专利名称：稳定的鸡α干扰素喷雾剂型的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡α干扰素喷雾剂型的配方、制备工艺及应用，属于生物制药领域。
背景技术：
干扰素是一组体内存在的具有广泛生物活性的蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能等多种作用。研究证明，鸡α干扰素对鸡病毒性疾病有很好的治疗效果，并已逐渐在养禽生产实践中使用，用于调节机体的免疫并提高其抗病毒作用。干扰素属于肽类物质，易在胃肠道内被蛋白酶破坏，口服后很难进入体内。在临床应用中一般采用大剂量(5万-10万IU/kg)肌内注射的方式给药。已证实大剂量注射干扰素可发挥抗病毒作用，但可抑制T细胞的增殖，从而抑制免疫功能，并引起较明显的全身不良反应。近年来，人和动物(鼠、狗、猫、马、猪、牛等)的试验结果和临床应用表明，α干扰素通过喷雾经鼻粘膜和口腔黏膜给药也可发挥抗感染、抗肿瘤及免疫调节作用。其机理是α干扰素通过喷雾进入鼻粘膜和口腔黏膜淋巴组织，与T细胞上的干扰素受体(IFNR)结合，通过Jak-STAT通路激活T细胞和NK细胞产生干扰素Y。干扰素喷雾剂具有用量少、疗效好的特点。干扰素喷雾剂通过气流雾化成微粒，可以经鼻腔、咽喉粘膜吸收，也可以吸入肺泡作用与靶细胞，因此见效快，用量少，主要用于病毒性疾病的预防和治疗。同时由于干扰素无刺激性、无毒性蛋白、呼吸道对它有很好的耐受性。
发明内容
本发明公开一种鸡α干扰素喷雾剂及制备方法，组方简单，制剂稳定，方便使用。主要通过对咽喉部或者其他病变部位直接喷雾的方法给药，也可以用来做滴鼻给药，用于禽流感、新城疫等病毒性疾病的预防和治疗。本发明的组分如下
鸡α干扰素I份
30%甘油(粘膜吸收促进剂)I份
对羟基苯甲酸乙酯(防腐剂)I份
聚乙二醇600 (稳定剂)I份
本发明喷雾剂的缓冲体系为O. 9%Nacl。本发明的技术解决方案如下
取鸡α干扰素原液用O. 9%Nacl调整其终浓度为O. 2mg/ml，效价为I X IO6IU-lX108IU/ml。在干扰素原液中加入配制好的甘油、对羟基苯甲酸乙酯和聚乙二醇600，滤过除菌，在无菌条件下分装于青霉素瓶内，放置4°C保存。其中甘油的终浓度为5%、对羟基苯甲酸乙酯终浓度为O. 2%、聚乙二醇600终浓度为2%。
使用方法
预防用药按照1-5万IU/kg进行喷雾，每天I次，连用2-3天。治疗用药按照2-8万IU /kg进行喷雾，每天I次，连用3-5天。本发明的积极效果在于本喷雾剂型对鸡新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎等病毒性病有显著疗效，治愈率可达60%-80%，高于以往相关同类药物，节约成本10%-30%。并且本产品对鸡轮状病毒引起的腹泻和肠炎也有很好的疗效，同时，本产品作为预防用药能降低雏鸡阶段因免疫抑制引起抵抗力下降而导致的死亡率。本产品所选用的稳定剂、防腐剂和粘膜吸收促进剂均无毒、无害，且生产成本低、保护效果明显、效期长，用于制备质优价廉、无污染、疗效好的“绿色”干扰素喷雾剂型，方便广大养殖户使用，且大大减少了经济损失。
图I为重组鸡α干扰素纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中泳道I是超声破碎后上清；2是蛋白质分子量标准；3是2MUrea洗涤；4是4MUrea洗涤；5是包涵体溶解后；6是流出液；7是40mM咪唑漂洗；8是250mM咪唑洗脱I ;9是250mM咪唑洗脱V。图2为本发明喷雾制剂4°C贮存6个月时，干扰素稳定性随时间变化的曲线图(通过细胞病变抑制法测定干扰素活性)。
具体实施方案以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下
实施例I
重组鸡α干扰素的制备
将大量诱导离心后的菌体重悬于50 mlPBS中，冰上放置30 min，超声裂解破碎细胞(360 W, 30%, 5min重复5次),4 V 12000 rpm离心15 min,弃上清,得包涵体沉淀。将沉淀分别用含2 mo I/L Urea、4 mol/L Urea的PBS洗涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40 ml 结合缓冲液中(O. 6 mol/L NaCl,O. 05 mol/L NaH2PO4, IOmM 咪唑，8 mol/L Urea, pH8.0)。包涵体溶解后，4 V 12000 rpm离心15 min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合I. 5 h，用4体积含40mmol/L咪唑的漂洗、250mmol/L咪唑洗脱缓冲液(0. 6mol/L NaCl,0. 05 mol/L NaH2PO4,8 mol/L Urea,pH 8. 0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗液和洗脱液，12% SDS-PAGE电泳检测。将纯化后含目的条带的洗脱液装入透析袋中，按下列方法透析
基础复性液为PBS，尿素梯度为6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L，每个梯度透析12h，最后在水中透析24h,吸出透析袋中的液体，4°C, 12000rpm,离心IOmin,取上清并用Bradford法测定目的蛋白浓度，然后将目的蛋白滤过除菌，_20°C保存。实施例2
重组鸡IFN-α抗病毒活性测定。将新城疫病毒液在无菌条件下做10倍比稀释，经尿囊腔接种9日龄鸡胚200 μ I/枚，每个稀释度接种6枚，37°C孵育6d，测定EID5(i。根据测定的EID5tl，选择9日龄鸡胚36枚。具体方法1、将9日龄鸡胚随机分为6组，每组6只。2、将两种病毒稀释至IOOEID5ci,每枚注入100 μ I病毒稀释液。接病毒同时，每组分别注入不同剂量的干扰素(空白对照组、
O.5μ g、l. 5μ g、4. 5μ g、13. 5μ g、40. 5μ g)。每天照蛋 1-2 次，弃去 24h 内死亡的鸡胚。4d
后将鸡胚取出，测定病毒凝集价。
￥1；素用量 yg Io Io. 5 Il. 5 14. 5 113. 5 140. 5 病毒凝集价 81og2 7. 51og2 71og2 71og2 4. 51og2 5. 51og2实施例3
鸡α干扰素喷雾剂型的制备
取鸡α干扰素原液用O. 9%Nacl调整其终浓度为O. 2mg/ml，效价为I X IO6IU-lX108IU/ml。在干扰素原液中加入配制好的甘油、对羟基苯甲酸乙酯和聚乙二醇600，滤 过除菌，在无菌条件下分装于青霉素瓶内，放置4°C保存。其中甘油的终浓度为5%、对羟基苯甲酸乙酯终浓度为O. 2%、聚乙二醇600终浓度为2%。各组分所占比例如下
鸡α干扰素I份
30%甘油(粘膜吸收促进剂)I份
对羟基苯甲酸乙酯(防腐剂)I份
聚乙二醇600 (稳定剂)I份
实施例4
鸡α干扰素喷雾剂型对鸡病毒性疾病治疗
选200羽20日龄的SPF鸡用人工感染鸡新城疫病毒的方法使雏鸡发病。染毒24h后，鸡只开始出现临床症状精神萎靡，伸脖缩颈，羽毛蓬乱，排绿色粪便，饮食减少或废绝。发病鸡只随机分为2组，每组100羽。A组为“鸡α干扰素喷雾剂型”治疗组，鸡α干扰素喷雾剂型采用实施例3方法制备，2-8万IU /kg，每天I次，连用3天；B组为对照组，用生理盐水治疗，O. 2ml/ kg，每天I次，连用3天，同时观察鸡的发病、死亡及病理变化，并详细记录。用药后，A组鸡从第2天病情开始好转，第3、4天有死亡鸡只出现，5天后存活的鸡只基本康复。B组鸡出现症状第2天后病情恶化，开始出现死亡，第3-5天达到死亡高峰，未死亡鸡第6天恢复正常。鸡α干扰素喷雾剂型治疗组与对照组相比，治疗效果差异极显著(P < O. 01)，说明以喷雾方式给予“XI α干扰素喷雾剂型”对鸡新城疫有一定的治疗作用。
组别I数目I治愈率I死亡率 A 100~71% 29%
B IlOO 125% 175%说明本产品作为治疗用药时，根据鸡只的病情及临床症状配以缓解症状或治疗继发感染的药物。出现呼吸道症状时，配以大环内酯类药物；出现肾肿时配以缓解肾肿的药物；出现大肠杆菌混合感染时，配以头孢类或其他广谱抗生素，并根据病情调整给药时间。实施例5
鸡α干扰素喷雾剂型对鸡病毒性疾病的预防
选取同日龄不同鸡舍的健康肉鸡作为实验对象。一栋鸡舍的5000只健康肉鸡作为给药组；另一栋鸡舍的健康肉鸡作为空白对照组。给药方案如下
日龄I给药组 I空白对照组^
I_ 1000只/瓶按照常规饲喂模式 14 |500只/瓶I按照常规词喂模式 —
权利要求
1.稳定的鸡a干扰素喷雾剂型的制备方法。
2.根据权利要求I所述的喷雾剂，其特征在于其中包含鸡a干扰素、粘膜促吸收剂、防腐剂、稳定剂和缓冲体系。
3.根据权利要求I的鸡a干扰素喷雾剂，其中所加鸡a干扰素的量为IXlO6IU-lX108IU/ml。
4.根据权利要求I所述的鸡a干扰素喷雾剂，其缓冲体系为0.9%的Nacl。
5.根据权利要求1、2所述，鸡a干扰素喷雾剂型所用的粘膜促吸收剂、防腐剂、稳定剂均为无毒、无害物质。
6.根据权利要求1、2、3、4所述的鸡a干扰素喷雾制剂的制备方法，其特征在于按照组分重量份数用0. 9%的Nacl稀释干扰素原液，加入粘膜吸收促进剂、防腐剂、稳定剂，除菌过滤，分装在瓶中，无菌封口。
7.根据权利要求1-5的配方，该制剂主要用于鸡病毒感染性疾病的预防和治疗。
全文摘要
本发明公开一种重组鸡α型干扰素喷雾制剂，采用聚乙二醇600作为稳定剂，对羟基苯甲酸乙酯作为防腐剂。干扰素原液中加入配制好的甘油、对羟基苯甲酸乙酯和聚乙二醇600，滤过除菌，在无菌条件下分装于青霉素瓶内，放置4℃保存。本发明所使用的稳定剂和防腐剂均为无毒、无害物质。该剂型4℃保存6个月后，利用细胞病变抑制法测定干扰素活性，稳定性很好。临床试验证明，鸡干扰素喷雾剂型对鸡新城疫有很好的治疗作用。该制剂作为新的禽用抗病毒药，为广大养殖户减轻了经济损失。
文档编号A61P31/14GK102961334SQ20121052873
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者李秋霞, 刘海新, 申艳敏, 徐公豹, 张帅帅, 唐卫杰, 张旭斌 申请人:河南省康星药业股份有限公司