,1989)；等等。pGEX载体(GE Healthcare, Piscataway, NJ)也可以用于表达呈与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白形式的所需肽部分。一般来说，这些融合蛋白可溶并且可以通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，随后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱而容易地从溶解的细胞中纯化。PGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，以使得经过克隆的所需肽编码基因产物可以从GST部分中释放。因为，在一些实施方案中，D-氨基酸是优选的，例如，尤其 Park 等人(Production of D-amino acid using whole cells ofrecombinant Escherichia coli with separately and coexpressed D—hydantoinase andN-carbamoylase.Biotechnol Prog.七月-八月；16 (4):564-70, 2000)所描述的那些方法。[0113]在一个例示性昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus ；AcNPV)用作表达所需肽编码序列的载体。这种病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可以将所需肽编码序列个别地克隆到病毒的非必需区域(例如多角体基因)中，并且置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。所需肽编码序列的成功插入将使得多角体基因失活并且产生非封闭型重组病毒(即，缺乏由多角体基因编码的蛋白质外壳的病毒)。然后，使用重组病毒感染其中表达插入的多核苷酸的草地贪夜蛾细胞(参见例如Smith等人，J.Virol.46 =584-593,1983，和美国专利第4，215，051号)。
[0114]在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，可以使所需肽编码核苷酸序列接合到腺病毒转录/转译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可以通过体外或体内重组将这种嵌合序列插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区域(例如，区域El或E3)中将产生存活的并且能够在受感染的宿主中表达所需肽产物的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3655-3659,1984)。特定起始信号也可能为插入的所需肽编码核苷酸序列的有效转译所需要。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况下，可以提供外源性转译控制信号，可能包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应与编码所需肽的编码序列同相以确保整个插入物的转译。这些外源性转译控制信号和起始密码子可以具有多种天然和合成的起点。表达效率可以通过包括适当转录增强子元件、转录终止子等而增强(参见例如 Nevins, CRC Crit.Rev.Biochem.19 =307-322,1986)。
[0115]在酵母中，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子的载体。关于评论，参见例如"Current Protocols in Molecular Biology〃，同上,第第 13 章；Bitter 等人，Meth.Enzymol.153:516-544,1987, " DNA Cloning〃，第 II 卷，第 3 章(Glover 编，IRL Press,Washington, D.C.，1986) ；Bitter, Meth.Enzymo1.152:673-684,1987, " The MolecularBiology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance" (Strathern 等人编，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1981);以及"The MolecularBiology ofthe Yeast Saccharomyces:Metabolism and Gene Expression" (Strathern等人编，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982) ?
[0116]在植物中，可以使用多种不同植物表达载体，并且所需肽编码序列的表达可以由许多启动子推动。例如，可以使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA或19S RNA启动子(Brisson 等人，Nature310:511-514,1984),或 TMV 的外壳蛋白启动子(Takamatsu 等人，EMB0J.6:307-311，1987)。或者，可以使用植物启动子，如RUBISCO的小亚单位的启动子(Coruzzi 等人，EMB0J.3:1671-1679,1984，和 Broglie 等人，Science224:838-843,1984)，或热激启动子，例如大豆 hspl7.5-E 或 hspl7.3-B (Gurley 等人，Mol.Cell.Biol.6:559-565，1986)。可以使用例如Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射或电穿孔将这些构建体引入到植物细胞中。关于这些技术的评论，参见例如Weissbach andWeissbach," Methods in Plant Molecular Biology〃,第 VIII 节(Schuler和 Zielinski编，Academic Press, Inc.，New York, NY, 1988),和"Plant Molecular Biology",第 2 版，第 7-9 章(Grierson 和 Covey 编，Blackie&Son, Ltd., Glasgow, Scotland, United Kingdom,1988)。
[0117]另外，可以选择调节插入的所需肽编码序列的表达，或以所需方式修饰和加工所需肽编码核酸序列的宿主细胞株。蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)可能影响蛋白质的某些功能。不同宿主细胞对于蛋白质和肽的转译后加工和修饰具有特征性和特异性机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的所需蛋白质、多肽或肽的正确或所需修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的所需加工，以及所需肽编码核酸序列的糖基化和/或磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)、VERO、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa、猴肾(COS)、MDCK、293、3T3、WI38、人肝细胞癌(例如，Hep G2)和U937细胞。
[0118]在某些实施方案中，本发明所公开的组合物用于治疗脂肪相关体组成或体重紊舌L如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症。
[0119]在某些实施方案中，本发明所公开的组合物可以与一种或多种用于治疗、管理和/或预防脂肪相关体组成或体重紊乱如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的其他化合物或试剂(“其他活性剂”)组合施用。这些疗法可以按治疗有效剂量施用至患者以治疗或改善脂肪相关体组成或体重紊乱，如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症。治疗有效剂量是指足以促成疾病症状的任何发作延迟、改善或阻滞的化合物量。
`[0120]在一些实施方案中，提供经过分离的肽，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且其中所述肽体内结合于基质细胞。在一些实施方案中，基质细胞位于脂肪组织、纤维化病灶或肿瘤中。
[0121]在一些实施方案中，提供蛋白质组合物，其包含具有SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14、SEQID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物完全由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于成像剂。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于细胞毒性剂或促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于诱导白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织的试剂。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于激活白色脂肪组织中的b3-肾上腺素能受体的试剂。在一些实施方案中，试剂为由D-氨基酸组成的肽。在一些实施方案中，肽经连接子偶合，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。
[0122]在其他实施方案中，提供经过分离的肽，其包含SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18、SEQID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:2U SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO:24
的氨基酸序列，并且其中所述肽体内结合于基质细胞。在一些实施方案中，基质细胞位于肺组织、纤维化病灶或肿瘤中。
[0123]在一些实施方案中，提供蛋白质组合物，其包含具有SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23 或 SEQ IDNO:24的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物完全由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于成像剂。在一些实施方案中，肽或蛋白质组合物偶合于细胞毒性剂或促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，试剂为由D-氨基酸组成的肽。在一些实施方案中，肽经连接子偶合，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。 [0124]在一些实施方案中，蛋白质组合物完全由D-氨基酸组成，并且包含具有SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:
7、SEQID NO:8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽，并且其中所述组合物体内结合于位于例如脂肪组织、纤维化组织或肿瘤组织中的基质细胞。在一些实施方案中，肽偶合于成像剂、细胞毒性剂、促细胞凋亡剂。在一些实施方案中，肽偶合于诱导白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织的试剂，例如(但不限于)激活白色脂肪组织中的b3-肾上腺素能受体的试剂。
[0125]在一些实施方案中，提供经过分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:1、SEQ IDN0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供包含这些核酸分子的表达载体和包含表达载体的宿主细胞。
[0126]在一些实施方案中，提供将细胞毒性肽、促细胞凋亡肽、反式发育肽或成像肽递送到脂肪组织的方法，所述方法包括:(a)使细胞毒性肽、促细胞凋亡肽、反式发育肽或成像肽偶合于具有选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列的靶向肽:SEQ ID N0:U SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:
8、SEQIDNO:9, SEQ IDNO:10、SEQ IDNO: 11, SEQ IDNO: 12, SEQ IDNO: 13, SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16 ;和(b)使经过偶合的靶向肽选择性地结合于脂肪细胞。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽经连接子偶合，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。
[0127]在其他实施方案中，提供将化合物或试剂递送到脂肪组织的方法，其包括:使化合物或试剂偶合的肽暴露于疑似含有脂肪组织的细胞群体，其中所述化合物或试剂偶合的肽包含偶合于选择性地结合于脂肪组织的肽的化合物或试剂，其中所述肽的长度小于100个氨基酸并且包括具有选自由以下各项组成的群组的氨基酸序列的脂肪组织靶向基序=SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:160 在一些实施方案中，肽由 D-氨基酸组成。在一些实施方案中，肽经连接子偶合，并且在一些实施方案中，连接子包含氨基己酸。在一些实施方案中，肽和试剂都是由D-氨基酸组成。在一些实施方案中,试剂包含细胞毒性肽或促细胞凋亡肽。在一些实施方案中，肽由D-氨基酸组成。在一些实施方案中，试剂包含成像剂。在一些实施方案中，暴露包含使受试者暴露于可以偶合于试剂的肽，以治疗肥胖相关病症，例如(但不限于)肥胖症、纤维化或癌症。在一些实施方案中，细胞群体来自人类受试者或在人类受试者中。在一些实施方案中，细胞群体来自兽类受试者或在兽类受试者中。
[0128]在一些实施方案中，细胞在离体(ex vivo)细胞群体中，如同薄的组织切片一样。在一些实施方案中，提供基于化合物或试剂偶合的肽与所述脂肪组织的所述选择性结合来检测异质细胞群体中的脂肪基质细胞的方法。在一些实施方案中，提供检测脂肪基质细胞的方法，同样地鉴别将得益于用肽治疗的患者，靶向肽偶合于化合物或试剂，例如(但不限于)细胞毒性剂或促细胞凋亡剂。患者的实例包括罹患体组成紊乱、体重紊乱、肥胖症、月旨肪营养不良、糖尿病、代谢综合征、纤维化或癌症的人类或兽类患者。
[0129]提供关于WAT7肽(SEQ ID NO:13和14)的分离和表征的具体细节，而且还提供其他WAT靶向肽(SEQ ID NO:1-16)和肺靶向肽(SEQ ID NO: 17-24)，其显示了所公开的方法的一般适用性。
[0130]这些组合物的毒性和治疗功效可以通过标准医药程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如，用于测定LD5tl (50 %群体的致死剂量)和ED5tl (50 %群体的治疗有效剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数，以比率LD5tl / ED5tl表示。展现较大治疗指数的组合物是优选的。在某些 实施方案中可以使用展现毒性副作用的化合物，然而，通常应该谨慎地设计使这些组合物优先靶向受影响组织的部位的递送系统，以使得对未感染细胞的潜在损害降到最低并从而减少副作用。
[0131]从细胞培养分析法和动物研究获得的数据可以用于制定用于人类的剂量范围。这些组合物的剂量优选地处于包括ED5tl而具有极少或没有毒性的循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化，取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。对于任何组合物来说，治疗有效剂量可以最初通过细胞培养分析法估计。剂量可以在动物模型中制定以获得包括如在细胞培养物中所测定的IC5tl ( 即，实现症状的半数最大抑制的测试组合物浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可以用于更精确地确定人类的适用剂量。血浆水平可以例如通过高效液相色谱法来测量。
[0132]当预期对如肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病或代谢综合征、纤维化和癌症的脂肪相关体组成或体重紊乱进行治疗处理时，也可以使用动物研究来确定适当剂量以确定每公斤体重的测试受试者对生物活性剂的最大耐受剂量或MTD。一般来说，所测试的至少一种动物物种为哺乳动物。本领域技术人员有规律地推断出对其他物种(包括人类)有功效并避免毒性的剂量。在进行人类功效研究之前，I期临床研究帮助确立安全剂量。
[0133]另外，生物活性剂可以与多种完善的组合物或结构偶合或复合，这些组合物或结构例如增强生物活性剂的稳定性，或以其他方式增强其药理学特性(例如，延长体内半衰期，降低毒性，等)。
[0134]这些治疗剂可以通过本领域技术人员已知的众多方法施用，包括(但不限于)吸入、皮下(sub-q)、静脉内(1.V.)、腹膜内(1.P.)、肌肉内(1.M.)或鞘内注射，或局部施用(经皮、软膏、乳膏、油膏、滴眼剂，等等)，如下文更详细描述。
[0135]根据本发明所描述的组合物使用的医药组合物可以通过常规方式使用一种或多种生理学上可接受的载剂或赋形剂来配制。
[0136]医药组合物可以包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH值、渗透性、粘度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透的配制材料。适合的配制材料包括(但不限于):氨基酸(例如，甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸)；膨胀剂(例如，甘露糖醇和甘氨酸)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA));络合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精和羟丙基环糊精)；填充剂；单糖、二糖和其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量肽；成盐平衡离子(例如，钠)；防腐剂(例如，苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳萊(thimerosal)、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露糖醇和山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如，普朗尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(例如，聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80)、triton、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊(tyloxapal));稳定性增强剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)；张度增强剂(例如，碱金属卤化物(例如，氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇和山梨糖醇；递送媒介物；稀释剂；赋形剂；以及医药佐剂("Remington' s Pharmaceutical Sciences〃,第18版(Gennaro 编，Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990))。
[0137]另外，所描述的治疗肽可以连接于半衰期延长媒介物。某些例示性半衰期延长媒介物在本领域中是已知的，并且包括(但不限于)Fe结构域、聚乙二醇和葡聚糖(参见例如PCT专利申请公布第W099 / 25044号)。
[0138]可以配制这些试剂用于通过`注射进行胃肠外施用，例如，通过快速注射或连续输注。用于注射的配制品可以呈单位剂量形式，例如，于添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用以下形式，如于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以呈粉末形式，以供在使用前用适合的媒介物(例如，无菌无热原质水)复原。
[0139]试剂也可以配制成用于直肠施用的组合物，如栓剂或保留灌肠剂，例如，其含有常规栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯。
[0140]除了先前所描述的配制品以外，试剂也可以配制成贮存制剂。这些长效配制品可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。例如，试剂可以与适合的聚合或疏水材料(例如呈于可接受的盐中的乳液形式)、粒子交换树脂或微溶性衍生物(例如微溶性盐)一起配制。必要时，组合物可以存在于包装或分配装置中，其可以含有一个或多个含活性成分的单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以附有施用说明书。
[0141]活性组合物可以通过控制释放方式或由本领域技术人员所熟知的递送装置来施用。实例包括(但不限于)美国专利第3，845，770号、第3，916，899号、第3，536，809号、第 3，598，123 号、第 4，008，719 号、第 5，674，533 号、第 5，059，595 号、第 5，591，767 号、第5，120，548 号、第 5，073，543 号、第 5，639，476 号、第 5，354，556 号和第 5，733，566 号中所描述的那些递送装置。这些剂型可以用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球体或其组合提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放，从而提供不同比例的所需释放特征。例示性的持续释放基质包括(但不限于)聚酯、水凝胶、聚交酯(参见例如美国专利第3，773，919号和欧洲专利申请公布第EP058，481号)、L-谷氨酸与Y -乙基-L-谷氨酸的共聚物(参见例如Sidman等人，Biopolymers22:547-556,1983)、聚(甲基丙烯酸2-轻乙酯)(参见例如Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15: 167-277,1981,和 Langer, Chemtech12:98-105,1982)、乙稀乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)，以及聚-D (-) -3-羟基丁酸(欧洲专利申请公布第EP133, 988号)。持续释放组合物可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的若干方法中的任一种来制备(参见例如 Eppstein 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82 =3688-3692,1985,以及欧洲专利申请公布第EP036，676号、第EP088，046号和第EP143，949号)。本领域技术人员已知的适合的控制释放配制品，包括本文所描述的那些配制品，可以容易地选择以供与本发明所公开的组合物一起使用。某些实施方案涵盖适合于经口施用的单个单位剂型，例如(但不限于)适宜于控制释放的片剂、胶囊、囊形片(gelcap)和囊片。
[0142]所有控制释放的医药产品具有改善疗法以超过其非控制对应物所达到的结果的共同目标。理想地，在药物治疗中使用经过最佳设计的控制释放制剂的特征在于采用最少的原料药在最少量的时间内治愈或控制病状。控制释放配制品的优点包括药物的活性延长、施用频率减少和患者顺应性提高。另外，控制释放配制品可以用于影响起始作用时间或其他特征(如药物的血液水平)，并且由此可以影响副作用(例如，不良作用)的出现。
[0143]大多数控制释放配制品经过设计以最初释放快速产生所需治疗作用的量的活性成分，并且逐渐并连续地释放在延长的时间段内维持这种水平的治疗或预防作用的其他量的活性成分。为了在体内维持这种相对恒定水平的活性成分，药物必须以将替代经过新陈代谢并且从体内排出的活性成分的量的速率从剂型中释放。活性成分的控制释放可以由各种条件来刺激，包括(但不限于)PH值、温度、酶、水，或其他生理条件或组成。
[0144]在一些情况下，所公开的方法和组合物的活性成分优选地并不同时或通过相同施用途径施用至患者。因此，在一些实施方案中，提供试剂盒，其当由开业医师使用时可以简化适量活性成分向患者的施用。
[0145]典型试剂盒包含一种或多种所公开的治疗剂的单个单位剂型，其是单独的或与可以与所公开的组合物组合使用的另一种试剂的单个单位剂型组合。所公开的试剂盒可以进一步包含用于施用活性成分的装置。这些装置的实例包括(但不限于)注射器、点滴袋、贴片和吸入器。
[0146]所公开的试剂盒可以进一步包含医药学上可接受的媒介物，其可以用于施用一种或多种活性成分。例如，如果活性成分以必须经过复原以供胃肠外施用的固体形式提供，那么试剂盒可以包含具有适合媒介物的密封容器，活性成分可以溶解于这种媒介物中以形成适合于胃肠外施用的无微粒无菌溶液。医药学上可接受的媒介物的实例包括(但不限于):注射用水USP ;水性媒介物，例如(但不限于)氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringei^ sInjection)、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液，以及乳酸化林格氏注射液(LactatedRinger' s Injection);水可混溶媒介物,例如(但不限于)乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性媒介物，例如(但不限于)玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯和苯甲酸苯甲酯。然而，在具体实施方案中，所公开的配制品并不含有任何醇或其他共溶剂、油或蛋白质。
[0147]以下章节提供关于各种实施方案的实施例的更多细节。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表本
【发明者】所发现的能很好发挥作用的技术和/或组合物。然而，本领域技术人员鉴于本公开应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍获得相同或类似的结果。这些实施例为本文所描述的方法和系统的说明并且不旨在限制本发明的范围。提供关于WAT7肽(SEQ IDNO:13和14)的分离和表征的具体细节，而且还提供其他WAT靶向肽(SEQ ID NO: 1-16)和肺靶向肽(SEQ ID NO:17-24)，其显示了所公开的方法的一般适用性。
实施例
[0148]细胞分离和培养:雌性C57BL/ 6小鼠用于筛选肽文库。为了排除品系/性别特异性变量，雌性CDl小鼠用于肽导向验证和后续细胞分离。用阿佛丁(Avertin)将小鼠麻醉以进行所有研究。
[0149]如先前在美国专利申请20090104117中以及例如Traktuev等人，2008，同上和Zhang等人，2009，同上中所描述，将从皮下和腹膜内WAT的混合物得到的WAT细胞亚群和从对照器官得到的细胞分离。用分散酶(dispase) (BD Biosciences) / I型胶原酶(Worthington Biochemical)消化切碎的组织。在200g离心后作为漂浮的细胞部分分离脂肪细胞。经70 μ m Nitex筛网过滤SVF部分和从对照器官得到的细胞。使用FACSAria(BDBiosciences),以下列IgG克隆将经过分离的细胞分离成个别细胞群体:PE偶联的抗CD34MEC14.7、APC偶联的抗CD31MEC13.3和APC_Cy7 偶联的 CD4530-F11 (BD Biosciences)。如有指示，则在未经涂布的塑料上使细胞于补充有10%胎牛血清(FCS)的DMEM中生长。附着于塑料过夜后，如所描述(Traktuev等人,2008,同上；Zhang等人,2009,同上)从基质细胞培养物中洗掉污染细胞群体。通`过流式细胞测量术，以CD31和CD45抗体，使用LSR II和FacsDiva软件(BD Biosciences)确认经过培养的细胞群体的纯度。
[0150]噬菌体文库筛选:将基于在pill蛋白质上展示插入物CX7C、CX8C和CX9C的源自M13的噬菌体载体fUSE5的随机肽文库混合(1:1:1)成组合的IOltlTU混合文库用于基于尾静脉注射后体内同步生物淘选而进行的筛选(参见例如US20050074747和Arap等人，Nat.Med.8:121-127,2002 ；Kolonin 等人，FASEBJ.20:979-981,2006)。
[0151]对于竞争性导向实验来说，将对于11个所选噬菌体克隆中每一个的5X IO9TU混合，并且注射组合的5.5X 101(ITU。为了验证个别克隆，注射对于每个噬菌体克隆的IXIOi0TUo用IOml磷酸盐缓冲盐水(PBS)循环和心脏灌注I小时后，收集WAT、胫骨/股骨、骨相关骨骼肌和肺。通过冲洗胫骨/股骨来分离骨髓。由涂布有抗TER119、抗⑶31和抗⑶45抗体(BD Biosciences)的Dynabeads (Invitrogen)消耗掉每个器官的细胞悬浮液中的造血细胞和内皮细胞，之后通过FACS处理剩余细胞以纯化⑶34+⑶31-⑶45-细胞。通过感染K91大肠杆菌来回收结合的噬菌体，通过噬菌体转化单位(TU)计数来定量，并且进行处理以如Arap等人2002，同上和Kolonin等人，2006，同上中所描述对肽编码DNA进行测序。为了鉴别保守肽基序，使用ClustalW2软件。 [0152]通过免疫荧光进行小鼠组织和细胞分析:经由尾静脉注射(500μ g)以化学方式合成、经由N末端和C末端半胱氨酸环化、纯化到至少95%纯度(Genemed)和生物素化的肽，并使其循环I小时。对于所有组织分析来说，用IOml PBS心脏灌注之后从麻醉的小鼠中回收器官。在基于EDTA的抗原修复(DAKO)，用0.3% Triton X-100洗涤并且在无血清蛋白阻断剂(DAKO)中阻断之后，如先前所描述(Arap等人，2002，同上，和Kolonin等人，2006，同上)，在福尔马林固定组织的石蜡切片中进行抗原的免疫定位。将链霉亲和素-Cy3(Zymed，l:20)或一级抗体(4°C，12-16小时)和二级抗体(室温，I小时)施加于PBS / 0.05% Tween-20中。使用以下一级抗体:来自Sigma的兔抗卩遼菌体抗体(I:500)、来自Santa Cruz的山羊抗小鼠0)31 (1:150)、来自eBiosciences的大鼠抗小鼠CD45(1:150)、来自 Epitomics 的兔抗小鼠 PDGFRβ 抗体(1:150)，和来自 R&D Systems的山羊抗小鼠DCN抗体(1:200)。二级驴Alexa488偶联和Cy3偶联的IgG来自JacksonImmunoResearch。用 Hoechst33258 或 T0PR03 (Invitrogen)将核染色。用来自 Genetex的抗 GFP 抗体(I: 100)对腔室玻片(Lab-Tek II ；Nalge Nunc International)中培养的细胞进行免疫荧光分析。将免疫染色的组织切片或细胞制剂安放在Vectashield(VectorLaboratories)中。用 Olympus 1X70 倒置突光显微镜 / Magnafire 软件(Olympus)获取突光图像。用Leica TCS SP5显微镜/ LAS AF软件获取共焦图像。
[0153]通过亲和色谱法分离蛋白质:通过使用杜恩斯匀化器(Dounce homogenizer)在含有0.2mM苯基甲烷磺酰氟/ Roche Ρ混合液的PBS中使细胞破裂；使用离心(在4°C下以15，OOOg离心30分钟)将可溶性蛋白与膜小球分离。如先前在美国专利申请20090104117和Nie等人，2008 (Stem Cells26:2735-2745)中所描述使细胞膜蛋白溶解。简单地说，在4°C下于含有ImM CaCl2UmM MgCl2、50mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、0.2mM苯基甲烷磺酰氟/ Roche PI混合液(柱缓冲液)的PBS中孵育膜小球过夜，并进行离心(在4°C下以15，OOOg离心30分钟)以移除不可溶碎片。为了纯化WAT7受体，使5mg半胱氨酸环化肽(Genemed Synthesis)偶合(经由C末端)到0.25ml EDC琼脂糖(Pierce)上，并且用含有1% Triton X-100的柱缓冲液使柱平衡。将肽偶合的树脂与40mg膜提取物一起孵育，用柱缓冲液通过重力流动大量洗涤。用1.0mM肽、随后用0.1M甘氨酸(pH2.8)进行洗脱(0.5ml级分)。为了对洗脱液进行淘选，将20 μ IlO5TU指定噬菌体克隆在4°C下与使用固定在塑料上的Microcon过滤器(Millipore)脱盐的2ml每个级分一起孵育。用大量PBS洗掉未结合的噬菌体，然后通过直接在板上感染宿主K91大肠杆菌来定量结合的噬菌体。对剩余WAT7-噬菌体结合级分进行十二烷基硫酸钠(SDS) -PAGE ；由ProtTech在WAT7特异性条带中进行蛋白质的质谱法鉴别。为了纯化ΛDCN，将20mg抗DCN抗体固定在蛋白质A /G珠(Pierce)上，并且与40mg膜提取物一起孵育。用蛋白质A / G结合缓冲液(Pierce)洗漆后，在贝勒大学医学院蛋白质组学研究室(Baylor College of Medicine proteomicsfacility)中对通过SDS-PAGE鉴别的40kDa条带进行N末端微量测序。为了纯化抵抗素，使用针对环化KLH偶合的半胱氨酸环化WAT7 (Genemed Synthesis)产生的免疫前和免疫后兔抗血清。为了验证抗体特异性，通过将编码CX7C氨基酸的片段与GST标签框内克隆到PGEX4T-1载体中并使用GST结合试剂盒(Novagen)来产生谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记的肽。先前在Nie等人，2008，同上中描述了 GST偶联的肽KGGRAKD (SEQ ID NO:25和26)和抑制素以及肽mP印WLGEffLG (SEQ ID NO:35和36)。
[0154]如上所述从总小鼠WAT SVF提取物中下拉(pull down)结合于WAT7特异性抗体的蛋白质，通过SDS-PAGE解析，并且由ProtTech以质谱法鉴别。为了分离生物素化的ASC蛋白质，使用链霉亲和素偶合的Dynabeads M270 (Invitrogen)。为了分析血衆膜蛋白，使用Qproteome PM分离试剂盒(Qiagen)制备血衆膜富集部分。如Kolonin等人,Nat.Med.10:625-632，2004中所描述，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)进行细胞表面蛋白生物素化。
[0155]免疫印迹和结合分析法:将在SDS-PAGE上解析的蛋白质制剂点溃到Immobilon-FL 膜(Millipore)上，用 Odyssey 阻断缓冲液(Licor Biosciences)阻断，并且如所指示用山羊抗DCN(R&D Systems，1: 1，000)、兔抗ANX2A(Aviva，1:1，000)、兔抗小鼠b-肌动蛋白(Abcam，l =10,000)抗体，或针对WAT7的免疫前和免疫后抗血清(1:1,000)探测(于PBS / 0.05% Triton X-100中)。通过Odyssey成像系统，使用抗山羊IRDye800CW或抗兔IRDye680 (两者都来自Licor Biosciences)检测信号。牛DCN来自Sigma-Aldrich,源自 NSO 的鼠类 DCN 来自 R&D Systems。使用 Superscript 试剂盒(Invitrogen)从 WAT总RNA产生鼠类DCN cDNA。对于细菌表达，通过分别将编码小鼠DCN cDNA(OriGene)或CLIC4eDNA (OriGene)的氨基酸1-354和45-354的片段与His6标签框内克隆到pET28a载体中来产生全长小鼠核心DCN和ADCN同工型。用His标签试剂盒(Novagen)纯化His6标记的蛋白质。对于ELISA结合分析法，涂布100 μ IlOyg / ml指定His6-DCN制剂、His6-CLIC4(对照His6-蛋白质)、NSO细胞表达的小鼠DCN(R&D Systems)、经纯化的牛DCN(Sigma-Aldrich)或 BSA,并且在 4°C下固定到 Maxisorb Immunoplates (96 孔；NUNC)上过夜，随后用3% BSA阻断， 然后与100 μ I指定浓度的WAT7或对照WAT2肽一起孵育。对于脂肪因子结合分析法，将ΗΕΚ293细胞(Enzo Life Sciences)中产生的FLAG标记的小鼠抵抗素、或对照FLAG-BAP蛋白质(Sigma-Aldrich)在指定浓度下孵育。用相应的兔抗肽 Genemed 抗体(1:2,000)或兔抗 FLAG 抗体(Sigma-Aldrich, 1:2,000)探测结合的肽或FLAG-抵抗素，随后用二级山羊抗兔HRP偶联抗体(Millipore，l:5,000)探测，并且用Ultra-TMB (Pierce)底物进行信号检测并在450nm下测量吸光度。
[0156]功能分析法:为了产生稳定转导的细胞系，将编码全长小鼠核心DCN和ADCN同工型的CDNA(OriGene)片段克隆到pLVX_AcGFP-Cl载体(Clontech)中。根据制备商的方案，使用Lent1-X HTX封装系统在Lenti_X293T细胞中产生慢病毒。使用具有单独载体、DCN或ADCN的慢病毒来转导NIH3T3-L1细胞(ATCC)。72小时后，用2 μ g / ml嘌呤霉素处理细胞4-5天以选择稳定的细胞系，之后将其维持于含有0.5μ g / ml嘌呤霉素的培养基中。为了通过MTT分析法测量细胞增殖，将相等数目(5，000个细胞)的早代慢病毒转导体(P2)涂在96孔板上。在指定时间点，在37°C下用CellTiter-Blue试剂(Promega)处理细胞4小时，之后在560发射波长和590激发波长下测量荧光。为了通过如(Nie等人，2008，同上)所描述的转移小室分析法测量细胞迁移，在DMEM / 0.1% FBS中使细胞饥饿2小时，然后将25，000个细胞接种在转移小室插入物(5 μ M孔径)上的相同培养基中。将插入物放置在含有DMEM / 10% FBS的下腔室的顶部，使细胞历时12小时迁移到转移小室的底部，固定，用苏木精/曙红染色并计数。将3T3-L1稳定细胞系(60，000个细胞/孔)放置在12孔板上。如Nie等人，2008，同上中所描述诱导脂肪生成:在汇合后2天，加入含有0.5mMΙΒΜΧ、1.7mM膜岛素、I μ M地塞米松(dexamethasone)和 0.2mM 吲哚美辛(indomethacin)的DMEM / 10% FBS，并且在72小时后用每2天更新一次的含有1.7mM胰岛素的DMEM / 10%FBS替换。
[0157]统计分析:通过使用司徒登氏t检验(Student' s ttest)进行，显著性指定为Ρ〈0.05。
[0158]实施例1:鉴别ASC导向肽
[0159]将通过荧光激活细胞分选(FACS)基于C34+⑶31-⑶45-免疫表型从器官细胞悬浮液中分离MSC的方法(图SB)与噬菌体展示组合，并且针对ASC进行优化。通过修改先前(Kolonin等人，2006，同上)所描述的“同步体内生物淘选”方法，筛选环状CX7CXX8C和CX9C (C:二硫键键合的半胱氨酸；Χ:任何氨基酸)随机肽文库的混合物(图1Α)。这种方法可以从超过IO11个组合肽的库中选择MSC探针。在整个筛选中，观测到从WAT得到以及从所选对照器官:肺、骨髓和骨骼肌得到的MSC上回收的噬菌体粒子数目的渐进式富集(图1Β)。
[0160]编码肽插入物的DNA的测序揭示了从CX7C和CX8C文库中选择克隆，而来自CX9C文库的克隆已有显著损失，这可能是由于在PlII蛋白质中含有较长肽插入物的噬菌体的繁殖缺点。
[0161]在4轮同步体内生物淘选之后，鉴别出以高于I %的频率从ASC重复回收的八个CX7C和CX8C序列，其被称为WATl到WAT8 (见下表1)。平行地，对导向肺基质细胞(LSC)的匹配数目的肽插入物进行测序，作为对照。WAT导向肽中没有一个在肺中富集。以高于1%的频率从肺中重复回收的四个序列被称为LUl到LU4(见下表1)。体内个别噬菌体克隆的比较分析揭示了导向ASC (LSC的1，000`倍)的WAT7，作为对ASC具有最高特异性的肽(图1C)。克隆WAT8在类似于mPep的水平下与LSC相比对ASC展现适度优选性，mPep为先前经过表征的模拟SPARC的肽(Nie等人，2008，同上)。与该观测结果一致，发现WAT8肽的序列(CGQWLGNWLC:SEQ ID NO:15)类似于 mP印(CWLGEWLGC:SEQ ID NO:35)，从而指示整合素β I (integrin β I)(先前确立的MSC标记物)作为WAT8肽的可能受体。因为该研究的焦点是WAT特异性MSC，所以从进一步分析中排除该克隆。对其他所选肽进行体内竞争分析法以鉴别具有最高结合特异性的那些肽。将呈现肽WATl到WAT7 (SEQ ID NO:1-14)和LUl到LU4(SEQ ID NO:17-24)的针对11个克隆的等量噬菌体混合并注射到小鼠中。通过定量编码在从WAT或肺中分离的C34+CD31-CD45-细胞上选择的每个肽的噬菌体的频率来评估每个克隆的导向特异性。与上述数据(图1C) 一致，肽WAT7基于其重导向到WAT细胞的显著能力而突出:其代表87.4%的克隆从WAT回收并且只有5.8%的克隆从肺回收。相反地，克隆LU-1和LU-2展现出重导向到肺(分别为52.2%和40.2% )，但不重导向到WAT (见下表1)。
[0162]实施例2:验证 WAT7 (序列 CSWKYWFGEC 和 SWKYWFGE (SEQ ID NO: 13 和 14))作为靶向ASC的肽
[0163]基于组合的导向数据，选择显示出最确定的ASC靶向的肽WAT7(序列CSWKYWFGEC:SEQ ID NO:13)用于进一步分析。选择肽LU2 (序列CESGFPTVGC SEQ ID NO:19)作为靶向肺中而非WAT中的MSC的对照肽。通过分析静脉内注射后小鼠组织中WAT7展示噬菌体的生物分布来验证WAT7的导向。小鼠组织切片中的免疫荧光显示了噬菌体累积与WAT(图2A)而非肺(图2B)或其他对照器官的基质/血管结构相关联。相反地，LU2累积与肺(图2D)而非WAT (图2C)的基质/血管结构相关联。为了验证在噬菌体情形外肽导向的能力，将侧接有二硫键键合的半胱氨酸的以化学方式合成的环状WAT7和LU2进行生物素化。将每个肽静脉内施用于小鼠中，随后用链霉亲和素偶联的荧光团对组织进行免疫荧光分析再产生WAT7对WAT的选择性(图2)。用分别鉴别内皮细胞和周细胞的CD31特异性抗体和PDGFR^特异性抗体进行共染色，以鉴别靶细胞群体。共焦成像揭示了与先前已确立为ASC的TOGFRP +细胞(图2E-G)相关联的WAT7的血管周定位(参见Traktuev等人，2008，同上)。重要的是，WAT7不会与内皮细胞(图3E)或与渗入WAT的⑶45+造血细胞(图2H)共定位。与关于噬菌体生物分布的数据一致，在经过注射的动物的肺中未检测到WAT7肽(图21)，不过通过TOGFRii免疫荧光揭示了富含MSC (图2J)。与体内导向数据相符，展示WAT7的噬菌体显示了与原代未传代ASC的高水平的特异性结合，但对从相同动物中分离的LSC或对3T3-L1小鼠前脂肪细胞和4T1.2小鼠腺癌细胞并没有显示出这种结合(图9)。[0164]实施例3:分离WAT7受体
[0165]为了鉴别ASC导向肽WAT7的受体，使用亲和色谱法。从小鼠WAT的SVF中提取膜蛋白并且施加于经羧基末端共价偶合于树脂的半胱氨酸环化合成WAT7。首先使用WAT2肽(序列CYKNVDSGGC:SEQ ID NO:3)洗脱，以移除非特异性结合的蛋白质(图3A)。然后特异性结合的蛋白质用WAT7洗脱并且出现在离散子组的级分中。平行地使用WAT2肽亲和柱以确认亲和纯化的蛋白质的特异性。测试涂布到塑料上的脱盐洗脱液的噬菌体-肽结合确认了这些级分含有结合于WAT7展示噬菌体，而不结合于对照WAT2展示噬菌体的蛋白质(图3B)。用来自加载有WAT2的对照亲和柱的WAT7洗脱并暴露于相同膜蛋白提取物的级分并不被WAT7展示噬菌体结合(图3B)。含有下拉并用WAT7特异性洗脱的蛋白质的级分5显示了与WAT7展示噬菌体的最高水平结合并被选择用于受体纯化。将在该级分中洗脱的蛋白质浓缩并通过变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来解析。用WAT7而不是对照肽WAT2特异性洗脱的条带迁移到约40kDa(图3C)。该条带的质谱分析揭示了其含有核心蛋白聚糖(DCN)，或称为蛋白聚糖II。
[0166]因为DCN是经过大量研究的分泌到细胞外基质(ECM)中的分子并且控制若干生理过程。DCN的普遍mRNA表达呈现出与导向WAT中的ASC的WAT7不一致。因此，为了分析小鼠器官中的DCN蛋白质水平，使用针对全长糖基化小鼠DCN产生的市售抗体对一组小鼠组织切片进行共焦免疫荧光分析。与Bolton等人，2008 (Int.J.0bes.32:1113-1121，2008)的先前研究一致，DCN蛋白质可以在许多器官中检测到，然而，与肺和骨髓相比，其特别高地富含于WAT中(图4A-C)。这与在所有器官中都类似的TOGFRii表达成鲜明对比(图4D-F)，如在相同切片中平行地评估。WAT中DCN和TOGFRii的模式难以区分，并且每个蛋白质定位于围绕⑶31阳性内皮的血管周细胞指示了 WAT中的大多数DCN由ASC产生(图4A和4D)。然而，检测肺中(图5B)和一些其他器官中(数据未示出)由一个子组的血管的血管周细胞对DCN的表达表明了由不同亚群的MSC对DCN的表达水平的差异可能不足以说明导向ASC的 WAT7。
[0167]为了表征WAT中的非糖基化DCN的表达，使用针对全长小鼠DCN产生的多克隆抗体对从小鼠组织得到的蛋白质提取物进行免疫印迹分析(图5A)。对从WAT的SVF部分得到以及从肺和骨髓得到的细胞溶质蛋白的分析显示了在这些器官中较高分子量的糖基化DCN同工型的类似表达。相比之下，WAT展现了缺乏硫酸皮肤素/软骨素(dermatan /chondroitin sulfate)葡糖胺聚糖(GAG)链的约40kDa非糖基化核心DCN的较高表达(图5A)。有趣的是，从三个器官得到的膜蛋白的免疫印迹分析揭示了分子量低于在其他器官中先前经过表征的非糖基化核心DCN(Imai等人，Biochem.J.322 (第3部分)，809-814，1997 ;Roughley 等人，Biochem.J.318 (第 3 部分):779-784,1996)的 DCN 同工型的 WAT 特异性表达。在肺和骨髓中这种DCN同工型表达的缺乏从使用针对对照膜蛋白一膜联蛋白II (annexin II ；ANX2A)的抗体探测的相同印迹显而易见,这用于控制蛋白上样(图5A)。免疫印迹还用于表征WAT中哪些细胞表达低分子量的DCN同工型。这些发现指示了其与ASC而非分化的脂肪细胞的膜(而不是细胞溶质)部分排他性地相关联，图16A。
[0168]实施例4:新 DCN 同工型为 CSWKYWFGEC (SEQ ID NO:13)受体
[0169]为了确定被称为ADCN的WAT特异性DCN同工型的身份，使用DCN抗体从WAT中分离出的SVF的小鼠膜提取物中纯化DCN。通过变性PAGE分析免疫沉淀的蛋白质揭示了对应于ADCN的预期40kDa条带(图5B)。从该条带切出的蛋白质的埃德曼降解微量测序揭示了该DCN片段在Leu-45处开始(图5C)，并且因此比先前所描述的在前肽裂解后产生的成熟核心DCN短了 14个氨基酸(Imai等人，1997,同上；Roughley等人，1996,同上)。因此，Λ DCN无法被糖基化，这是因为其缺少核心DCN中所存在的GAG附着位点SerGly (图5C) (Scholzen 等人，J.Biol.Chem.269:28270-28281，1994)。在 ADCN 中所缺少的核心DCN序列中甲硫氨酸的缺乏指示了 ADCN是通过溶蛋白性裂解而不是通过选择性剪接(alternative splicing)来产生。
[0170]为了验证DCN作为WAT7的标靶，采用使用His6标记的蛋白质的酶联免疫吸附分析法(ELISA)。这些体外结合研究显示了 WAT7与经过细菌纯化的重组小鼠DCN的明显剂量依赖性结合，而对照肽WAT2并不展现DCN结合，图16B。有趣的是，WAT7在高于牛血清白蛋白(BSA)所观测的背景的水平下不结合于市售糖基化牛DCN。包括ADCN的进一步分析显示了结合于Λ DCN以及结合于细菌表达(并且因此非糖基化)的DCN核心蛋白的WAT7(图5D)。缺乏高于背景BSA结合的结合于牛或小鼠糖基化DCN的WAT7 (图5D)显示了成熟DCN上的GAG链防止WAT7结合。该发现可以解释为何糖基化DCN普遍分泌到除WAT以外的器官中的 ECM 中(Reed 和 1zzo, Glycoconj.J.19:249-255,2002)不会干扰 WAT7 肽的 WAT 导向。
[0171]为了充当WAT7的受体，ADCN必须暴露于ASC的表面上。通过从SVF的总膜制剂中分离质膜 蛋白部分，显示了 ΛDCN与ASC的细胞膜相关联(图5E)。除了使用替代方法来确认Λ DCN展示于ASC上以外，如(Kolonin等人，2004，同上)所描述对新鲜分离的WATSVF细胞的表面蛋白进行生物素化，之后通过使用链霉亲和素珠分离生物素化的蛋白质，并且进行抗DCN免疫印迹分析。如所预期，分离出ADCN，从而指示其与细胞表面相关联(图5F)。有趣的是，在典型地用于MSC / ASC繁殖的条件下WAT SVF细胞在塑料上过夜培养使得ΛDCN从细胞表面蛋白库中消失(图5F)。这指示了在体内发生的ΛDCN暴露于细胞表面上在细胞培养物中没有保留。最后，与在3T3-L1前脂肪细胞中表达的绿色荧光蛋白(GFP)以重组方式融合的ADCN的细胞定位通过使用慢病毒来显示(图5G)。对照载体转导的细胞主要显示核GFP信号，其重新分布到表达全长DCN-GFP融合体的细胞中的细胞质中。相比之下，表达ADCN-GFP的细胞展现显著不同的定位模式，类似于细胞表面结合的SPARC的定位模式(Nie等人，2008，同上)，这确认了细胞膜ADCN定位。
[0172]实施例5:抵抗素作为ADCN的ASC相互作用蛋白(interactor)
[0173]本
【发明者】所进行的先前工作已显示了肽通过模拟受体的生物配体的受体结合结构域而易于识别细胞表面受体。因此，为了表征WAT7-ADCN结合的潜在生物相互作用并鉴别Λ DCN的生物配体，通过用KLH-肽偶联物使兔免疫来引出针对WAT7的抗体，预期这些偶联物识别由WAT7模拟的小鼠蛋白的结合表位。图6Α显示了所产生的WAT7抗体对WAT7具有高特异性并且不识别在筛选中分离的其他ASC导向肽中的任一种。小鼠蛋白提取物的免疫印迹鉴别出约13kDa的由WAT7抗体识别的蛋白质(图6B)。这种蛋白质高度富含于从WAT组织新鲜分离的SVF中，但不富含于肺或骨髓中。有趣的是，在典型地用于MSC / ASC繁殖的条件下ASC在塑料上过夜培养之后这种蛋白质的表达有损失(图6B)。这种损失与培养物中Λ DCN细胞表面表达的损失相一致(图5F)，从而表明Λ DCN暴露于ASC上与其配体的表达相结合。
[0174]在蛋白质A / G珠上固定的抗WAT7免疫球蛋白(IgG)用于分离ΛDCN配体和对SFV蛋白提取物进行亲和色谱法。通过PAGE解析亲和捕捉的产物(图6C)，之后切出约13kDa的条带。质谱法将这种蛋白质鉴别为已知发挥WAT分泌的脂肪因子的功能的抵抗素(ADSF) (Steppan 等人，Nature409:307-312,2001 ；Kim 等人，J.Biol.Chem.276:11252-11256,2001)。因为抵抗素与DCN的相互作用先前已有报道，所以为了直接确认与ADCN的相互作用，用FLAG标记的小鼠抵抗素进行体外结合分析法。FLAG标记的牛碱性磷酸酶(BAP)充当阴性对照(图6D)。发现抵抗素在比全长DCN低100倍的摩尔浓度下结合于ADCN。有趣的是，抵抗素在结合于糖基化小鼠或牛DCN方面非常低效，如从其类似的背景BSA和BAP结合显而易见。这些结果指示了抵抗素充当ADCN的配体。
[0175]从3T3-L1细胞系得到的细胞是广泛公认的用于研究脂肪细胞祖细胞的生物学的模型并且用于表征Λ DCN的功能。已经确立的3T3-L1培养物用Λ DCN-GFP或全长DCN-GFP融合体以慢病毒方式转导；单独的GFP载体用作对照(图5G)。在培养物中24小时和48小时后使用MTT分析法对细胞数目增加的分析显示了与表达GFP或全长DCN-GFP的细胞相比，表达ADCN的细胞的增殖增加(图7Α)。通过使用Boyden腔室转移小室分析法对细胞迁移的分析显示了与表达GFP的细胞相比，ΛDCN表达细胞的侵入力显著增加，而表达全长DCN的细胞显示出相反趋势(图7Β)。这些结果通过体外刮伤分析法来确认(数据未示出)。最后，对细胞进行脂肪生成诱导以测试对细胞分化的影响(图7C)。
[0176]实施例6:其他肽和结合于人类组织的证据
[0177]通过噬菌体展示选择导向小鼠器官的MSC的肽在图8Α中说明，其含有同步体内噬菌体展示筛选工艺的示意性描述。在每一轮选择中，静脉内施用噬菌体，同时从靶组织回收，扩增，然后汇集并用于下一轮选择。在稍后的轮次中噬菌体转化单位(TU)的回收率增加反映了选择优先导向靶器官的肽。
[0178]图SB说明使用流式细胞测量术鉴别MSC。示出代表性皮下WAT分析。首先进行对CD34+呈阳性的活细胞的门控(左散点图)，然后基于CD31和CD45的表达进行门控(右散点图)，组合起来将ASC细胞鉴别为CD34+CD45-CD31-细胞，其以原始散点图的Q3中的极少紫色事件出现。出现在Ql中的紫色事件对应于⑶34+⑶45-⑶31+上皮细胞(EC)。出现在Q2和Q4中的事件对应于⑶45+造血细胞。
[0179]鉴别出一系列肽克隆并且使用噬菌体展示筛选在脂肪干细胞(ASC)和肺干细胞(LSC)上富集，如下表1中所列。
[0180]表1
[0181]
【权利要求】
1.一种靶向肽，其包含选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列，其中所述肽结合于基质细胞。
2.根据权利要求1所述的靶向肽，其中所述肽包含SEQID N013和SEQ ID N014的WAT7氨基酸序列SWKYWFGE。
3.一种蛋白质组合物，其包含根据权利要求1所述的靶向肽。
4.一种蛋白质组合物，其包含根据权利要求2所述的WAT7氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的靶向肽，其中所述靶向肽完全由D-氨基酸组成。
6.根据权利要求4所述的蛋白质组合物，其中所述WAT7由D-氨基酸组成，并且其中所述组合物结合于脂肪组织、纤维化组织或肿瘤组织中的基质细胞。
7.根据权利要求6所述的蛋白质组合物，其中所述WAT7选择性地结合于ASC细胞的表面上的ADCN。
8.根据权利要求3所述的蛋白质组合物，其中所述靶向肽偶合于选自包含以下各项的群组的效应剂:成像剂、细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、融合蛋白、细胞生长抑制剂、杀细胞剂、放射性同位素、ACS细胞分化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤剂、抗生素剂、酶、化学治疗剂、抗血管生成剂或其组合。
9.根据权利要求8所述的蛋白质组合物，其中所述靶向肽和效应剂由D-氨基酸组成。
10.根据权利要求8所述的蛋白质组合物，其中所述靶向肽由L-氨基酸组成，并且所述效应剂包含D-氨基酸。
11.根据权利要求8所述的蛋白质组合物，其中所述靶向肽由L-氨基酸组成，并且所述效应剂包含L-氨基酸。
12.根据权利要求8所述的蛋白质组合物，其中所述肽偶合于诱导白色脂肪组织转变成棕色脂肪组织的效应剂。
13.根据权利要求12所述的蛋白质组合物，其中所述效应剂激活白色脂肪组织中的b3-肾上腺素能受体。
14.根据权利要求8所述的蛋白质组合物，其中所述效应剂为由D-氨基酸组成的肽。
15.一种制备用以靶向脂肪组织的蛋白质组合物的方法，其包括: 使效应剂偶合于靶向肽，其中所述靶向肽由选自由SEQ ID NO:1-16组成的群组的氨基酸序列组成；并且其中所述靶向肽选择性地靶向细胞脂肪组织。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述效应剂和靶向肽由D-氨基酸组成。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述效应剂由L-氨基酸组成；并且所述靶向肽由D-氨基酸组成。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述偶合包含用连接部分使所述效应剂连接于所述靶向肽。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述连接部分包含氨基己酸、(CH2)4、(CH2)5,(CH2)6、(CH2)7, (CH2)8 或其组合。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述效应剂是选自包含以下各项的群组:细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、成像剂或其组合。
21.一种将效应剂递送到脂肪组织的方法，其包括: 使包含以下各项的蛋白质组合物暴露于包含脂肪组织的细胞群体:偶合于肽的效应剂，其中所述肽由长度小于100个氨基酸的氨基酸序列组成，并且其中所述氨基酸序列包含脂肪组织靶向肽部分，所述脂肪组织靶向肽部分具有选自由SEQ ID ΝΟ:1-16组成的群组的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述蛋白质组合物包含连接子。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向肽基序由D-氨基酸组成。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述效应剂和所述靶向肽由D-氨基酸组成。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述剂包含:细胞毒性剂、促细胞凋亡剂、成像剂或其组合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述剂由D-氨基酸组成。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述暴露包含:使受试者暴露于所述蛋白质组合物以治疗肥胖相关病症，其中所述病症包含肥胖症、纤维化、癌症或其组合。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞群体是在人类受试者中。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞群体为薄的组织切片。
30.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括基于蛋白质组合物与所述脂肪组织的所述选择性结合来检测所述群体中的脂肪基质细胞。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述肥胖相关病症为体组成紊乱、体重紊乱、肥胖症、脂肪营养不良、糖尿病、代谢综合征、纤维化、癌症或其组合。
32.—种肽，其包含选自由SEQ ID NO:17-24组成的群组的氨基酸序列，并且其中所述肽结合于肺组织。
33.一种蛋白质组合物，其包含根据权利要求32所述的肽。
34.根据权利要求32所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物由D-氨基酸组成。
35.根据权利要求32所述的蛋白质组合物，其中所述肽偶合于成像剂、细胞毒性剂、促细胞凋亡剂或其组合。
36.一种包含靶向肽和效应剂的蛋白质组合物，其中所述效应剂包含:短杆菌肽、蛙皮素、蜂毒素、防御素、杀菌肽、(KFAKFAK) 2、(KFXAKFXAK)2、(KHexAKHexAK)2、(KLAKLAK)2,(KLAKKLA) 2、(KAAKKAA) 2、(KLGKKLG) 3、血管紧张素、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血栓蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、甲酰胺基三唑、CM101、马立马司他、多硫戊聚糖、血管生成素2 (Regeneron)、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP470、内皮抑素、紫杉醇、阿库汀、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素、5-氟尿嘧啶、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡钼、苯丁酸氮芥、顺钼(CDDP)、环磷酰胺、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、匹可霉素、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫西芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反钼、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、皮质类固醇激素、有丝分裂抑制剂、亚硝基脲、激素剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、酶、生物反应调节剂、植物生物碱、多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、泰素、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、PPAR- Y激动剂噻唑烷二酮、罗格列酮、荧光团、螯合金属络合物、放射性同位素、荧光标记物、脲酶、碱性磷酸酶、脂质体、微囊体、微粒、纳米粒子、磁珠、微型装置、博莱霉素、放线菌素D、道诺霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)、普卡霉素(光辉霉素)和依达比星、钼配位络合物、蒽二酮、经取代的脲、甲肼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶和维甲酸、卡钼、顺钼(顺式-DDP)、米托蒽醌、羟基脲、 丙卡巴肼、IgFc融合蛋白、酶融合蛋白、荧光蛋白、发光蛋白或其组合和类似物。
【文档编号】C12P21/06GK103703140SQ201280023148
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】米哈伊尔·G·科隆尼, 阿列克斯·达丘那, 张琰 申请人:德克萨斯大学系统董事会