专利名称：一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种姬松茸提取物在制备降血脂药物中的用途，更具体地本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途。
背景技术：
姬松鸾又名小松燕、巴西蘑燕、柏拉氏蘑燕，“Agaricus Blazei Murill”、“Agaricus”、“ABM”*“Himematsutake”,属担子菌亚门层菌纲伞菌目蘑燕(黑伞)科蘑燕(黑伞)属。该菌原产于巴西，1965年日本引入，成功进行了人工栽培，并于1975年开始商业化生产。1992年我国由福建省农科院首次从日本引进姬松茸并栽培成功，目前在福建、江西等省份有大面积的种植。姬松茸含有丰富的蛋白质和多糖，具有极高的营养价值和药用价 值，在医药领域和保健食品行业中具有很高的开发应用前景。姬松茸具有浓郁的杏仁香味，美味可口，含有丰富的蛋白质和多糖，营养价值很高。姬松茸菌盖嫩,菌柄脆，口感极好,味纯鲜香,食用价值颇高。新鲜子实体含水分85% 87% ;可食部分每IOOg干品中含粗蛋白40 45g、可溶性糖类38 45g、粗纤维6 8g、月旨肪3 4g、灰分5 7g ;已测定的17种氨基酸总量为干重的19. 22%，其中50. 18%为人体必需氨基酸，高于其它食用菌，还含有多种维生素和麦角留醇。姬松茸营养极其丰富，而且组配合乎人体健康要求，尤其引人注目的是医药保健价值。姬松茸富含多种活性成分，可作为免疫调节剂、抗癌剂、抗突变剂和抗菌物质的来源，因而引起全世界的极大关注，具有广泛的应用价值和前景。多糖类物质是姬松茸众多药理作用组分中的重要一种，作为姬松茸提高免疫力、抗肿瘤活性的成分，与姬松茸的药用功能密切相关。在实际应用中，由于姬松茸经过水煮提取的粗多糖中含有游离的杂蛋白质、色素以及其他一些低分子物质(包括寡糖、一些单糖、盐分等)，其中蛋白质含量较高，在药品开发过程中必须将其有效去除方能保证药品的稳定性并防止出现不良反应。因此在姬松茸相关药品开发的实际过程中粗多糖的分离纯化是一个必不可少的步骤。随着姬松茸多糖功能的深入探索，越来越多人对多糖的提取方法进行了研究。目前对多糖的提取方法主要有热水浸提法、溶剂提取法、酶提取法等。现有技术中提取得到的姬松茸多糖主要有两个类型，即分子量为50000的多糖和分子量为2000000的多糖。申请人在研究中发现，上述两种多糖并不是姬松茸中活性最强的多糖。目前，对姬松茸多糖的药理研究主要集中于抗肿瘤活性、增强机体免疫力、影响造血功能、保护肝脏的作用及其它的一些功能，如提供机体消化能力等等。需要注意的是，虽然有部分现有技术指出姬松茸整体具有降血脂作用，但在现有技术中没有姬松茸多糖具有降血脂作用的记载，在现有技术“姬松茸多糖降血糖、降血脂作用的研究”(段县平，等.姬松茸多糖降血糖、降血脂作用的研究[J].四川畜牧兽医，2005，6:34 35)中明确指出，姬松茸多糖没有降血脂作用，“模型组的甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)含量显著高于对照组(P〈0. 05)，说明高血脂模型造模成功。各多糖组小鼠的TG、TC含量与模型组相比，差异不显著，表明姬松茸多糖未显示出降血脂的作用。有学者认为姬松茸子实体中含有的食物纤维以及以亚油酸为主体的不饱和脂肪酸都具有降低胆固醇、改善动脉硬化的作用。再结合本试验结果，推测姬松茸降血脂作用与其所含的多糖类无关”。申请人:经过大量的研究，发现了姬松茸中特定分子量范围的多糖部分，其具有独特的药理活性，药理活性明显强于其他活性部位。尤其是，其具有非常显著的降血脂作用。
发明内容
本发明涉及一种姬松茸多糖在制备降血脂药物中的用途。本发明所述的姬松茸多糖提·取物是姬松茸水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在70万 110万之间的多种多糖复合物。更进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在90万的多糖。更进一步的，本发明涉及的姬松茸多糖提取物是主要以(1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分(1-6)苷键的多糖。更进一步的，所述部分β- (1-6)苷键是分布在主链上，支链上无β- (1-6)苷键的分布。进一步的，本发明所述的姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎，用浓度为95 %乙醇提取后，弃去提取液，残渣加水温浸，期间超声波辅助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。更进一步的，所述姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至60 120目，用2 7倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加3 6倍量水温浸3次，期间每次超声波30min辅助提取，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%,沉淀20小时,沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。更进一步的，所述姬松茸多糖提取物的制备方法是，取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5. 0，40°C下酶解60min，升温至80°C灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用sephadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的组分。更进一步的，本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。更进一步的，本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备增强免疫药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。
更进一步的，本发明涉及一种姬松茸多糖提取物在制备降血糖药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。本发明中，采用苯酚一硫酸法测定多糖含量，具体测量方法可参考“曲秀梅，樊英丽.姬松茸多糖的含量测定[J].局解手术学杂志，2004，13 (2) :141”，在此引入作为参考，经测量，本发明的姬松茸多糖提取物含量达到95% 100%。本发明中,姬松鸾多糖经sepharose CL-6B测定分子量分布和纯度,使用葡聚糖制备标准曲线。取5mg溶于Iml蒸懼水中，充分混勻，离心除去杂质,上sepharose CL-6B凝胶柱层析(I. 5X90cm),O. 9% NaCl溶液洗脱，用苯 )—硫酸法测定糖分布，结果再次显示，提取物的分子量分布于50万 150万之间，或70万 110万之间，或90万。本发明中采用如下方法分析多糖中的单糖组成，样品IOmg经2mol/L三氟乙酸120°C封管水解3h，蒸干去除三氟乙酸，加Img肌醇和O. ImoI/L的Na2CO3 lml，30°C保温50min,加KBH4 50mg,室温放置I. 5h，用25%乙酸中和KBH4,并用阳离子交换树脂除盐，加甲醇干燥，重复3次，将干燥物85°C真空加热2h，加Iml正丙胺和Iml无水吡啶，55°C保温30min, N2吹干，加O. 5ml无水吡啶和O. 5ml乙酸酐，90°C保温lh, N2吹干，加Iml无水二氯甲烷，离心，取上清用气相色谱测定。气相色谱法(GC):仪器Vavian 3400气相色谱仪附FID 检测器，HP3365 化学工作站；色谱柱SE_30 50mmX0. 20mmX0. 25 μ m ;气化280°C ;检测280°C ;柱温从 130。。(2min)，升温 10°C /min，至 250°C (20min);载气高纯氮气。结果显示，单糖主要为葡萄糖、半乳糖和甘露糖。本发明中测定多糖的结构采用如下方法，C13NMR ;仪器IN0VA-500 ;工作频率125MHz ;测试温度20°C ;累积时间16h ;溶剂重水。以及红外光谱分析，样品经溴化钾压片，4000 400 cm -I区间扫描红外吸收，用Nicolet360型傅立叶变换红外光谱仪记录红外光谱。结果显示,本发明的姬松茸多糖提取物主链中主要为(1-3)-D葡聚糖为主链，并 有部分(1-6)苷键。并且进一步的，部分β- (1-6)苷键是分布在主链上，支链上无β- (1-6)苷键的分布。本发明经过实验证实，上述姬松茸多糖具有显著的抗肿瘤、增强免疫力作用，其较现有技术中提取的其他多糖作用有显著增强。更加值得关注的是，本发明的多糖具有非常显著的降血脂作用，而现有技术中的多糖没有降血脂作用。进一步的，本发明的提取物还可以作为活性成分与药学上可接受的载体制备成具有治疗肿瘤、糖尿病、高血脂的药物。该药物可以是各种剂型如片剂、颗粒剂、口服液、胶囊齐U、丸剂、注射液等。实施例I
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40°C下酶解60min，升温至80°C灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100%;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。实施例2
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40°C下酶解60min，升温至80°C灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Se vag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在70万和110万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100%;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。实施例3
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至100目，用5倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加4倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40°C下酶解60min，升温至80°C灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在90万的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为100% ;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。实施例4
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至60目，用7倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加3倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为80%，沉淀15小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40°C下酶解60min,升温至80°C灭活酶活性,然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为99% ;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。实施例5
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至120目，用2倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加6倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取2次，水提液合并后，加乙醇至浓度为60%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5. 0，40°C下酶解60min，升温至80°C灭活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为959%;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。实施例6
取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎至70目，用5倍量浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加5倍量水60°C温浸，期间每次超声波30min辅助提取，重复提取3次，水提液合并后，加乙醇至浓度为75%，沉淀20小时，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖浓度的2%加入中性蛋白酶，调节pH值为5.0，40°C下酶解60min,升温至80°C灭活酶活性,然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次)，然后用s印hadex G200凝胶柱层析分离，以O. 5mol/L的NaCl溶液洗脱，收集平均分子量在50万和150万之间的部分，浓缩、干燥，即得姬松茸多糖提取物。经测定，其多糖含量为99% ;主链中主要为β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键。效果试验例I本发明提取物对小鼠NK细胞杀伤活性的影响。 将细胞浓度为I X IO7 · mr'SlSO瘤株，给6周龄BALB/c雄性小鼠每只右后侧腋窝皮下接种O. 2ml (2X IO6Cell)复制动物模型，从模型复制后第2天起，实施例I低剂量组按50mg · kg-1 · d-1、中剂量组按100 mg · kg-1 · d_l和高剂量组按200mg · kg-1 · d_l腹腔注射给药，模型对照组和空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。另外，按实施例I的制备方法，分别制备包含从O 220万分子量的全多糖、分子量5 30万的低分子量多糖和分子量从180 220万的高分子量多糖,分别按100 mg · kg-1 · d-1给药。给药共7天。给药结束后24h，脱颈椎处死小鼠。75%酒精浸泡消毒后，在无菌条件下取出脾脏并制成单个脾细胞悬液，O. 83% Tris-MMCl破坏红细胞，洗涤脾细胞后，用RPMI-1640完全培养液调脾细胞浓度为1X106 ·ι 1-1。将lX106cell · ml_l脾细胞加入96孔细胞培养板中，将Yac-1细胞(调细胞浓度为1X105 ·πι1-1)取50μ I分别加于测试孔内，使效靶比为10 1，加1640培养液100 μ I。另外3孔为效应细胞对照孔，每孔加入脾细胞为50 μ 1，1640培养液150 μ I。同时另设3孔为靶细胞对照孔，浓度为I X 105 il-lYac-l细胞悬液50 μ I/孔，完全1 ^1-1640培养液15(^1/孔。混勻，在5% C02、37°C条件下培养20h后，每孔加入浓度为5mg · ml-ΙΜΤΤ 10 μ 1，在5%、37°C中继续培养4h。培养结束后，离心，弃上清，每孔加入二甲亚砜ΙΟΟμΙ，微型振荡器震荡数分钟，使颗粒完全溶解。酶联免疫检测仪在570nm波长处检测各孔吸光度。自然杀伤率％=[1_(实验孔OD57tl-效应细胞孔OD57tl)/靶细胞OD57J X 100%，NK细胞活性实验数据经Tamhane检验结果见表I。表I对NK细胞活性的影响(X土 s)
权利要求
1.一种姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。
2.如权利要求I所述的姬松茸多糖提取物在制备降血脂药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是采用如下方法制备得到的取姬松茸子实体或人工培养的菌丝体粉碎，用浓度为95%乙醇提取后，弃去提取液，残渣加水温浸，期间超声波辅助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，收集需要分子量范围内的组分，即得。
3.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是分子量在70万 110万之间的多种多糖复合物。
4.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是分子量在90万的多糖。
5.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是主要以β- (1-3)-D葡聚糖为主链，并有部分β- (1-6)苷键的多糖。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是所述部分β- (1-6)苷键是分布在主链上，支链上无β- (1-6)苷键的分布。
7.—种姬松茸多糖提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。
8.—种姬松茸多糖提取物在制备增强免疫药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。
9.一种姬松茸多糖提取物在制备降血糖药物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取得到，分子量在50万 150万之间的多种多糖复合物。
全文摘要
本发明涉及一种从姬松茸中提取得到的多糖提取物的制药用途，其分子量在50万至150万之间，制备方法为，用浓度为95％乙醇提取后，弃去提取液，残渣加水温浸，期间超声波辅助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脱蛋白，然后用sephadex凝胶柱层析分离，其具有显著的药理活性，具有显著的降血脂作用，以及抗肿瘤、增强免疫力和降血糖作用。
文档编号A61P3/06GK102920730SQ20121044642
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者于惊涛 申请人:中海科创(北京)生物医药科技有限公司