富含多不饱和脂肪酸的微生物油的制作方法

富含多不饱和脂肪酸的微生物油的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物油，在所述微生物油的成分中富含多不饱和脂肪酸、其酯、其酸盐、由其形成的醇、和／或由其形成的醛。本发明还涉及包含富集的微生物油的组合物以及制备富集的微生物油的方法和使用富集的微生物油的方法。本发明还涉及分离的微生物以及菌株及其突变株、生物质、微生物油、组合物和培养物；生产所述微生物油、生物质和突变株的方法；以及使用所述分离的微生物、生物质和微生物油的方法。
【专利说明】富含多不饱和脂肪酸的微生物油[0001 ] 涉及以电子方式递交的序列表
[0002]与本申请一起提交的以电子方式递交的序列表(“sequence listing, txt”, 5074字节，创建于2011年7月20日)的内容以其整体通过引用并入本文。
[0003]发明背景
发明领域
[0004]本发明涉及富含多不饱和脂肪酸、其酯、其酸盐、其醇和/或其醛的微生物油；包含富集的微生物油的组合物；以及制备富集的微生物油的方法和使用富集的微生物油的方法。
[0005]本发明涉及经分离的微生物以及其菌株和突变株、生物质、微生物油、组合物和培养物；生产微生物油、生物质和突变株的方法；和使用经分离微生物、生物质、培养物和微生物油的方法。
【背景技术】
[0006]基于碳链的长度和饱和特征，将脂肪酸分类。基于链中存在的碳数目，脂肪酸被称为短链、中链或长链脂肪酸；当碳原子之间不存在双键时称为饱和脂肪酸，当存在双键时被称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，当存在多于一个双键时，是多不饱和的。
[0007]基于从脂肪酸的甲基端起第一个双键的位置，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)分类:ω-3(η-3)脂肪酸在第三个碳处含有第一个双键，而ω_6(η_6)脂肪酸在第六个碳处含有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是具有22个碳的链长度和6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名为“22:6η-3”。其他ω-3LC-PUFA包括命名为“20:5η-3”的二十碳五烯酸(“ΕΡΑ”)、命名为“22:5η_3”的ω-3 二十二碳五烯酸(“DPAη-3”)。DHA和EPA已被称作“必需”脂肪酸。ω -6LC-PUFA包括命名为“20:4η_6”的花生四烯酸(“ARA”)和命名为“22:5η-6”的ω-6 二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。
[0008]由于位于细胞膜中，ω-3脂肪酸是影响细胞生理功能的重要的生物学分子，它能调节生物活性化合物的产生与基因表达，并起到生物合成底物的作用。Roche，H.Μ.，Proc.Nutr.Soc.58:397-401 (1999)。例如，DHA构成人类大脑皮层中约15%至20%的脂质，构成视网膜中30%至60%的脂质，在睪丸与精子中富集，并且是母乳中的一个重要组分。Berge, J.P.和 Barnathan, G..Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125 (2005)。DHA 构成脑中至多97%的ω-3脂肪酸，且构成视网膜中至多93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA是胎儿与婴儿发育以及维持成人认知功能所必需的。(参考文献同上)。因为在人体中无法从头合成ω-3脂肪酸，因此这些脂肪酸必须从营养来源获取。
[0009] 亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有ΕΡΑ、DHA, DPA或AM’但却含有亚麻酸(C18:3η_3)，其是使机体能够制造EPA的一种构建单元。然而有证据显示代谢转换的速率可以是缓慢且多变的，特别在健康不佳的那些个体中。根据具体的物种及其饮食，鱼油在脂肪酸组成的类型与水平方面存在显著的差异。例如，与野生鱼类相比，水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。此外，鱼油具有含环境污染物的风险，并且可能与稳定性问题和鱼的腥臭或味道有关。
[0010]破囊壶菌(Thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)与破囊壶菌属(Thraustochytrium)的成员，并且已经确认为包括DHA与EPA在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。参见第5130242号美国专利。与相应的鱼油或微藻油相比，由这些海生异养型微生物所生产的油通常具有更简单的多元不饱和脂肪酸分布。Lewis，Τ.Ε.，Mar.Biotechnol.1:580-587 (1999)。已报导破囊壶菌种的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占很高的百分比。第 5130242 号美国专利；Huang，J.等的 J.Am.0il.Chem.Soc.78:605-610 (2001) ；Huang,J.等的Mar.Biotechnol.5 =450-457(2003)。然而，分离的破囊壶菌在所生产的LC-PUFAs的种类和量方面不同，这使得一些先前所述的菌株在培养中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或会表现低的生产力。因此，一直存在对展现出高生产力和所期望的LC-PUFA谱的微生物的分离的需求。
[0011]此外，对与前述微生物油中存在的相比包含较高浓度下列物质的富集的微生物油的需求得不到满足，所述物质为多不饱和脂肪酸、其酯、其醛、其酸盐、和/或其醇。
[0012]发明概述
[0013]本发明涉及富集的微生物油，其包含至少70重量％的DHA与EPA的组合，其中此油包含至少10重量％的ΕΡΑ。在一些实施方式中，本发明的油包含至少50重量％的DHA和至少20重量％的ΕΡΑ。在一些实施方式中，本发明的油包含甘油三酯组分，其中在甘油三酯组分中至少50重量％的脂肪酸为DHA，并且在甘油三酯组分中至少20重量％的脂肪酸为ΕΡΑ。在一些实施方式中，DHA和EPA是以酯形式存在的。例如，DHA和EPA的酯可以是乙基酷。
[0014]本发明涉及包含至少30重量％ EPA的富集的微生物油。在一些实施方式中，本发明的油包含甘油三酯组分，其中在甘油三酯组分中至少30重量％的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些实施方式中，EPA是以酯形式存在的。例如，EPA的酯可以是乙基酯。
[0015]本发明涉及含有本发明的富集的微生物油的食物、补充剂、药物组合物。药物组合物可以包含药学上可接受的载剂。
[0016]在一些实施方式中，富集的微生物油是从裂殖壶菌属物种的经分离的微生物中可以获得的。
[0017]在一些实施方式中，本发明的油是从以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏物种的经分离的微生物中可以获得的，其中微生物所产生的总脂肪酸包含大于10重量％的ΕΡΑ。
[0018]在一些实施方式中，本发明的油是从具有以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的物种的特征的经分离的微生物中可以获得的，其中微生物所产生的总脂肪酸包含大于约10重量％的EPA。
[0019]在一些实施方式中，本发明的油是从产生甘油三酯组分的经分离的微生物中可以获得的，其中甘油三酯组分的EPA含量为至少约12重量％。
[0020]在一些实施方式中，本发明的油是从以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的经分离的微生物中可以获得的。[0021]在一些实施方式中，本发明的油是从以ATCC登录号PTA-10209所保藏的经分离的微生物中可以获得的。
[0022]在一些实施方式中，本发明的油是从以ATCC登录号PTA-10210所保藏的经分离的微生物中可以获得的。
[0023]在一些实施方式中，本发明的油是从以ATCC登录号PTA-10211所保藏的经分离的微生物中可以获得的。
[0024]本发明涉及含有本发明的富集的微生物油的口服剂型。在一些实施方式中，口服剂型包含IOOmg至3000mg的ω-3多不饱和脂肪酸。在一些实施方式中，口服剂型包含500mg至1000mg的DHA与EPA的组合。在一些实施方式中，口服剂型是胶囊。在一些实施方式中，口服剂型是素食胶囊(vegetarian capsule)。
[0025]本发明涉及用于在有需要的个体中治疗心脏病或与其相关的状况的方法，其包括给个体施用本发明的油或本发明的油的混合物以及药学上可接受的载剂。
[0026]本发明涉及本发明的油或本发明的油的混合物用于制造治疗心脏病或与其相关的状况的药物的用途。
[0027]本发明涉及本发明的油或本发明的油的混合物用于制造改善心脏状况或与其相关的状况、或维持健康心脏状 况或与其相关的状况的补充剂的用途。
[0028]本发明涉及由微生物的生物质生产本发明的富集的微生物油的方法，其包括以下步骤:a)在醇和碱存在下加热并使生物质反应，从而由生物质产生多不饱和脂肪酸的酯；b)将生物质分离到富含多不饱和脂肪酸的基本上为液体的相中和基本上为固体的相中；并且c)通过回收含有多不饱和脂肪酸的酯的组分来纯化基本上为液体的相。
[0029]在一些实施方式中，微生物是裂殖壶菌属物种的分离的微生物。
[0030]在一些实施方式中，微生物是以ATCC登录号PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211 所保藏的种及其突变菌株或其混合物的分离的微生物中的任意一种。
[0031]在一些实施方式中，加热步骤a)是在从约80°C至100°C下进行的。
[0032]在一些实施方式中，加热步骤a)是在90°C下进行的。
[0033]在一些实施方式中，碱是氢氧化钾。
[0034]在一些实施方式中，醇是乙醇。
[0035]在一些实施方式中，酯是多不饱和脂肪酸的乙基酯。
[0036]在一些实施方式中，多不饱和脂肪酸是DHA与EPA的组合。
[0037]在一些实施方式中，分离步骤b)是通过离心或过滤来进行的。
[0038]在一些实施方式中，纯化步骤c)是通过在乙醇中尿素包合结晶法来进行的。
[0039]在一些实施方式中，纯化步骤c)是通过真空分子分馏来进行的。
[0040]本发明涉及以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的经分离的微生物。
[0041]本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特征的经分离的微生物。
[0042]本发明涉及包含下述18s rRNA的经分离的微生物，所述18s rRNA包含SEQ ID NO:I多核苷酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少94%同一性的多核苷酸序列。
[0043]本发明涉及包含下述18s rRNA多核苷酸序列的经分离的微生物，所述18s rRNA多核苷酸序列与以ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列具有至少94%同一性。
[0044]本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏物种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
[0045]本发明涉及具有以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏物种的特征的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含超过约10重量％ 二十碳五烯酸。
[0046]本发明涉及生产甘油三酯组分的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的二十碳五烯酸含量为至少约12重量％。
[0047]在一些实施方式中，本发明的经分离的微生物是突变菌株。
[0048]本发明涉及以ATCC 登录号 PTA-10212、ΡΤΑ-10213、ΡΤΑ-10214、ΡΤΑ-10215、ΡΤΑ-10208、ΡΤΑ-10209、ΡΤΑ-10210 或 ΡΤΑ-10211 所保藏的经分离的微生物。
[0049]本发明涉及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的生物质。
[0050]本发明涉及分离的生物质，其中至少约20重量％生物质细胞干重是脂肪酸，其中超过约10重量％的脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中脂肪酸包含各低于约5重量％的花生四烯酸和二十二碳五烯酸η-6。在一些实施方式中，至少约25重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。
[0051]在一些实施方式中，本发明涉及包含甘油三酯的分离的生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯是二十 碳五烯酸。
[0052]在一些实施方式中，本发明涉及本发明的分离的生物质的任何一种，其中脂肪酸还包含各低于约5重量％的油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸和芥酸。
[0053]本发明涉及包含本发明的微生物的任一种或其混合物的分离的培养物。
[0054]本发明涉及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物或生物质的任一种或其混合物的食用产品、化妆品或药物组合物。
[0055]本发明涉及下述微生物油，所述微生物油包含至少约20重量％的二十碳五烯酸和各低于约5重量％的花生四烯酸、二十二碳五烯酸η-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸和十八碳四烯酸。在一些实施方式中，微生物油还包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。
[0056]发明涉及下述微生物油，所述微生物油包含至少约10重量％的甘油三酯组分，其中甘油三酯组分中至少约12重量％的脂肪酸是二十碳五烯酸，其中甘油三酯组分中至少约25重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸，和其中甘油三酯组分中低于约5重量％的脂肪酸是花生四烯酸。
[0057]本发明涉及用于非人类动物或人类的包含本发明的微生物油的任一种的食用产品、化妆品或药物组合物。在一些实施方式中，食用产品是婴幼儿配方奶粉。在一些实施方式中，婴幼儿配方奶粉适于早产儿。在一些实施方式中，食用产品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方式中，食用产品是非人类动物或人类产品的添加剂。在一些实施方式中，食用产品是营养补充剂。在一些实施方式中，食用产品是动物饲料。在一些实施方式中，动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，动物饲料是家养动物饲料、动物园动物饲料、耕畜饲料、家畜饲料或其组合。
[0058]本发明涉及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括:在培养物中培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物，以生产包含ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述方法还包括提取(extracting,萃取)油。
[0059]本发明涉及生产包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括从本发明的生物质的任一种中提取包含ω-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，使用有机溶剂提取方法(例如己烷提取)来提取微生物油。在一些实施方式中，使用无溶剂提取方法来提取微生物油。
[0060]本发明涉及由本发明的方法生产的微生物油。
[0061]本发明涉及用于生产本发明的生物质的方法，其包括:在培养物中培养本发明的经分离的微生物的任一种或其混合物，以生产生物质。
[0062]本发明涉及由本发明的方法生产的生物质。
[0063]本发明涉及用于生产本发明的突变菌株的方法，其包括:对本发明的微生物的任一种进行诱变处理，并分离突变菌株。
[0064]本发明涉及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用于制造治疗炎症或其相关状况的药物的用途。
[0065]本发明涉及本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物用于治疗炎症或其相关状况的用途。
[0066]本发明涉及用于治疗炎症或其相关状况的本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物。
[0067]本发明涉及用于治疗有需要的个体的炎症或其相关状况的方法，其包括给个体施用本发明的经分离的微生物、生物质或微生物油的任一种或其混合物和药学上可接受的载剂。
[0068]附图简要说明
[0069]图1是根据本发明的生物质分离方法和微生物油富集方法的示例性实施方式的示意图。
[0070]发明详述
[0071]本发明涉及经分离的微生物以及其菌株和突变株，以及其生物质、微生物油、组合物和培养物。本发明涉及从本发明的微生物生产微生物油、生物质和突变株的方法和使用微生物、生物质和微生物油的方法。本文描述的微生物是高生产力的并产生独特的脂肪酸分布，所述脂肪酸分布的部分特征为高水平的ω-3脂肪酸、尤其是高水平的ΕΡΑ。
[0072]微生物
[0073]本发明涉及经分离的微生物及由其所衍生的菌株。由本发明的经分离的微生物所“衍生”的菌株可以是天然衍生的或人工衍生的，比如突变株、变异株或重组菌株。本文中使用时，术语“分离的”并不一定反映分离物已被纯化的程度，而是指从天然形式或天然环境中分离或隔离。分离物可包括但不限于分离的微生物、分离的生物质、分离的培养物、分离的微生物油及分离的序列(比如本文中所公开的分离的多核苷酸序列)。本文中使用时，术语“微生物”包括但不限于术语“微藻”、“破囊壶菌”及与本文中所述的任一种保藏微生物相关的分类学分类。与本发明的任一种微生物(包括本文中所述的保藏微生物)相关时所用的术语“破囊壶菌目” (“Thraustochytriales”)、“破囊壶菌” (“thraustochytrid”)、“裂殖壶菌属”(“Schizochytrium”)及“破囊壶菌属”(“Thraustochytrium”)基于囊括可获得的系谱信息的当前分类学分类，并且在本申请的申请日后修订分类学分类的情况下不意图起限制作用。
[0074]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的经分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10212相关的分离的微生物在本文中也称为破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)ATCC PTA-10212。与 ATCC 登录号 PTA-10212 相关的经分离的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10212所保藏的经分离的菌株。在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10212所保藏的经分离的菌株。
[0075]在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特征的经分离的微生物或由其所衍生的菌株。以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特征可以包括其生长性质与表型性质(表型性质的例子包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(比如干重和脂质谱)、其基因序列及其组合，其中所述特征使这些种区别于先前鉴定过的种。在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-10212保藏物种的特征的经分离的微生物，其中所述特征包括:包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或与SEQ IDNO:1的同一性为至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA,以ATCC登录号PTA-10212保藏物种的形态学性质与繁殖性质，以及以ATCC登录号PTA-10212保藏物种的脂肪酸分布。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以ATCC登录号PTA-10212保藏的微生物基本相同的生长特征。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以ATCC登录号PTA-10212保藏的微生物基本相同的生长性质。在一些实施方式中，本发明涉及经分离的微生物，其包含具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:1的同一性为至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA。在一些实施方式中，本发明涉及经分离的微生物，其包含与以ATCC登录号PTA-10212保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列的同一性为至少94%的18s rRNA多核苷酸序列。
[0076]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物的突变菌株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是以ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215所保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相关的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。
[0077]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏物种的经分离的微生物。与ATCC登录号ΡΤΑ-10208相关的分离的微生物在本文中也称为裂殖壶菌属种(Schizochytrium sp)ATCC ΡΤΑ-10208。与 ATCC 登录号 ΡΤΑ-10208 相关的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Cul ture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的经分离的菌株。
[0078]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏物种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含超过约10重量％、超过约11重量％、超过约12重量％、超过约13重量％、超过约14重量％、超过约15重量％、超过约16重量％、超过约17重量％、超过约18重量％、超过约19重量％或超过约20重量％的EPA。在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10208保藏物种的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含约10重量％至约55重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％的EPA。
[0079]在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特征的经分离的微生物，其中由微生物生产的总脂肪酸包含以重量计超过约10%的二十碳五烯酸。以ATCC登录号PTA-10208所保藏的微生物的特征包括其生长性质与表型性质(表型性质的例子包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(比如干重和脂质谱)、其基因序列及其组合，其中所述特征使这些种区别于先前鉴定过的种。在一些实施方式中，本发明涉及具有以ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特征的经分离的微生物，其中所述特征包括:包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的18s rRNA，以ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的形态学性质与繁殖性质，以及以ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的脂肪酸分布。在一些实施方式中，本发明的分离的微生物具有与以ATCC登录号PTA-10208所保藏的那些微生物基本相同的物理和化学性质。 [0080]在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登录号PTA-10208所保藏的微生物的突变菌株。在进一步的实施方式中，该突变菌株是以ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所保藏的菌株。与ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210和PTA-10211相关的微生物按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美国维吉尼亚州 20110-2209 马纳沙斯(Manassas)大学大道(University Boulevard) 10801 号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。
[0081]在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的EPA含量为至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的经分离的微生物，其中甘油三酯组分的EPA含量为约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％或约20重量％至约30重量％。
[0082]在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物的突变株、变异株或重组菌株，其中甘油三酯组分的EPA含量为至少约10重量％、至少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施方式中，本发明涉及生产甘油三酯组分的本发明的经分离的微生物的突变株、变异株或重组株，其中甘油三酯组分的EPA含量为约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。可以通过公知的程序来产生突变菌株。常用的程序包括辐射、高温处理及用诱突变剂处理。变异菌株可以是本文中所述物种的其它天然存在的分离株和/或亚分离株。可以通过分子生物学中用于表达外源基因或改变内源基因的功能或表达的任何公知的方法来产生重组菌株。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组菌株比野生型菌株生产更高量的ω-3脂肪酸(特别是EPA)。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组菌株生产较低量的一种或多种脂肪酸，比如较低量的DHA、ARA、DPA η-6或其组合。在一些实施方式中，突变株、变异株或重组菌株比野生型菌株每升培养物产生更大的细胞干重。这种突变株、变异株或重组菌株是由本发明的分离的微生物所衍生的菌株的例子。
[0083]在一些实施方式中，本发明的分离的微生物(包括其突变株、变异株或重组株)在由该微生物所分离的一种或多种组分中包含脂肪酸分布。由该微生物所分离的一种或多种组分包括总脂肪酸组分、固醇酯组分、甘油三酯组分、游离脂肪酸组分、固醇组分、甘油二酯组分、极性组分(包括磷脂组分)及其组合。特 定组分的脂肪酸分布可包括与本文中所公开的特定组分相关联的任一种脂肪酸分布。
[0084]本发明涉及生产突变株的方法，其包括对本发明的任一种微生物进行诱变处理并分离突变菌株。
[0085]培养物和分离的生物质
[0086]本发明涉及下述培养物，其包含本发明的一种或多种分离的微生物。用于接种、生长和回收微生物区系(比如微藻与破囊壶菌)的各种发酵参数在本领域中是已知的。见美国专利N0.5130242，所述参考文献以其整体通过引用并入本文。液态或固态培养基可以含有天然海水或人造海水。供异养型生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸钠和甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵及硝酸铵。
[0087]用于培养以ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物的典型培养基示于表1中:
[0088]表1:PTA-10212器皿培养基
[0089]成分ESMM
Na2SO4 g/L31.0()-5()、15-45 或 25-35
NaCl g/L0.6250-25、0.l-tO-?ic 0.5-5
KCl g/L〗.()0-5、0.25-3 if 0.5-2
MgSO4-7H20 g/L5.0(HO、2-8 成 3-6
(NH4)2SO4 g/L0.44(HO、0.25-5 -? 0.05-3
MSG-1H2O g/L6.00-10、4-8 成 5-7
CaCl2 g/L0.290.1-5、0.15-3 或 0.2-1
T 154(醉母提取物) g/L6.00-20, 0.1-10 mJc 1-7
KH2PO4 g/L0.80.1-10, 0.5-5 ?Ε 0.6-1.8
rtii(灭丨爾后(ΦΜ)
柠橡酸 mg/L3,50.1-5000、10-3000 或 3-2500
[0090]
FeSO4-TH2O mg/L10.300.1-10?, 1-50 成 5-25
MnCl2*4II2O mg/L3.100.1-10?, 1-5()1? 2-25
/nS{)4-7II2C) mg/L3.100.01-100, 1-50 成 2-25
CoCI2.6H2() mg/L0.040-1、0.001 -0.1 成 0.01 -0.1
Na2MoO4-1II2O mg/L0.040.001-K 0.005-0.5 ?K 0.01-0.1
CuSO4-SII2O mg/L2.070.1-100, 0.5-50?.! 1-25
NiS04-6H2C) mg/L2.070.1-100, 0.5-50t?K 1-25
AIK火.丨 ?Μι?)
硫胺素 mg/L9.750.1-100、丨-50 成 5-25
维卞泰 BI2 mg/L0.160.01-100, 0,05-5 成 0.1-1
CaH-泛 _ mg/1.2,060.1-100、0.1-50 或 1-】O
屮物桌 mg/L3.210.1 -100、0.1 -50 成 1-10
MJiicWln.......Lili—
甘油 g/L30.05-150、10-100 或 20-50
lit进料:
成分?jt
MSG-1H2O g/L170-150, I O-1 OOii 15-50
[0091]典型的培养条件包括下述条件:
[0092]
pl I约 6.5-约 9.5、约 6.5-约 8.0、成约 6,8-约 7.8;
IiJfc约15-约30 m氏度、约18-约28 M氏度、成约2丨至约23扱氏度
溶解氧；约0.1 -约100%饱#11度、约5-约50%饱和度、或约I O-约3 0%饱#11
度；和域
将甘油控在: 约5-约50 g/L、约I O-约40 g/L、或约15-约35 g/L β
[0093]在一些实施方式中，以ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物或其突变株、变异株或重组株在作为碳源的甘油上异养地生长，而在作为碳源的葡萄糖上不生长。[0094]用于培养以ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的微生物的典型的培养基在表2中示出:
[0095]表2:ΡΤΑ-10208器皿培养基
[0096]
【权利要求】
1.富集的微生物油，其包含至少70重量％的DHA与EPA的组合，其中所述油包含至少10重量％的EPA。
2.如权利要求1所述的油，其包含至少50重量％的DHA和至少20重量％的EPA。
3.如权利要求1所述的油，其中所述油包含甘油三酯组分，并且其中在所述甘油三酯组分中至少50重量％的脂肪酸是DHA，并且在所述甘油三酯组分中至少20重量％的脂肪酸是 EPA。
4.如前面权利要求中任意一项所述的油，其中所述DHA和所述EPA是以酯形式存在的。
5.如权利要求4所述的油，其中DHA酯和EPA酯是乙基酯。
6.富集的微生物油，其包含至少30重量％的EPA。
7.如权利要求6所述的油，其中所述油包含甘油三酯组分，并且其中在所述甘油三酯组分中至少30重量％的脂肪酸是EPA。
8.如权利要求6或7所述的油，其中所述EPA是以酯形式存在的。
9.如权利要求8所述的油，其中EPA酯是乙基酯。
10.如前面权利要求中任意一项所述的油，其中所述油是从裂殖壶菌属物种的分离的微生物中可以获得的。
11.如权利要求1-9 中任意一项所述的油，其为从以ATCC登录号PTA-10208保藏的物种的分离的微生物中可以获得的，其中所述微生物所产生的总脂肪酸包含超过10重量％的 EPA。
12.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从具有以ATCC登录号PTA-10208保藏的物种的特征的分离的微生物中可以获得的，其中所述微生物所产生的总脂肪酸包含超过约10重量^^^EPA。
13.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从产生甘油三酯组分的分离的微生物中可以获得的，其中所述甘油三酯组分的EPA含量为至少约12重量％。
14.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从以ATCC登录号PTC-10208保藏的分离的微生物中可以获得的。
15.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从以ATCC登录号PTC-10209保藏的分离的微生物中可以获得的。
16.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从以ATCC登录号PTC-10210保藏的分离的微生物中可以获得的。
17.如权利要求1-9中任意一项所述的油，其为从以ATCC登录号PTC-10211保藏的分离的微生物中可以获得的。
18.食物，其包含如权利要求1-17中任意一项所述的油。
19.补充剂，其包含如权利要求1-17中任意一项所述的油。
20.药物组合物，其包含如权利要求1-17中任意一项所述的油和药学上可接受的载剂。
21.口服剂型，其包含如权利要求1-17中任意一项所述的油。
22.如权利要求21所述的口服剂型，其包含IOOmg至3000mg的ω-3多不饱和脂肪酸。
23.如权利要求22所述的口服剂型，其包含500mg至1000mg的DHA与EPA的组合。
24.如权利要求21所述的口服剂型，其中所述口服剂型为胶囊。
25.如权利要求21所述的口服剂型，其中所述口服剂型为素食胶囊。
26.用于在有需要的个体中治疗心脏病或与其相关的状况的方法，其包括给个体施用如权利要求1-17中任意一项所述的油或其混合物以及药学上可接受的载剂。
27.如权利要求1-17中任意一项所述的油或其混合物用于制造治疗心脏病或与其相关的状况的药物的用途。
28.如权利要求1-17中任意一项所述的油或其混合物用于制造改善心脏状况或与其相关的状况、或者维持健康心脏状况或与其相关的状况的补充剂的用途。
29.由微生物的生物质生产如权利要求1或6所述的富集的微生物油的方法，其包含: a)在醇和碱存在下加热并使所述生物质反应，从而由所述生物质产生多不饱和脂肪酸的酷； b)将所述生物质分离到富含多不饱和脂肪酸的基本上为液体的相中和基本上为固体的相中；并且 c)通过回收含有多不饱和脂肪酸的酯的组分来纯化所述基本上为液体的相。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述微生物为裂殖壶菌属物种的分离的微生物。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述微生物为以ATCC登录号PTA-10212、PTA-10213、PTA-102 14、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211 所保藏的种的分离的微生物中的任意一种，及其突变菌株或其混合物。
32.如权利要求29-31中任意一项所述的方法，其中所述加热步骤a)是在从约80°C至100°C下进行的。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述加热步骤a)是在90°C下进行的。
34.如权利要求29-33中任意一项所述的方法，其中所述碱是氢氧化钾。
35.如权利要求29-34中任意一项所述的方法，其中所述醇是乙醇。
36.如权利要求29-35中任意一项所述的方法，其中所述酯是多不饱和脂肪酸的乙基酯。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是DHA与EPA的组合。
38.如权利要求29-37中任意一项所述的方法，其中所述分离步骤b)是通过离心或过滤来进行的。
39.如权利要求29-38中任意一项所述的方法，其中所述纯化步骤c)是通过在乙醇中尿素包合结晶法来进行的。
40.如权利要求29-38中任意一项所述的方法，其中所述纯化步骤c)是通过真空分子分馏来进行的。
【文档编号】A61K31/202GK104011218SQ201280042656
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月21日
【发明者】克里希纳·拉曼 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司