专利名称：组织工程胶原—透明质酸—硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学组织工程材料领域，是一种的组织工程胶原一透明质酸一硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法。
背景技术：
近年来，组织工程重建在软骨、骨、皮肤、血管等领域迅速发展并取得了重大成就，也有相关产品如血管、皮肤、骨已经应用于临床。作为组织工程种子细胞的粘附增殖载体的支架材料种类繁多，是目前生物材料领域的热门和重点。支架材料为细胞提供获取营养、气体交换、排泄废物、生长分化增殖的场所，也是组织工程重建组织器官的物质基础。理想的组织工程支架应具备以下基本条件1、良好的生物相容性及生物机械性能；2、合适的生物降解性；3、良好的可塑性；4、易于灭菌、消毒。目前组织工程支架主要分为天然生
物材料和人工合成材料，如胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸盐、生物陶瓷、羟基磷灰石、聚乳酸等。其中胶原、明胶、壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性等而被广大研究者青睐，尤其是在组织工程与重建领域。制备胶原类支架的常用方法为冷冻干燥法，即将胶原或胶原与其他生物材料的混合溶液低温冷冻干燥，制备出特定形状的三维多孔支架，如中国专利CN1394655经冷冻一冻干，再进一步通过真空干热法、醛类化合物或碳化二亚胺类化合物交联制备胶原/壳聚糖多孔支架，主要用于组织工程学支架；此种支架具有胶原支架的一般特点，但其孔隙率及均一性相对欠佳。静电纺丝技术是近几年来在材料领域兴起的一项革命性技术，特别是在组织工程材料方面得到了广泛研究，也是研究的一个热点。静电纺丝通过高压静电的方式纺丝，制备出孔隙率高，孔径及纤维直径在一定范围内可控的三维多孔支架，目前与胶原静电纺丝有关的专利非常少，如中国专利CN102477590A经静电纺丝技术制备了一种低分子量胶原肽及壳低聚糖的生物膜，主要用于医药行业；又如中国专利CN1944724经静电纺丝技术制备了一种胶原蛋白和壳聚糖复合纳米纤维，主要应用于仿生组织细胞外基质和药物缓释。上述专利工艺较复杂，可控性较差，需要较多的催化剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备工艺简单可控，反应条件温和，无需催化剂的组织工程用的新型胶原一透明质酸一硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法。本发明所述的胶原一透明质酸一硫酸软骨支架的制备方法按下列步骤进行
(O配制溶剂按I 一 10:1体积比配制好2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水作溶剂；
(2)配制电纺液向溶剂中加入胶原、透明质酸和硫酸软骨素，胶原透明质酸硫酸软骨素之间的重量比为4一 16 1 0. 5—3，搅拌速度100—3000rpm，搅拌I一 10天后得到电纺液；
(3)静电纺丝电纺液在由高压电源、溶液储存装置、喷射装置与接收装置组成的高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的温度10 — 40°C，静电纺丝电压10 — 30kv，喷射装置中所需针头型号为5—8号，针头与接收装置的距离为5 — 15cm，喷射装置送液速度5—25ml/h，即得到胶原一透明质酸一硫酸软骨素静电纺丝支架。本发明中，所用的溶剂即三氟乙醇和蒸馏水的体积比最佳比例为1:1。所述的胶原大分子量胶原，分子量在I万一30万之间。本发明中电纺液最佳搅拌时间为3天，最佳搅拌速度为500rpm。所述的静电纺丝最佳温度30°C。所述的喷射装置中所需针头最佳型号为6号。所述的针头与接收装置的最佳距离为10—12cm。 所述的喷射装置送液最佳速度9一 llml/h。所述的胶原一透明质酸一硫酸软骨素电纺液的最佳浓度为8%到10%。所述的胶原一透明质酸一硫酸软骨素之间的最佳比例为6—8 :0. 5—1 :0. 5— 2。本发明的关键是将2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水按一定比例混合，使在常温中性条件下不溶于水的胶原和不溶于有机溶剂的透明质酸、硫酸软骨素共溶于该溶剂，并能顺利进行静电纺丝。这是目前其他有机溶剂如6—氟异丙醇等有机溶剂所无法完成的。本发明方法制备的支架，不仅具有三维多孔的结构，同时还具有细胞外基质高度仿生的性质，组织相容性良好，大小形状可控，支架孔隙率及纺出的纳米纤维的直径在一定范围内也能控制。而且人体组织大多数细胞外基质是由水、胶原蛋白、多聚糖(透明质酸及硫酸软骨素等)和无机质等构成的网络，因此胶原-透明质酸-硫酸软骨素支架在组织工程支架领域特别是在软组织工程支架上具有广泛的应用前景。本发明具有下述特点和优点
(O制备工艺简单可控，反应条件温和，设备简单；
(2)支架孔隙率较高，孔隙分布均匀，且可根据需要进行调节；
(3)将该支架可作为多种细胞培养粘附增殖载体，节约空间，支架上细胞增殖生长量可达普通载体的数10倍以上，可用于细胞的扩增；
(4)该支架成分接近软骨细胞外基质的主要固相成分，具有高度的仿生性，生物相容良好，无细胞毒性，是一种良好的组织工程支架材料。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详述。实施例I :
预先按I: I体积比配好2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水作溶剂，取胶原SOmg加溶剂Iml浸泡过夜后+透明质酸IOmg+硫酸软骨素IOmg配成总浓度10%的混合液，100 rpm,搅拌10天即为电纺液，电纺液在由高压电源、溶液储存装置、喷射装置与接收装置组成的高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝电压20kv、本实施例用5ml玻璃注射器、6号针头、针头距接收板距离10cm、注射泵送液速度10ml/h、环境温度30°C。进行静电纺丝后得到胶原一透明质酸一硫酸软骨素三维静电纺丝三元纳米生物支架。实施例2:
预先按2:1体积比配好2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水作溶剂，胶原SOmg加溶剂Iml浸泡过夜后+透明质酸20mg+硫酸软骨素IOmg配成总浓度11%的混合液,500rpm,搅拌3天即为电纺液，电纺液在高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝电压30kv、本实施例用5ml玻璃注射器、8号针头、针头距接收板距离15cm、注射泵送液速度15ml/h、环境温度10°C。进行静电纺丝后得到胶原一透明质酸一硫酸软骨素三维静电纺丝三元纳米生物支架。实施例3
预先按10:1体积比配好2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水作溶剂，胶原SOmg加溶剂Iml浸泡过夜后+透明质酸5mg+硫酸软骨素15mg配成总体浓度10%的混合液,3000rpm,搅拌I天即为电纺液，电纺液在高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝电压30kv、本实施例用5ml玻璃注射器、5号针头、针头距接收板距离5cm、注射泵送液速度5ml/h、环境温度20°C。进行静电纺丝后得到胶原一透明质酸一硫酸软骨素三维静电纺丝三元纳米生物支架。实施例4: 预先按5:1体积比配好2，2，2—三氟乙醇和蒸馏水作溶剂，胶原87. 3mg加溶剂Iml浸泡过夜后+透明质酸10. 9mg+硫酸软骨素21. 8mg配成总体浓度12%的混合液，IOOOrpm,搅拌2天即为电纺液，电纺液在高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝电压10kv、本实施例用5ml玻璃注射器、8号针头、针头距接收板距离5cm、注射泵送液速度25ml/h、环境温度40°C。进行静电纺丝后得到胶原一透明质酸一硫酸软骨素三维静电纺丝三元纳米生物支架。
权利要求
1.一种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于按下列步骤进行 (1)配制溶剂按I一 10:1体积比配制好2，2，2—三氟こ醇和蒸馏水作溶剂； (2)配制电纺液向溶剂中加入胶原、透明质酸和硫酸软骨素，胶原透明质酸硫酸软骨素之间的重量比为4一 16 1 :0. 5—3，搅拌速度100—3000rpm，搅拌I一 10天后得到电纺液； (3)静电纺丝电纺液在由高压电源、溶液储存装置、喷射装置与接收装置组成的高压静电纺丝装置中进行静电纺丝，静电纺丝的温度10 — 40°C，静电纺丝电压Ikv — 30kv，喷射装置中所需针头型号为5—8号，针头与接收装置的距离为5 — 15cm，喷射装置送液速度5—25ml/h，即得到胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架。
2.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所用的溶剂三氟こ醇和蒸馏水的体积比比例为1:1。
3.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的胶原为大分子量胶原，分子量在I万一30万之间。
4.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在干电纺液搅拌时间为3天，搅拌速度为500rpm。
5.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的静电纺丝温度为30°C。
6.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的喷射装置中所需针头型号为6号。
7.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的针头与接收装置的距离为IOcm — 12cm。
8.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的喷射装置送液速度为9一llml/h。
9.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的胶原一透明质酸ー硫酸软骨素电纺液的浓度为8%到10%。
10.根据权利要求I所述的ー种组织工程胶原一透明质酸ー硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于所述的胶原一透明质酸ー硫酸软骨素之间的比例为6— 8 :0. 5—1 .0.5—2 o
全文摘要
本发明公开了一种组织工程胶原—透明质酸—硫酸软骨素静电纺丝支架制备方法，其特征在于按下列步骤进行，配制溶剂，配制胶原液，配制电纺液，静电纺丝。本发明方法制备的支架，不仅具有三维多孔的结构，同时还具有细胞外基质高度仿生的性质，组织相容性良好，大小形状可控，支架孔隙率及纺出的纳米纤维的直径在一定范围内也能控制。而且人体组织大多数细胞外基质是由水、胶原蛋白、多聚糖(透明质酸及硫酸软骨素等)和无机质等构成的网络，因此胶原-透明质酸-硫酸软骨素支架在组织工程支架领域特别是在软组织工程支架上具有广泛的应用前景。
文档编号A61L27/56GK102949751SQ201210493698
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者冯刚, 杨泽龙, 陈竹, 刘康 申请人:川北医学院第二临床医学院