专利名称：一种修饰组织工程支架的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是一种运用分子组装技术修饰组织工程支架的方法，和该方法获得的组织工程支架的组织结构及其应用。
背景技术：
生物支架的制备是组织工程学研究的重要内容之一，理想的生物支架应具备以下特性1.具有良好的生物相容性，能促进细胞的黏附并为细胞在其表面增殖提供适宜的微环境，在体外培养时无细胞毒性，植入体内时不会引起机体炎症和排斥反应；2.具有三维立体结构，内部互相贯通形成开放孔道结构，为细胞提供足够的黏附空间，并利于营养物质和代谢产物的传输；3.具有生物可降解性，与细胞的增殖速度相匹配，且降解产物对细胞繁殖无害，容易被机体代谢或吸收；4.可塑性强，方便构建与需要再生、修复的组织器官相同的外形；5.具有与被移植组织器官相适应的力学性能；6.方便消毒杀菌处理，且不影响材料的性质。作为生物材料应用的形式之一，水凝胶可定义为在水中溶胀并保持大量水分，可降解或不可降解的聚合物。由于水凝胶网络中充斥有大量的水分，使得整个材料具备了一种流体的性质，这与充盈有大量水分的机体组织极其相似，利于营养物质的传输和细胞代谢产物的排出，柔软湿润的表面以及组织亲和力大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得水凝胶具有良好的生物相容性。水凝胶因其流动性很容易充满整个不规则的缺损部位，手术创伤非常微小且易于操作，最适合用于构建力学强度较低的软组织器官。用于制备水凝胶的材料有壳聚糖，海藻酸盐，透明质酸，聚乙烯醇等。其中，壳聚糖为甲壳素脱乙酰基产物，是天然多糖中唯一的碱性多糖，它由β_(1，4)糖苷单元连接组成，这些糖苷单元上还随机地带有N-乙酰基结构，因而它具有糖胺多糖和透明质酸的部分特点。壳聚糖在自然界广泛存在，取材便利，生物相容性良好，可生物降解且降解产物无毒性。大多数哺乳动物细胞是贴壁细胞，它们必须在适宜的基质上贴附、铺展才能正常代谢增殖和分化。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要作用是介导细胞黏附。细胞外基质中有许多细胞受体识别的多肽和糖配体，此类受体、配体相互作用对维持细胞功能具有很重要的作用，同时还能赋予细胞环境的响应性。细胞外基质的首要功能是介导细胞黏附，大多数细胞缺乏黏附就会凋亡或死亡，而丧失黏附相关信号传导途径会使癌性肿瘤生长和扩散。通过表面修饰的方法可以在水凝胶网络中模拟细胞外基质，从而促进并调控细胞生长和组织构建。目前主要运用等离子沉积(聚合)蚀刻、辐射接枝、湿化学反应、吸附、光反应、固定化等方法对支架材料表面改性，以改善支架材料的生物相容性，从纳米到微米尺度上调控表面的拓扑结构，诱导细胞行为或生物矿化，控制生物活性物质的释放速率，防止蛋白质或细胞黏附和组织黏连等。这些方法存在诸如有机试剂残留，过程复杂，成本过高等不足之处，限制了实际应用。以湿化学反应修饰组织工程支架材料为例，Boccafoschi等将聚乳酸(PLLA)支架置于乙醇/水溶液中部分水解酯基，然后通过EDC/NHS反应在酸性MES溶液中活化支架中的羧基连接生物活性分子RGD中的氨基，其中RGD是细胞黏附蛋白纤维粘连蛋白(fibronectin)的重要片段，从而在支架材料表面修饰RGD以增强细胞在材料表面的黏附能力。(Boccafoschi F, Fusaro L, Mosca C，Bosetti M, Chevallier P, Mantovani
D,Cannas M.The biologicalresponse ofpoly (L-Iactide)fiIms modified bydifferent biomolecules: Role of thecoating strategy. J. Biomed. Mater. Res. PartA, 2012，100A, 2373-2381.)上述湿化学反应修饰支架材料的缺点在于I.破坏生物活性分子的活性。EDC/NHS反应在酸性MES溶液中进行，pH=5. 6，此溶液中RGD分子上的活性位点可能减少。2.生物活性分子的选择有限。在支架材料上修饰生物活性分子需要满足EDC/NHS反应的条件要求，即反应物分子中必须含有羧酸或伯胺基。3.生物活性分子的含量无法控制。EDC/NHS反应剧烈，无法精确控制连接R⑶分子的数量。反应完成后支架材料不可以再次进行EDC/NHS反应连接RGD分子。层层组装技术(Layer-by-Layer assembly technique, LbL)最初是基于聚电解质所带正负电荷间相互作用开发的一种超分子自组装技术，而后拓展到氢键作用、疏水作用及生物分子间特异性识别作用等都可以作为层层自组装膜的驱动力，这大大延伸了此技术在生物材料制备及改性中的应用潜力，组装材料涉及功能性聚电解质、生物活性分子、纳米粒子、有机/无机微粒、细菌、病毒等。在组织工程领域，运用层层组装技术修饰支架材料具有如下优势1.组装分子的选择范围广泛，生物活性分子(如蛋白质、多糖、DNA等)都含有分子间相互作用位点，合适的条件下可以用于组装；2.制备工艺简单，通过简单的交替浸涂技术可实现在分子水平上对支架结构和功能的设计；3.制备条件温和，可在常温水溶液中进行，从而保持生物分子的天然活性，不影响其物理化学性质；4.适用的基体材料种类多，对基体材料的体型结构适应性强，并可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。通过层层组装技术把细胞外基质组分直接固定在材料表面，从而在材料表面覆盖一层细胞外基质，使材料的细胞相容性明显提高,这类研究已成为细胞相容性材料研究中的热点。采用人为的方式形成材料一细胞外基质复合层，可通过选择特定细胞外基质(如促进细胞黏附的透明质酸、软骨素、纤维粘连蛋白、胶原等)或类细胞外基质，改善细胞在材料表面的黏附及生长性能，是一种简单有效的方法。
发明内容
针对组织工程支架表面修饰中存在的有机试剂残留，过程复杂，成本过高等问题，本发明的目的在于运用层层组装技术修饰组织工程支架，提供一种简单实用，可控性强，清洁低成本的方法修饰组织工程支架。一种修饰组织工程支架的方法，包括如下步骤a.将组织工程支架浸于活性组分I水溶液中f 8小时；b.将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分I ;c.将完成步骤b的组织工程支架浸于活性组分II水溶液中广8小时；d.将完成步骤c的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分II ;e.重复 a_d 步骤 η 次,O < η < 100。
其中，所述组织工程支架、活性组分I或活性组分II之间是通过静电、氢键、范德华力、疏水作用、共价键、分子特异性识别作用中的至少一种作用力相互结合的。所述活性组分I和活性组分II可以根据所修饰组织工程支架表面分子的电荷、组成、化学键以及目标组织的细胞外基质成分等因素选择。优选地，所述活性组分I在其水溶液中的质量百分比为O. riwt. % ;所述活性组分II在其水溶液中的质量百分比为O. riwt. %0进一步地，所述活性组分I是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的至少一种；所述活性组分II是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。所述组织工程支架包括水凝胶支架，优选地，所述组织工程支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得水凝胶支架。进一步地，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。进一步地，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl3水溶液、CrCl3水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。本发明还提供由修饰组织工程支架方法获得的一种组织工程支架的组织结构，包括组织工程支架，所述组织工程支架外包覆有交替层叠的活性组分I及活性组分II。这种交替层叠结构能减少或避免活性组分的流失，将活性组分固定在支架上。其中，所述组织工程支架、活性组分I或活性组分II之间是通过静电，氢键，范德华力，疏水作用，共价键，分子特异性识别作用中的至少一种作用力结合的。进一步地，所述活性组分I是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、海藻酸钠、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的至少一种。进一步地，所述活性组分II是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。优选地，所述组织工程支架包括水凝胶支架，所述水凝胶支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得。进一步地，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。进一步地，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。本发明还提供这种组织工程支架的修饰方法在制备医疗器械中的应用，具有良好的生物相容性。本发明在常温水体系中进行，通过活性组分与组织工程支架之间的相互作用将活性组分层层组装在组织工程支架网络中，组装的成份和层数可调，此方法简单实用，可控性强，清洁低成本。
图I为本发明实施例I修饰水凝胶支架的流程示意图。图2为本发明实施例I水凝胶支架不同组装层数的表面Zeta电位变化图。图3为本发明实施例I水凝胶支架中软骨素随不同组装层数的含量变化图。图4a为本发明实施例I水凝胶支架中细胞的扫描电镜图，图4b为图4a的局部放大图。图5为本发明实施例I在不同培养时间点细胞/支架材料中的DNA总量示意图。
具体实施例方式在下文将结合附图及实施实例对本发明进行详细描述，其目的是使本技术领域技术人员更容易理解本发明的实施及优点，而不能构成对本发明的限制。除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。实施例I本实施例的组织工程支架是采用交联剂和凝胶组分制备的水凝胶支架，例如，交联剂是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液或乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种，凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇或聚丙烯酸中的至少一种，两者发生交联反应获得水凝胶支架。具体制备方法可参见申请号为201010237869. X的发明申请“生物大分子的水凝胶生物支架及其制备方法”。配制O. 2wt.%软骨素水溶液作为活性组分I溶液；0.2wt.%壳聚糖水溶液(含
O.Iwt. %醋酸)作为活性组分II水溶液备用。然后采用层层组装的方法通过下列步骤对水凝胶支架进行修饰层层组装技术修饰壳聚糖水凝胶支架的流程见图I。a.将壳聚糖水凝胶支架浸入O. 2wt. %软骨素水溶液中2h，使水凝胶支架上能组装上一层软骨素。浸泡过程中，通过表面Zeta电位测试结果(结合图2所示)证实软骨素呈负电性，而壳聚糖呈正电性，两者能通过静电作用相互结合，组装完成后在壳聚糖水凝胶支架表面便组装了一层软骨素分子。根据不同的组装浓度需要，浸泡过程可以适当延长，一般浸泡时长达到8小时可保证装载完成。下面是层层组装过程中修饰水凝胶支架的表面Zeta电位测试结果(见图2)通过考察层层组装过程中壳聚糖水凝胶支架表面Zeta电位的变化研究组装的驱动力。为测试需要，将水凝胶支架粉碎成微米尺寸的凝胶颗粒，在组装过程中在表面Zeta电位仪上测试凝胶颗粒的表面Zeta电位。由图2可知，软骨素分子在水溶液中呈电负性，组装软骨素后支架表面Zeta电位为负值，壳聚糖分子在水溶液中呈电正性，组装壳聚糖后支架表面Zeta电位为正值，因此，层层组装的驱动力为软骨素分子与壳聚糖分子之间的静电作用。b.然后将组装有软骨素的水凝胶支架置于纯水中浸泡Ih,清洗掉多余软骨素。当组装到一定数量的软骨素分子，由于静电作用的减弱，壳聚糖与软骨素之间的静电作用已不足组装更多的软骨素分子，此时软骨素的组装达到饱和，一些组装不牢固的软骨素将被清洗掉。c.将完成步骤b的水凝胶支架浸入O. 2wt. %壳聚糖水溶液中2h，在组装有软骨素的水凝胶支架上，通过静电作用组装一层壳聚糖。在软骨素的基础上包覆壳聚糖，能让活性组分固定在水凝胶支架的表面，减少或避免活性组分的流失，还能增强水凝胶支架体型结构的适应性，使材料的细胞相容性明显提高。根据不同的组装浓度需要，浸泡过程可以适当延长，一般浸泡时长达到8小时可保证装载完成。d.同样地，待软骨素与壳聚糖之间的静电作用达到饱和，将完成步骤c的水凝胶支架置于纯水中浸泡lh，清洗掉多余壳聚糖。本实施例重复上述步骤a d为10次。可根据需要重复以上a d步骤η次，100。调控壳聚糖水凝胶支架中软骨素的含量，由此在水凝胶支架上获得交替层叠
软骨素与壳聚糖的水凝胶组织结构。下面是修饰后的水凝胶组织结构中软骨素的含量测试通过EDC/NHS反应在软骨素分子中标记荧光分子Alexa Fluor 555cadaverine (Invitrogen),并进行上述组装过程。在突光光度计上记录突光分子的强度计算溶液中软骨素的浓度。比较组装软骨素前后软骨素水溶液中软骨素的浓度变化计算壳聚糖水凝胶组织结构中软骨素的含量。组装不同层数软骨素的水凝胶组织结构中软骨素的含量变化见图3。由图可知，通过软骨素组装层数的变化可以调控壳聚糖水凝胶组织结构中软骨素的含量。下面是修饰后水凝胶组织结构的细胞培养实验。在壳聚糖水凝胶组织结构中培养人肺成纤维细胞(human lungfibroblast, HLF),比较软骨素组装前后细胞在支架材料中的生长情况。培养10天后在组装了软骨素的壳聚糖水凝胶组织结构中细胞形态表征见图4。由图可知，细胞在支架表面充分铺展，在细胞群落中观察到大量细胞伪足，表明细胞与支架材料之间的强烈相互作用。在不同培养时间点检测细胞/支架材料中的DNA总量(图5)。相同条件下，与未组装软骨素的样品比较可知，在组装了软骨素的样品中可以检测到更多的DNA成份(与样品中细胞数相对应)，表明组装了软骨素和壳聚糖的水凝胶支架可以为细胞提供更好的生长环境。实施例2本实施与实施例I不同的是，将壳聚糖水凝胶支架浸入活性组分I的Iwt. %肝素水溶液中4h，在水凝胶支架上组装肝素，然后置于纯水中Ih清洗多余肝素；将水凝胶支架浸入活性组分II的O. 2wt. %壳聚糖水溶液中3h在支架上组装壳聚糖；然后置于纯水中Ih清洗多余壳聚糖。本实施例重复上述步骤30次。根据需要重复以上步骤，可以调控壳聚糖水凝胶支架中肝素的含量，由此获得在水凝胶支架上交替层叠肝素与壳聚糖的水凝胶组织结构。实施例3本实施与实施例I不同的是，将胶原水凝胶支架浸入活性组分I的O. 4wt. %软骨素水溶液中2h，在水凝胶支架上组装软骨素，然后置于纯水中Ih清洗多余软骨素；将水凝胶支架浸入活性组分II的O. 3wt. %胶原水溶液中5h在支架上组装胶原，然后置于纯水中Ih清洗多余胶原。本实施例重复上述步骤40次。根据需要重复以上步骤，可以调控胶原水凝胶支架中软骨素的含量，由此获得在水凝胶支架上交替层叠软骨素与胶原的水凝胶组织结构。实施例4本实施与实施例I不同的是，将壳聚糖水凝胶支架浸入活性组分I的O. Iwt. %海藻酸钠水溶液中2h，在水凝胶支架上组装海藻酸钠，然后置于纯水中Ih清洗多余海藻酸钠；将水凝胶支架浸入活性组分II的Iwt. %赖氨酸水溶液中4h在支架上组装赖氨酸,然后说
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置于纯水中Ih清洗多余赖氨酸。本实施例重复上述步骤10次。根据需要重复以上步骤，可以调控壳聚糖水凝胶支架中赖氨酸的含量。由此获得在水凝胶支架上交替层叠海藻酸钠与赖氨酸的水凝胶组织结构。实施例5本实施与实施例I不同的是，将胶原水凝胶支架浸入活性组分I的O. 3wt. %粘多糖水溶液中8h，在水凝胶支架上组装粘多糖，然后置于纯水中Ih清洗多余粘多糖；将支架浸入活性组分II的O. 2wt. %赖氨酸水溶液中3h在支架上组装赖氨酸,然后置于纯水中Ih清洗多余赖氨酸。再将所述水凝胶支架浸入活性组分I的O. Iwt. %海藻酸钠水溶液中3h，在水凝胶支架上组装海藻酸钠，然后置于纯水中Ih清洗多余海藻酸钠；将水凝胶支架浸入活性组分II的O. 4wt. %赖氨酸水溶液中8h在支架上组装赖氨酸,然后置于纯水中Ih清洗多余赖氨酸。本实施例重复上述步骤10次。根据需要重复以上步骤，可以调控水凝胶支架中各种组分的含量。由此获得在水凝胶支架上交替层叠粘多糖、海藻酸钠、赖氨酸的水凝胶组织结构。在其他实施例中，活性组分I还可以是纤维粘连蛋白或层连蛋白。本发明中活性组分I和活性组分II可以根据所修饰组织工程支架表面分子的电荷、组成、化学键等因素选择。本发明中所修饰的组织工程支架表面的初始电性为正值，故活性组分I选择在水溶液中显负电性的分子，而活性组分II选择在水溶液中显正电性的分子，这样活性组分I和活性组分II是通过静电作用层层组装到支架上。同样地，修饰不同的组织工程支架也可以通过不同的作用力，例如还可以是氢键、范德华力、疏水作用、共价键或分子特异性识别作用等。本发明实施例中活性组分I和活性组分II的选择不能构成对本发明的限制。本发明在常温水体系中进行，通过活性组分与组织工程支架之间的相互作用将活性组分层层组装在组织工程支架网络中，组装的成份和层数可调，此方法简单实用，可控性强，清洁低成本。通过层层组装技术把细胞外基质成分直接固定在材料表面，从而在材料表面覆盖一层细胞外基质，使材料的细胞相容性明显提高。采用人为的方式形成材料一细胞外基质复合层，可通过选择特定细胞外基质(如促进细胞黏附的透明质酸、软骨素、纤维粘连蛋白、胶原等)或类细胞外基质，改善细胞在材料表面的黏附及生长性能，是一种方便有效修饰水凝胶支架的方法。由于具有良好的细胞相容性，制作出的水凝胶组织结构在制备医疗器械中具有广泛的应用，例如，可将水凝胶支架制作成不同的形状，如柱状、人血管状、人耳状、人鼻状、人指骨状等，再修饰上细胞外基质组分，能获得性能较佳的生物材料应用在医疗领域。
权利要求
1.一种修饰组织工程支架的方法，其特征在于，包括如下步骤a.将组织工程支架浸于活性组分I水溶液中f8小时；b.将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分I;C.将完成步骤b的组织工程支架浸于活性组分II水溶液中广8小时；d.将完成步骤c的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分II；e.重复a_d步骤η次,O< η < 100。
2.根据权利要求I所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述组织工程支架、活性组分I或活性组分II之间是通过静电、氢键、范德华力、疏水作用、共价键、分子特异性识别作用中的至少一种作用力相互结合的。
3.根据权利要求I或2所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述活性组分I在其水溶液中的质量百分比为O. f Iwt. %;所述活性组分II在其水溶液中的质量百分比为O. I^lwt. %。
4.根据权利要求3所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述活性组分I是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的至少一种。
5.根据权利要求3所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述活性组分II是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。
6.根据权利要求I所述修饰组织工程支架的方法，所述组织工程支架包括水凝胶支架，所述水凝胶支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得。
7.根据权利要求6所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述修饰组织工程支架的方法，其特征在于，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl3水溶液、CrCl3水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。
9.一种组织工程支架的组织结构，包括组织工程支架，其特征在于，所述组织工程支架外包覆有交替层叠的活性组分I及活性组分II。
10.根据权利要求9所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述组织工程支架、活性组分I或活性组分II之间是通过静电，氢键，范德华力，疏水作用，共价键，分子特异性识别作用中的至少一种作用力结合的。
11.根据权利要求9或10所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述活性组分I是软骨素、透明质酸、肝素、粘多糖、海藻酸钠、纤维粘连蛋白、层连蛋白中的至少一种。
12.根据权利要求9或10所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述活性组分II是壳聚糖、赖氨酸、胶原中的至少一种。
13.根据权利要求9所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述组织工程支架包括水凝胶支架，所述水凝胶支架是由凝胶组分通过交联剂相互交联获得。
14.根据权利要求13所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述凝胶组分是壳聚糖、胶原、海藻酸钠、海藻酸钾、聚乙烯醇、聚丙烯酸中的至少一种。
15.根据权利要求13或14所述组织工程支架的组织结构，其特征在于，所述交联剂是京尼平水溶液、CaCl2水溶液、BaCl2水溶液、FeCl2水溶液、CrCl2水溶液、戊二醛水溶液、乙二醇二甲基丙烯酸酯水溶液中的至少一种。
16.一种根据权利要求f 15任一项所述的修饰组织工程支架的方法在制备医疗器械中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种运用分子层层组装技术修饰组织工程支架的方法，包括如下步骤a．将组织工程支架浸于活性组分Ⅰ水溶液中1~8小时；b．将完成步骤a的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅰ；c．将完成步骤b的组织工程支架浸于活性组分Ⅱ水溶液中1~8小时；d．将完成步骤c的组织工程支架取出并清洗掉多余的活性组分Ⅱ；e．重复a-d步骤n次，0≤n≤100。本发明还提供一种组织工程支架的组织结构及其应用。本发明在常温水体系中进行，通过活性组分与组织工程支架之间的相互作用将活性组分层层组装在组织工程支架网络中，组装的成份和层数可调，此方法简单实用，可控性强，清洁低成本。
文档编号A61L31/04GK102940909SQ20121050934
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者杜明春, 戴建武 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所