专利名称：一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于家禽疫苗技术领域，具体涉及ー种鸡传染性支气管炎ニ价活疫苗，简
称ニ价苗。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(IB) 是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的ー种急性高度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征；患病鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由Schalk等报道于美国，1936年由Beach和Hudson确定本病的病原为病毒。至今本病在世界范围内广泛流行，给养鸡业带来严重危害。在我国，邝荣禄(1972)在广东首次发现本病；到上世纪70年代后期，郑福荣等在杭州、吴志达等在上海、艾国光等在北京、辛朝安等在广州分别自种用鸡群中分离出IBV。荣骏弓等(1997)在患有腺胃肿大的病鸡中分离到腺胃型鸡传染性支气管炎病毒D971株，用该毒株回归SPF雏鸡引起典型肾炎及腺胃炎病变，并从人工感染SPF雏鸡中回收到鸡传染性支气管炎病毒。王玉东、范根成等(1998)在山东省某患有腺胃肿大发病鸡群中采集病料，通过鸡胚连续传5 6代，经电镜观察、动物回归和免疫保护试验、用气管环组织培养进行理化特性測定、毒价测定、中和试验等，证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒，将该毒株命名为腺胃型鸡传染性支管炎病毒QX株。国外学者在欧洲，首先分别于2001年俄罗斯东部及2002年俄罗斯西部分离到IBV类QX株(Bochkov et al，2006)，该毒株能引起鸡患腺胃炎、肾炎，与QX株相似。从2003年起许多欧洲国家相继分离到IBV类QX株包括德国、荷兰、比利时、法国、意大利(Worthingtonet al, 2008 ；Monne et al, 2008)、波兰(Domanska-Blicharz et al, 2006)、英国(Gough etal，2008)和西班牙(Dolz et al，2009)。各种相关研究报道表明整个欧洲地区都有类QX株病毒的存在。显然，IB类QX株对于禽养殖来说是很大的威胁，而目前尚无专门针对IB类QX株的疫苗。国外学者将类QX毒株在鸡胚上连续传代80余代致弱的IB L1148毒株制成IB类QX株的活疫苗，并进行相关的效力和安全性试验。表明对于SPF鸡亦或是携有母源抗体的鸡，经IB LI 148株制成的活苗免后对类QX株D388的攻毒都能提供有效保护。免疫接种是防治鸡传染性支气管炎的最有效手段。目前，国内外用于预防腺胃型传染性支气管炎疫苗的研究较多，但均尚未商品化。同时由于IBV血清型众多，市场上ー直未有交叉保护カ好的弱毒株，腺胃型IB得不到有效控制。因此，筛选获得新的具有较好保护カ的IB弱毒，并用于制备活体疫苗就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡传染性支气管炎ニ价活苗，即由新的腺胃型鸡传染性支气管炎弱毒YB160株和呼吸型鸡传染性支气管炎弱毒H120株作为制备抗原的疫苗株,本发明的ニ价苗对目前中国流行腺胃型鸡传染性支气管炎病毒和呼吸型鸡传染性支气管炎病毒的攻击能提供良好的免疫保护效カ。本发明的ニ价苗，由抗原和疫苗辅剂组成，其中抗原为保藏编号为CGMCCNo. 6752的鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性支气管炎弱毒H120株。上述的ニ价苗的一种制备方法，是将鸡传染性支气管炎病毒YB160株和H120株分别接种鸡胚后，收获胚液获得病毒扩大培养液；然后将鸡传染性支气管炎病毒YB160株和鸡传染性支气管炎病毒H120株扩大培养液混合后,加入疫苗辅剂制成的。本发明制备的ニ价苗可预防腺胃型和呼吸型鸡传染性支气管炎。而且，组成本发明筛选的腺胃型鸡传染性支气管炎病毒为多次传代获得的弱毒株，減少了现有传染性支气管炎病毒作为抗原所帯来的副作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进ー步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。一、本发明鸡传染性支气管炎弱毒YB160株的筛选使用l(Tll日龄SPF鸡胚对传染性支气管炎强毒进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚SPF鸡胚，连传至160代，进行致弱评价。取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160传代接种的病毒株感染I日龄的SPF鸡。结果从第80代病毒株开始无死亡鸡，第90代毒株接种鸡开始无眼观病变，第130代接种鸡开始无组织学病变。说明IBV第130代已经完全致弱，对鸡只具有良好的安全性。同时用本发明毒株130、140、150 160代毒分别免疫3日龄SPF鸡,于免疫后14日，用同源强毒攻击。免疫组分毒率0/10 1/10，保护率9/10 10/10，对照组分毒率10/10。结果说明本发明毒株具有良好的免疫保护性。为了便于同以前毒株区分，将传代160代弱化的鸡胚毒定为原始种子El代，并将该致弱毒株命名为YB160株。选取IBV YB 160株作为ニ价苗研制的候选毒株。并于2012年10月31日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No. 6752。ニ、IBV YB160株的安全性检测毒力返强试验利用IBV强毒株在鸡胚上连续传160代，培育出免疫原性良好的弱毒株IBV-YB160株。该弱毒株El代在SPF鸡体上人工感染和同居感染分别连续传5代，试验鸡均一切正常，接种后5天剖检气管、腺胃、肾脏等均未见肉眼病理变化；试验发现病毒分离气管棉拭子和腺胃第4代起分不到病毒，肾脏从第3代起分不到病毒，肝脏从第2代起分不到病毒。试验鸡气管、腺胃、肾脏等组织匀浆中分毒不同器官病毒分离率不同，气管、腺胃病毒分离率较高，说明该毒株主要在气管、腺胃两个器官増殖。随着代次的増加病毒向外排泄也逐渐減少，分毒率逐渐降低。水平感染试验也出现人工感染同样的规律，只是同居感染同代次分毒率相对人工感染低。以上试验结果证明该毒株无论人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒カ返强现象，遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗毒株无毒カ返强的标准，可以作为弱毒疫苗株进行商品化开发。IBV YB160 株毒种安全性试验取 YB160 株 E2、E4、E7、E10、E13 代毒种以 IO5 ciEID5tl滴鼻I滴(约0. 03ml)，分别接种1、3日龄SPF鸡，连续观察10日。结果接种鸡只均健活，均无任何异常反应。结果见表1、2。表IIBV YB160株毒种的安全性试验结果
权利要求
1.一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，由抗原和疫苗冻干保护剂组成，其中抗原为保藏编号为CGMCC No. 6752的鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性支气管炎弱毒H120株。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗冻干保护剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的终浓度分别为5%和1%。
3.权利要求1所述的疫苗的制备方法，是将鸡传染性支气管炎病毒YB160株和H120株分别接种鸡胚后，收获胚液获得病毒扩大培养液；然后将鸡传染性支气管炎病毒YB160株和鸡传染性支气管炎病毒H120株扩大培养液混合后，加入疫苗冻干保护剂制成的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的疫苗辅剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的终浓度分别为5%和1%。
5.权利要求1所述的疫苗用于预防鸡传染性支气管炎病。
全文摘要
本发明涉及一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，由抗原和疫苗辅剂组成，其中抗原为保藏编号为CGMCC No.6752的鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性支气管炎弱毒H120株。本发明制备的二价苗可预防腺胃型和呼吸型鸡传染性支气管炎。而且，组成本发明筛选的腺胃型鸡传染性支气管炎病毒为多次传代获得的弱毒株，减少了现有传染性支气管炎病毒作为抗原所带来的副作用。
文档编号A61K39/295GK103007274SQ20121059447
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者宋新宇, 范根成, 刘蕾, 李芳 , 邹桂荣, 刘新文, 程增青 申请人:青岛易邦生物工程有限公司