专利名称：牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的基因工程单链抗体、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及其用途，所述单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体外中和活性。
背景技术：
单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将重组技术将抗体轻链可变区'和重链可变区Vh通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体有三种形式1)直接在细胞质中表达；2)与其它菌体融合表达融合蛋白；3)分泌表达具有功能的单链抗体。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤 周围的微循环；3)血液清楚快，肾脏蓄积很少；4)无Fe段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。 奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了 50%，导致的经济损失最大。主要是因为一方面金黄色葡萄球菌具有传染性，另一方面金黄色葡萄球菌对治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用，该单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体外中和活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为(GGAAGATCTAGAGGACTGACC)。所述的单链抗体具有如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。本发明的一种编码所述牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的基因，其具有SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列。为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步涉及酶切位点和识别序列，优选的进一步含有内切酶位点Notl、NcoI和识别序列，其中 NcoI :CCATGG NotI :GCGGCCGC。本发明的一种含有编码上述单链抗体基因的表达载体。所述的表达载体为原核表达载体，优选为pOPElOl-XP载体。
本发明的一种由上述表达载体转化的宿主细胞，所述的宿主细胞为JM109细胞。本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的制备方法，包括以下步骤(I)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因Vh和轻链可变区基因\ ；(2)利用SOE-PCR法将linker与Vh基因和Vl基因相连构建牛源性单链抗体基因；(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPElOl-XP中，构建重组质粒；(4)将步骤(3)的原核表达载体pOPElOl-XP转化入大肠杆菌，培养、表达单链抗体；
(5)分离纯化步骤(4)所得培养产物即获得所述牛源性抗奶牛乳腺炎的单链抗体。(按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行)需要说明的是，以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(Vh)基因和轻链可变区(')基因。利用SOE-PCR (重组链延伸反应)法将linker与Vh基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到原核表达载体pOPElOl-XP中，构建重组质粒并转入大肠杆菌表达，间接ELISA筛选原核表达的抗金黄色葡萄球菌单链抗体的阳性克隆，证明该单链抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外中和活性，并测序后进行Clustalw多序列比较。有益效果本发明提供的牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，能与金黄色葡萄球菌特异性结合，具有一定的体外中和活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。
图I为实施例I的pOPElOl重组载体的结构图；图2为牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的编码基因及对应的氨基酸序列。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例I牛源性抗奶牛乳腺炎单链抗体的制备I :采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取外周核单细胞，用Trizol法(TRIZOLReagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版,采用Oligo primer,根据反转录试剂盒(cDNA第I链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第I链cDNA。2:根据已发表文献的牛抗体编码基因可变区序列(MadhuriKotia, 2010Molecular Immunology ；2011, vaccine)的 FR 区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VHlF和VHlR用于扩增VH区;VLlF和VLlR用于扩增VL区；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL 2F、VL2R用于VL基因加入酶切位点和Linker序列。其中，VL2F、VH2R分别含有Not I和Nco I酶切位点；VH2F、VL2R含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表I中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表I扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
权利要求
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQ ID No. I所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。
2.根据权利要求I所述的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其特征在于所述的中间连接肽为 GGAAGATCTAGAGGACTGACC。
3.根据权利要求I所述的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其特征在于所述的单链抗体具有如SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。
4.一种编码如权利要求I所述单链抗体的基因，其具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中进一步包括内切酶位点 NotI、NcoI 和识别序列，其中 NcoI CCATGG, NotI :GCGGCCGC。
6.一种含有如权利要求3或4所述基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为原核表达载体。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为ρΟΡΕΙΟΙ-ΧΡ载体。
9.一种由权利要求6所述表达载体转化的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为JM109细胞。
11.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的制备方法，包括以下步骤 (1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因Vh和轻链可变区\基因； (2)利用SOE-PCR法将linker与Vh基因和\基因相连构建牛源性单链抗体基因； (3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到原核表达载体ρΟΡΕΙΟΙ-ΧΡ中，构建重组质粒; (4)将步骤(3)的原核表达载体pOPEIOI-XP转化入大肠杆菌，培养、表达单链抗体； (5)分离纯化步骤(4)所得培养产物即获得所述牛源性抗奶牛乳腺炎的单链抗体。
12.—种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在制备治疗奶牛乳腺炎药物、或奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。该单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体外中和活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。
文档编号A61K39/085GK102863528SQ20121041023
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者朱建国, 王曼, 李本强, 张艳玲 申请人:上海交通大学