用于治疗骨骼肌病的组合物和方法

用于治疗骨骼肌病的组合物和方法【专利摘要】本发明提供一种预防或治疗肌病如骨骼肌病的方法，包括施用miRNA的调控物。在一个实施方案中，所述骨骼肌病是中央核性肌病。所述调控物可以是促进miR-133家族成员的表达、功能或活性的激动剂。所述miR-133家族成员可以是miR-133a或miR-133b。【专利说明】用于治疗骨骼肌病的组合物和方法[0001]对相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2011年7月I日提交的美国临时申请系列号61/504，048的优先权和权益，其通过提述完整并入本文。[0003]电子方式提交的文本文件的描述[0004]随本文以电子方式提交的文本文件的内容以引用方式整体并入本文:序列表的计算机可读格式副本(文件名:MIRG_029_01TO_SeqList_ST25.txt，记录日期:2012年7月2日，文件大小5.3千字节)。发明领域[0005]本发明一般涉及异常骨骼肌活性或功能的预防或治疗，其通过调控微RNA(miRNA)的表达或活性而进行。`具体地，调控miR-133家族成员的活性或表达。[0006]发明背景[0007]骨骼肌病是骨骼肌的肌病，且可以是遗传性或获得性的。人中央核性肌病(Humancentronuclearmyopathy,CNM)是一组先天性肌病,其特征在于肌无力和肌肉肌纤维中细胞核的异常中心化(1，2)。CNM可分类成3种主要形式:具有严重的新生期表型的隐性X连锁的肌管性肌病(XLMTM)，其由肌微管素(myotubularin)基因(MTMl)中的突变导致；具有轻度、中度或严重表型的经典常染色体显性形式，其由发动蛋白(dynamin)2基因(D匪2)中的突变导致；和呈现严重和中度表型的常染色体隐性形式，其由双载蛋白(amphiphysin)2基因(BINl)中的突变导致(1，2)。尽管它们有异类的临床表型，但CNM的所有3种形式均呈现以下普遍病理学特征:(a)I型肌纤维占优势和较小的纤维大小；(b)异常的NADH-四唑还原酶(NADH-TR)染色模式，指示线粒体异常；和(c)缺乏坏死、肌纤维死亡或再生(2)。[0008]XLMTM(CNM的最严重和最普遍的形式)已在小鼠和斑马鱼中进行过广泛研究(3-6)。具有Mtml基因的纯合突变的小鼠形成进行性CNM，其重现了XLMTM在人中的病理学特征(5)。Mtml缺陷性小鼠还展现出紊乱的三联征和缺陷性兴奋-收缩偶联，其可能对XLMTM中受损的肌功能负责(3)。[0009]CNM的常染色体显性形式与慢性进行性CNM的广临床谱有关，从那些开始于儿童期或青春期的到具有新生期发作的更严重的零散形式(7-9)。在最近若干年中已鉴定出DW2基因座中的多种错义突变，因此，常染色体显性CNM亦称为DW2有关的CNM。发动蛋白2是一种涉及许多细胞功能(包括胞吞作用和膜运输)的遍在表达的大GTP酶(10，11)。然而，DW2基因中的多种错义突变为何导致CNM的准确机制仍不清楚。此外，没有针对DW2有关的CNM的小鼠模型，且表达最频繁的CNM相关的D匪2突变R465WDnm2的敲入小鼠模型不能重现人CNM的常染色体显性形式(9)。携带R465WDnm2突变的纯合小鼠在出生后24小时内死亡，而杂合小鼠产生肌病，接着是无中心化细胞核的萎缩和受损的肌功能(9)。[0010]微RNA通过抑制mRNA靶物的表达来调控细胞表型。微RNA(miRNA)是高度保守的非编码小RNA，其通过抑制在3’不翻译区^UTR)中具有互补序列的靶mRNA的表达来调节一系列生物学过程(12)。miRNA的核苷酸2_8与mRNA祀物的Watson-Crick碱基配对导致mRNA降解和/或翻译抑制。最近的研究已揭示了miRNA在调节骨骼肌分化中的作用，而且miRNA表达的变化与各种骨骼肌病症有关(13-15)。然而，尚未证明miRNA涉及骨骼肌病。鉴定和表征涉及肌病的miRNA对于开发新的治疗办法用于治疗肌病如骨骼肌病(包括CNM)是重要的。[0011]发明概述[0012]本发明部分基于以下发现，即miRNA在骨骼肌结构、功能、生物能学和肌纤维身份的维持中起着必要作用。因此，本文中公开了用于治疗或预防骨骼肌病的方法和组合物。在一个具体的实施方案中，所述骨骼肌病是中央核性肌病(CNM)。在一个实施方案中，用于在有此需要的受试者中治疗或预防CNM的方法包括对受试者施用miR-133家族成员的激动剂。本文中还提供了一种在有此需要的受试者中维持骨骼肌结构或功能、抑制快到慢的肌纤维转化、或治疗或预防线粒体功能障碍的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。[0013]所述miR-133家族成员可以是miR-133a或miR-133b。例如，所述激动剂是包含miR_133a或miR_133b序列的多核苷酸。所述多核苷酸可包含pri_miR-133a、pre-miR-133a>或成熟miR_133a序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含pr1-miR-133b、pre-miR-133b、或成熟miR_133b序列。例如，所述多核苷酸可包含5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’(SEQIDNO:2)或5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’(SEQIDNO:4)的序列。[0014]所述激动剂可以是配制在脂质递送媒介物中的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸由表达载体编码。所述多核苷酸可在骨骼肌启动子如肌肉肌酸激酶启动子的调控下。在一个实施方案中，所述多核苷酸为双链。在另一个实施方案中，所述多核苷酸缀合于胆固醇。所述多核苷酸长度可以为约70至约100个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸长度为约18至约25个核苷酸。[0015]在一些实施方案中，通过皮下、静脉内、肌内或腹膜内施用路径对受试者施用所述激动剂。所述受试者可以是人。在一些实施方案中，所述受试者在肌微管素(MTMl)基因、发动蛋白2(DNM2)基因和/或双载蛋白2(BINl)基因中具有突变。[0016]本发明还提供一种用于鉴定骨骼肌中miR-133家族成员的调控物的方法，包括:(a)使骨骼肌细胞与候选化合物接触；(b)评估miR-133家族成员的活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与在缺少所述候选化合物情况下的活性或表达比较，其中测量的活性或表达之间的差异指示所述候选化合物是所述miR-133家族成员的调控物。所述miR-133家族成员可以是miR_133a或miR_133b,且细胞可在体外或体内与候选化合物接触。所述候选化合物可以是肽、多肽、多核苷酸或小分子。评估miR-133家族的活性可包括确定T小管构造、线粒体功能、D匪2表达、或I型肌纤维组成。[0017]附图简述[0018]以下附图形成本说明书的一部分且包含以进一步显示本发明的某些方面。可通过参照这一个或多个附图联合对本文中呈现的特定实施方案的具体描述更好的理解本发明。[0019]图1.骨骼肌中miR-133的表达。(A)成体WT小鼠组织中miR_133a的Northern印迹分析。取下印迹条并用经32P标记的U6探针作为加载对照重新探查。Sol，比目鱼肌。(B)骨骼肌中miR-133的表达，通过实时RT-PCR检测并相对于U6表示。[0020]图2.具有正常肌外观的4周龄dKO小鼠。(A)来自4周龄WT和dKO小鼠的比目鱼肌、EDL、G/P和TA肌的H&E染色。比例尺=40μm。(B)将来自4周龄WT和dKO小鼠的TA肌用针对核纤层蛋白(Iaminin)的抗体免疫染色。使用DAPI染色来检测细胞核且显示无中心化的细胞核。尺寸条:30μπι。(C)4周龄WT和dKO小鼠的TA肌纤维的横截面面积使用ImageJ程序测定。n=3WT和dKO。检查来自每只小鼠的超过300根TA纤维。[0021]图3.对dKO小鼠的表征。(A)中央核性纤维在6-8周龄WT和dKO小鼠的各肌组中的百分数。对于WTn=3，而对于dKOn=6。误差棒代表SEM。(B)测量12周龄WT和dKO小鼠的体重(Bff)和肌重相对于胫骨长度(TL)比率。**代表p〈0.01;***代表p〈0.001。(C)从3月龄WT和dKO小鼠测定TA肌纤维的横截面面积。对于WTn=5,而对于dKOn=7。[0022]图4.dKO骨骼肌中的中央核性肌纤维。(A)对12周龄WT和dKO小鼠的比目鱼肌、EDL、G/P和TA肌的H&E染色。比例尺:40μm。(B)针对核纤层蛋白的TA肌的免疫染色。细胞核用DAPI染色。dKOTA肌显示中心细胞核。比例尺:40μm。(C)12周龄的4只WT小鼠和10只dKO小鼠中的中央核性肌纤维的百分数。对于每只小鼠，对TA和G/P肌计数超过500根肌纤维，对比目鱼肌和EDL肌计数超过300根肌纤维。(D)对dKOTA肌的NADH-TR染色揭示异常分布，辐射状肌原纤维间网络(箭头)，和环状纤维(星号)。比例尺:20μπι。(E)WT,dKO和mdx小鼠TA肌的EBD摄取。显示用核纤层蛋白的免疫显色(绿色)；EBD在荧光显微镜下检测为红色信号。比例尺:100μm。(F)肌原性基因和胚胎MHC(Myh3)和围产期MHC(Myh8)在WT和dKOTA肌中的表达，通过实时RT-PCR确定。n=3(WT和dKO)。[0023]图5.通过NADH-TR、H&E和免疫组织化学对dKO肌的分析。(A)12周龄WT和dKO小鼠的比目鱼肌、EDL、G/P和TA肌的NADH-TR染色。比例尺=40μm。(B)4周龄WT和dKO小鼠的比目鱼肌、EDL、G/P和TA肌的NADH-TR染色。比例尺=40μm。(C)12月龄WT和dKO小鼠的TA肌的H&E染色。比例尺=40μm。(D)对来自4周WT和dKO小鼠的TA肌的免疫染色，其使用针对DHPRα的抗体来检测T小管分布。在此龄的WT和dKO肌之间T小管染色模式中没有明显差异。尺寸条:30μπι。[0024]图6.dKO小鼠TA肌纤维中三联征的解体。(A)T小管和SR的编码组分的mRNA转录本的表达，其通过在12周龄小鼠TA肌中的实时RT-PCR确定。n=3(WT和dKO)。(B)对来自12周龄WT和dKO小鼠TA肌的横切面中T小管和SR的免疫染色。T小管由抗-DHPRa检测，而SR的终池(terminalcisternae)由抗-RyRl检测。细胞核通过DAPI检测，而肌纤维周界由抗核纤层蛋白染色。取切片多重水平图像并重构建以创建3D效果。比例尺:30μπι。(C-J)WT和dKO肌的电子显微图。dKOTA肌显示电子致密结构的累积(D-F)，这在WTTA肌中不存在(C)。dKO肌(H和J)展现相比于WT肌(G和I)处于异常取向的T小管(箭头)。比例尺:2ym(C和D)；0.5ym(E-H);0.2ym(HPJ)。[0025]图7.对WT和dKOTA肌与SR和T小管有关的蛋白质的Western印迹分析。Western印迹分析在来自3月龄WTdKOTA肌的蛋白质裂解物上实施。使用抗体来检测RyRUDPHRa、肌集钙蛋白(Casq)、SERCA2、受磷蛋白(Phospholamban)(pin)、在丝氨酸16磷酸化的受磷蛋白(Serl6_pln)、Sarcolipin(sin)、CamKII和磷酸化的CamKII的表达。检测作为加载对照的α-肌动蛋白。[0026]图8.dKO肌中的线粒体功能障碍。㈧从红色和白色腓肠肌分离线粒体，并针对RCR、ADP刺激的3态呼吸(ADP)和FCCP刺激的呼吸(FCCP)测量氧消耗速率(OCR)。n=2(WT和dKO)。相对WT*P〈0.05。(B)在从红色和白色腓肠肌分离的线粒体中测量脂肪酸氧化。在从红色和白色四头肌分离的线粒体中测量柠檬酸合酶酶活性。n=6(WT和dKO)。相对WT*P<0.05。[0027]图9.miR-133a调节骨骼肌中的Dnm2表达。(A)显示Dnn^S'UTR中miR_133a靶位点的位置以及miR-133a(5’-UUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’(SEQIDNO:29))与来自小鼠(5，-UGCCCUCCAUGCUGGGACCAGGCUCCCCG-3’(SEQIDNO:30))、人(5，-CGCCCCUAUGCUGGGACCAGGCUCCCAG-3’(SEQIDNO:31))和大鼠(5，-UGCCCCCCAUGCUGGGACCAGGCUCCCCG-3’(SEQIDNO:32))的UTR的序列比对。显示Dnn^S'UTR中保守的miR_133a结合位点(5，-GGGACCA-3，(SEQIDN0:33))。<5|ADnm23/UTR中的突变以破坏与miR_133a种子序列(5，-UGGUCCC-3’(SEQIDNO:34))的碱基配对。(B)将含有WT和突变Dnm23'UTR序列的萤光素酶报告构建体与表达miR-133a的质粒共转染到C0S-1细胞中。在转染后48小时，测量萤光素酶活性并相对于β_半乳糖苷酶活性标准化。(C)显示WT和dKOTA肌中Dnm2mRNA表达的实时RT-PCR。n=3(WT和dKO)。(D)显示WT和dKO小鼠的TA肌中发动蛋白2蛋白表达的Western印迹。n=2(WT和dKO)。取下印迹条并用针对α-肌动蛋白的抗体作为加载对照重新探查。还显示对发动蛋白2蛋白的定量，其通过密度计量学确定并相对于α-肌动蛋白标准化。[0028]图10.骨骼肌中Dnm2的过表达导致CNM。(A)对来自WT和MCK-DW2转基因小鼠系Tgl和Tg2的TA肌的Western印迹分析,其使用抗发动蛋白2和抗-myc来显示转基因的过表达。将抗微管蛋白用作加载对照。还显示通过密度计量学确定的蛋白质定量。(B)将6周龄WT、Tgl和Tg2小鼠的TA肌的横切面用小麦胚凝集素(WGA)和DAPI染色以显示转基因小鼠中的中心细胞核(箭头)。比例尺:100μπι。(C)7周龄转基因小鼠TA肌中中央核性肌纤维的百分数。(D)对11周龄WT和Tg2小鼠的TA和比目鱼肌的组织学分析。将TA肌切面用H&E、抗核纤层蛋白和DAPI染色以显示中心细胞核且用NADH-TR染色以揭示异常分布和辐射状肌原纤维间网络(箭头)。比例尺:40μm。(E)10周龄WT和Tg2小鼠(n=3每组)以及3月龄WT和dKO小鼠(n=5每组)在踏车上进行强迫的下坡跑动。随时间测量肌性能至力竭。还显示总跑动距离。*Ρ〈0.05;***Ρ〈0.001。[0029]图11.对MCK-Dnm2转基因小鼠的分析。⑷测量WT和MCK_Dnm2Tg小鼠在11周龄时的体重(Bff)和肌重。**代表p〈0.01;***代表ρ〈0.001。对于WT和Tg2小鼠，n=3。(B)对来自11周龄WT和Tg2小鼠的TA肌的免疫染色，其使用针对DHPRα的抗体来检测T小管分布。尺寸条:30μπι。(C)上面部分:显示发动蛋白2蛋白在11周龄Tg2比目鱼肌和心脏中表达的Western印迹分析。底部部分:对11周龄WT和Tg2小鼠的比目鱼肌的组织学分析。将比目鱼肌切片用H&E和异染性ATP酶染色以显示I型肌纤维(深蓝色)。[0030]图12.dKO和MCK-DW2转基因小鼠肌纤维中Dysferlin的胞内积累。(A)对来自WT和dKO小鼠的TA肌进行免疫染色以检测发动蛋白2和Dysferlin。在dKO肌纤维中观察到Dysferlin的胞内积累。覆盖图指示发动蛋白2和Dysferlin在dKO肌的胞内聚集物中的定位。比例尺:30μm。(B)对来自WT和Tg2小鼠的TA肌进行免疫染色以检测Dysferlin。在Tg2肌纤维中观察到Dysferlin的胞内积累。比例尺:30μπι。[0031]图13.通过miR_133a对骨骼肌纤维类型的调控。(A)对来自12周龄WT和dKO小鼠比目鱼肌的异染性ATP酶染色和抗MHC-1免疫染色显示dKO比目鱼肌中I型肌纤维的增加。还显示比目鱼肌的H&E染色。比例尺:100μm。(B)比目鱼肌中I型肌纤维的百分数，其通过异染性ATP酶染色测定。n=6(WT和dKO)。(C)比目鱼肌中MHC同种型(isoform)转录本的表达，其通过实时RT-PCR确定。n=3(WT和dKO)。还确定来自WT和dKO小鼠比目鱼肌、EDL和TA肌的蛋白质提取物的MHC同等型的表达，其通过甘油凝胶电泳继之以银染色进行。[0032]图14.对WT和dKO肌的纤维类型分析。(A)来自出生后第I天WT和dKO小鼠的比目鱼肌和EDL肌的免疫组织化学，其使用针对MHC-1的抗体。比例尺=100μm。(B)对来自4周和2周WT和dKO小鼠的比目鱼肌的异染性ATP酶染色。比例尺=100μm。[0033]发明详述[0034]本发明部分基于以下发现，即miRNA在骨骼肌结构、功能、生物能学和肌纤维身份的维持中起着必要作用。因此，本文中公开了用于治疗或预防异常骨骼肌功能或活性(如骨骼肌病)的方法和组合物。通过创建具有miR-133a-l和miR-133a_2的遗传缺失的小鼠，发明人开发出针对CNM的小鼠模型，其中该小鼠形成成体发作的CNM。该小鼠在II型(快缩(fast-twitch))肌纤维中形成CNM，伴随有受损的线粒体功能、快到慢的肌纤维转化和肌三联征(兴奋-收缩偶联位点)的混乱。这些异常模拟人CNM且至少能部分归因于编码发动蛋白2的miR-133a靶物mRNA的失调，该发动蛋白2是一种牵涉人中央核性肌病的GTP酶。如此，发明人确立miR133家族成员，具体而言miR-133a-l和miR-133a_2，是骨骼肌功能和内稳态的多方面所必要的。因此，本发明提供用于治疗和预防异常骨骼肌功能或活性的新治疗办法，其通过调控miR-133家族成员的活性或表达。[0035]miR-133家族含有3种高度同源的miRNA:miR-133a_l、miR-133a_2和miR_133b。miR-l-l/miR-133a-2和miR-l-2/miR-133a_lmiRNA簇在心脏和骨骼肌肉中表达，而miR-206/miR-133b簇仅在骨骼肌中表达(16)。MiR-206是急性神经损伤后神经肌肉突触的有效再生所需要的，而且miR-206的丧失加快了小鼠中肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)的疾病进展(17)。MiR-1和miR_133a在心脏形成和功能中起着重要作用(18，19)，而且还显示调节成肌细胞体外增殖和分化(20)，然而未研究这些miRNA在体内骨骼肌发育或功能中的潜在功能。[0036]MiR-133a-2与来自人20号染色体的miR-1-l共转录，而miR-133a_l与来自人18号染色体的miR-1-2共转录。MiR-133b与miR-206—起从来自人6号染色体基因间区的双顺反子转录本生成。MiR-133a-l和miR-133a_2彼此相同而与miR_133b相差两个核苷酸(18)。MiR-133a-l和miR-133a_2在心脏和骨骼肌肉中表达，而miR_133b是骨骼肌特异性的(18)ο下面显示了miR_133a和miR_133b的莖环和成熟序列:[0037]人miR_133a苯环(SEQIDNO:1):[0038]ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGC腳AGCUAUGCAUUGA[0039]人成熟miR_133a(SEQIDNO:2):[0040]UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG[0041]人miR-133b苯环(SEQIDNO:3):[0042]CCUCAGAAGAAAGAUGCCCCCUGCUCUGGCUGGUCAAACGGAACCAAGUCCGUCUUCCUGAGAGGUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUACAGCAGGGCUGGCAAUGCCCAGUCCUUGGAGA[0043]人成熟miR_133b(SEQIDNO:4):[0044]UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA[0045]本发明提供一种在有此需要的受试者中治疗或预防中央核性肌病的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。还提供一种在有此需要的受试者中维持骨骼肌结构或功能，抑制快到慢肌纤维转化，和预防或治疗骨骼肌细胞中的线粒体功能障碍的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。[0046]“激动剂”可以是增加特定miRNA的活性或表达的任何化合物或分子。例如，在某些实施方案中，miR-133家族成员的激动剂是包含成熟miR-133a或miR-133b序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQIDN0:2和/或SEQIDNO:4的序列。在另一个实施方案中，miR-133家族成员的激动剂可以是包含miR-133家族成员(如miR_133a或miR-133b)的pr1-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。在一个这类实施方案中，多核苷酸可包含SEQIDN0:1和/或SEQIDNO:3的序列。所述包含miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列的多核苷酸可以是单链或双链的。在一些实施方案中，所述多核苷酸与miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含与miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列100%互补的序列。[0047]所述多核苷酸可含有一个或多个化学修饰，如锁定的核酸、肽核酸、糖修饰如2’-O-烃基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基)、2’-氟和4’硫代修饰，以及主链修饰，如一个或多个硫代磷酸(phosphorothioate)、吗啉代、或膦酰羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接及包含其的组合。在一个实施方案中，所述包含miR_133a或miR-133b序列的多核苷酸缀合于类固醇，如胆固醇、维生素、脂肪酸、糖类或糖苷、肽或另一种小分子配体。在另一`个实施方案中，miR-133a或miR-133b的激动剂可以是不同于miR-133a或miR_133b的试剂，其作用于增加、补充或替换miR-miR_133a或miR_133b的功倉泛。[0048]在另一个实施方案中，miR_133a或miR_133b的激动剂可在体内从载体表达。“载体”是一种可用于向细胞内部递送感兴趣核酸的物质的组合物。本领域中已知大量载体，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物关联的多核苷酸、质粒和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺有关的病毒载体、逆转录病毒载体等。表达构建体可在活细胞中复制，或者其可合成制备。就本申请目的而言，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可互换使用以在一般的例示性意义上显示本发明的申请，且不意图限制本发明。[0049]在一个实施方案中，用于表达miR_133a或miR_133b的激动剂的表达载体包含“可操作地连接”于编码miR-133a或miR_133b的多核苷酸(如miR_133a或miR_133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列)的启动子。如本文中使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意指该启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向以控制通过RNA聚合酶的转录启动和该多核苷酸的表达。编码miR-133a或miR-133b的多核苷酸可编码miR_133a或miR_133b的初级miRNA序列(pr1-miRNA)、前体-miRNA序列(pre-miRNA)或成熟miRNA序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与miR-133a或miR-133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码与miR-133a或miR-133b的成熟序列、pre-miRNA序列或pr1-miRNA序列100%互补的多核苷酸。[0050]在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互补的序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDN0:2的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQIDN0.2至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互补的序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:3的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQIDN0.3至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互补的序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:4的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQIDN0.4至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互补的序列。[0051]所述包含SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、或SEQIDN0:4序列的多核苷酸长度可以为约18至约2000个核苷酸、约70至约200个核苷酸、约20至约50个核苷酸、或约18至约25个核苷酸。在一些实施方案中，所述包含与SEQIDN0.1、2、3、或4至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%互补的序列的多核苷酸长度为约18至约2000个核苷酸、约70至约200个核苷酸、约20至约50个核苷酸、或约18至约25个核苷酸。[0052]在某些实施方案中，编码基因产物的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”指由细胞的合成体系或引入的合成体系识别的、启动基因的特定转录所需要的DNA序列。术语启动子用于本文将指在针对RNA聚合酶1、11、或III的启动位点周围成簇的一组转录控制模块。[0053]在一些实施方案中，可将人细胞巨化病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶用于获得感兴趣多核苷酸序列的高水平表达。还涵盖使用本领域公知的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现感兴趣多核苷酸序列的表达，只要表达水平足以用于某个给定的目的。在某些实施方案中，可使用组织特异性启动子，如骨骼肌特异性启动子来获得感兴趣多核苷酸序列的组织特异性表达。[0054]通过采用具有公知特性的启动子，可优化转染或转化后感兴趣蛋白质的表达水平和模式。另外，对应答特定生理学信号而表达的启动子的选择可允许多核苷酸的可诱导性表达。在本发明背景中可采用几种调节元件来调节感兴趣多核苷酸(例如miR-133a或miR-133b的激动剂)的表达。[0055]病毒启动子、细胞启动子/增强子和可诱导启动子/增强子可在表达构建体中与感兴趣的多核苷酸组合使用。另外，任何启动子/增强子组合(如按真核生物启动子数据库EPDB)也可用于驱动多核苷酸的表达。如果提供适宜的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体)，那么真核生物细胞可支持从特定细菌启动子的细胞质转录。[0056]下表不意图穷举所有可能的涉及促进感兴趣多核苷酸的表达的元件，而仅为其示例。可使用的启动子或增强子的例子包括但不限于以下(或源自以下):免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLADQa和/或DQP、β-干扰素、白介素_2、白介素-2受体、II类MHC5、II类MHCHLA_DRa、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(MCK)、前清蛋白(转甲状腺素(Transthyretin))、弹性蛋白酶1、金属硫蛋白(MTII)、胶原酶、清蛋白、α-胎蛋白、t_珠蛋白、β-珠蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞粘着分子(NCAM)、Ct1-AntitrypairuH2B(TH2B)组蛋白、小鼠和/或I型胶原、葡萄糖调节的蛋白质(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样A(SAA)、肌钙蛋白I(TNI)、血小板源性生长因子(TOGF)、迪谢内肌营养不良(DuchenneMuscularDystrophy)、SV40、多瘤、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、细胞巨化病毒(CMV)和长臂猿白血病病毒。[0057]可使用的可诱导元件/诱导物的例子包括但不限于以下(或源自以下):MTII/佛波酯(TFA)、重金属；MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)/糖皮质激素；β-干扰素/聚(rl)x、聚(rc)；腺病毒5E2/E1A;胶原酶/佛波酯(TPA);间质溶解素(Stromelysin)/佛波酯(TPA)；SV40/佛波酯(TPA);鼠MX基因/干扰素、新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus);GRP78基因/A23187;α-2-巨球蛋白/IL_6;波形蛋白/血清；1类MHC基因Η_2κb/干扰素；HSP70/E1A、SV40大T抗原；多育曲菌素(Proliferin)/佛波酯-TPA;肿瘤坏死因子/PMA;和促甲状腺激素α基因/甲状腺激素。[0058]特别感兴趣的是肌肉特异性启动子，其包括但不限于:肌球蛋白轻链_2启动子(Franz等(1994)Cardioscience,Vol.5(4):235-43;KelIy等(1995)J.CellBiol.,Vol.129(2):383-396)、α肌动蛋白启动子(Moss等(1996)Biol.Chem.,Vol.271(49):31688-31694),肌钙蛋白I启动子(Bhavsar等(1996)Genomics,Vol.35(1):11-23);Na+/Ca2+交换器启动子(Barnes等(1997)JBiolChemVo1272(17):11510-11517)>抗肌萎缩蛋白(dystrophin)启动子(Kimura等(1997)Dev.GrowthDiffer.，Vol.39(3):257-265)、alpha7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer(1996)J.Bi0.Chem.,Vol.271(37):22915-22)、脑促尿钠排泄肽启动子(LaPointe等(1996)Hypertension,Vol.27(3Pt2):715-22)、αB-晶体蛋白/小热激蛋白启动子(Gopal-Srivastava(1995)J.Mol.Cell.Biol.,Vol.15(12):7081-7090),α肌球蛋白重链启动子(Yamauch1-Takihara等(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,Vol.86(10):3504-3508)、ANF启动子(LaPointe等(1988)J.Biol.Chem.,Vol.263(19):9075-9078)、和肌肉肌酸激酶(MCK)启动子(Jaynes等，Mol.Cell.Biol.6:2855-2864(1986);Horlick和Benfield,Mol.Cell.Biol.,9:2396,1989;Johnson等，Mol.Cell.Biol.，9，3393(1989))。[0059]可包含多腺苷酸化信号以引起期望的多核苷酸的适宜多腺苷酸化。可采用任何这类序列如人生长激素和SV40多腺苷酸化信号。还涵盖为表达盒元件的是终止子。这些元件可起着增强信息水平和最小化从盒到其他序列读通的作用。[0060]存在许多可将包含本发明多核苷酸的表达载体导入细胞的方式。在某些实施方案中，所述表达构建体包含病毒和源自病毒基因组的工程化构建体。某些病毒经由受体介导的胞吞作用进入细胞以整合到宿主细胞基因组内并稳定和有效表达病毒基因的能力使其成为用于将外来基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物。[0061]用于体内递送的一种方法牵涉使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意图包括那些含有腺病毒序列从而足以(a)协助构建体的包装和(b)表达其中已克隆的多核苷酸的构建体。所述表达载体包含腺病毒的经遗传工程化形式。对腺病毒(一种36kB线性双链DNA病毒)遗传构造的了解允许将腺病毒DNA的大片段用外来序列(长达7kB)替换。与逆转录病毒相反，对宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以附加体方式复制而无潜在遗传毒性(genotoxicity)。还有,腺病毒是结构稳定的,且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒基本上能感染所有的上皮细胞，不管其细胞周期阶段如何。腺病毒因其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、宽广的靶细胞范围和高感染性而尤其适宜用作基因转移载体。该病毒基因组的两端含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，其为病毒DNA复制和包装所需要的顺式元件。[0062]除了要求腺病毒载体为复制缺陷性或至少条件性缺陷性以外，不认为腺病毒载体的性质对于成功实践本发明是至关重要的。腺病毒可以是42种已知的不同血清型或亚组A-F的任何一种。亚组C的腺病毒5型是获得用于本发明的条件性复制缺陷性腺病毒载体的优选的起始材料。这是因为腺病毒5型是人腺病毒，关于其已知大量生化和遗传信息，且其很久以来就用于大多数采用腺病毒作为载体的构建。[0063]在一个实施方案中，所述载体是复制缺陷性的且将不会具有腺病毒El区。如此，可以方便地在已除去El编码序列的位置导入编码本文中公开的激动剂的多核苷酸。然而，腺病毒序列中构建体的插入位置对本发明并不重要。还可以将编码感兴趣的激动剂的多核苷酸插入E3替换载体中代替缺失的E3区，或E4区(其中辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷)。可将腺病毒载体施用给不同的组织，如通过气管滴注、肌注射、周围静脉注射和立体定向(stereotactic)接种到脑中。[0064]逆转录病毒载体也适用于在细胞中表达miR-133家族成员如miR_133a或miR-133b的激动剂。逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征是在受感染细胞中通过逆转录过程将其RNA转化成双链DNA的能力。所得DNA然后稳定地整合到细胞染色体内作为原病毒，并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致受体细胞及其后代中病毒基因序列的保留。逆转录病毒基因组含有3个基因gag、pol和env，其分别编码壳体蛋白、聚合酶和被膜组分。在gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装到病毒粒体中的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5’和3’端。这些含有强启动子和增强子序列，而且也是整合于宿主细胞基因组所需要的。[0065]为了构建逆转录病毒载体，将感兴趣的多核苷酸插入病毒基因组中替换某些病毒序列来产生复制缺陷性病毒。为了产生病毒粒体，构建含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起导入该细胞系中(通过例如磷酸钙沉淀)时，该包装序列允许重组质粒的RNA转录本包装到病毒颗粒中，然后其分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染很多种细胞类型。[0066]其他病毒载体可在本发明中用作表达构建体。可采用源自病毒如牛痘病毒、腺有关病毒(AAV)和疱疹病毒的载体。它们提供针对各种哺乳动物细胞的几种有吸引力的特征。[0067]为了引起感兴趣多核苷酸(即miR-133家族成员的激动剂)的表达，应将表达构建体递送到细胞中。该递送可在体外完成(如在用于转化细胞系的实验室规程中)，或在体内或离体完成(如在某些疾病状态的治疗中)。用于递送的一种机制是经由病毒感染，其中表达构建体被壳体包裹在感染性的病毒颗粒中。[0068]本发明还涵盖几种用于将表达构建体转移到培养的哺乳动物细胞中的非病毒方法,如本领域中已知的。这些包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、直接显微注射、DNA加载的脂质体和Iipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理、使用高速微射弹(microprojectile)的基因轰击(bombardment)、和受体介导的转染。其中一些技术可成功适应用于体内或离体使用。[0069]一旦已将表达构建体递送到细胞中，编码感兴趣多核苷酸的核酸就可安置在不同位点并表达。在某些实施方案中，可将编码感兴趣多核苷酸的核酸稳定整合到细胞基因组中。该整合可以经由同源重组(基因替换)在同类的位置和取向，或者可将其整合到随机的非特定位置(基因增加)。在进一步的实施方案中，所述核酸可作为DNA的分开的附加区段稳定维持于细胞中。这类核酸区段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与之同步进行维持和复制的序列。如何将表达构建体递送到细胞中和核酸维持在细胞何处仍取决于采用的表达构建体的类型。[0070]在本发明的再一个实施方案中，所述表达构建体可简单由裸重组DNA或质粒组成。构建体的转移可通过上述任一种方法实施，所述方法物理或化学地使细胞膜通透化。这尤其适用于体外转移但也可应用于体内使用。例如，已将磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA递送到成年和新生小鼠的肝和脾中，其显示活性病毒复制和急性感染，而且磷酸钙沉淀的质粒的直接腹膜内注射显示导致所转染基因的表达。涵盖将编码感兴趣多核苷酸(即miR-133家族成员的激动剂)的DNA也以类似的方式转移到体内并表达。[0071]在本发明的又一个实施方案中，裸DNA表达构建体到细胞内的转移可能牵涉颗粒轰击。该方法依赖于将用DNA包被的微射弹加速到高速从而允许其穿透细胞膜并进入细胞而不杀死它们的能力。已开发了几种用于加速小颗粒的装置。一种这类装置依赖于高伏特电荷来生成电流，其相应地提供原动力。使用的微射弹由生物惰性物质如钨或金珠组成。已在体内轰击大鼠和小鼠的选定器官，包括肝、皮肤和肌组织。这可能需要组织或细胞的手术暴露以消除任何在枪和靶器官之间的介入组织，即离体处理。同样，编码特定的感兴趣多核苷酸(即miR-133家族成员的激动剂)的DNA可经由此方法递送且仍然涵盖在本发明中。[0072]在本发明的再一个实施方案中，可将所述表达构建体包载于脂质体中。脂质体是小泡结构，其特征是磷脂双层膜和内部水性介质。多复层脂质体具有多个由水性介质分开的脂质层。当磷脂悬浮于过量水性溶液中时，它们自发形成。在形成闭合结构并在脂质双层之间包载水和溶解的溶质之前，脂质组分经历自身重排。还涵盖Iipofectamine-DNA复合物。[0073]在本发明的某些实施方案中，可将脂质体与红血球凝聚病毒(HVJ)复合。已显示其有助于与细胞膜的融合并促进脂质体包裹的DNA的细胞进入。在其他实施方案中，可将脂质体与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或组合使用。在别的实施方案中，可将脂质体与HVJ和HMG-1复合或组合使用。由于已在核酸的体外和体内转移和表达中成功采用了这类表达构建体，因此它们适用于本发明。当在DNA构建体中采用细菌启动子时，可期望将适宜的细菌聚合酶包含在脂质体内。[0074]可采用以将编码特定miR-133家族成员激动剂的核酸递送到细胞中的其他表达构建体是受体介导的递送媒介物。这些利用几乎所有真核细胞中存在的受体介导的胞吞作用进行的大分子的选择性摄取。由于各种受体的细胞类型特异性分布，递送可能是高度特异性的。受体介导的基因靶向性媒介物一般由两组分组成:细胞受体特异性配体和DNA结合剂。已将数种配体用于受体介导的基因转移。本发明涵盖已大量表征的配体无唾液酸血清类黏蛋白(asialoorosomucoid)(ASOR)和运铁蛋白。已将一种合成的拟糖蛋白(neoglycoprotein)(其与ASOR识别相同的受体)用作基因递送媒介物,而且还已将表皮生长因子(EGF)用于将基因递送到鳞癌细胞中，这均涵盖用于本文中。[0075]在其他实施方案中，所述递送媒介物可包含配体和脂质体。例如，已将乳糖基神经酰胺酶(一种半乳糖末端的无唾液酸神经节苷酯)掺入脂质体中并观察到通过肝细胞的胰岛素基因摄取中的增加。如此，以下是可行的，即还可通过任何数目的有或无脂质体的受体-配体系统将编码特定基因的核酸特定地递送到一种细胞类型中。[0076]在一个具体的例子中，寡核苷酸可与阳离子脂质组合施用。阳离子脂质的例子包括但不限于lipofectin、D0TMA、D0PE和D0TAP。通过提述具体并入的W00071096的公开内容描述了不同的制剂，如D0TAP:胆固醇或胆固醇衍生物制剂，其能有效用于基因疗法。其他公开还论述了包含纳米颗粒的不同脂质或脂质体制剂以及施用方法；这些包括但不限于美国专利公开文本N0.20030203865,20020150626,20030032615和20040048787，其通过提述以其披露制剂和关于施用和核酸递送的其他相关方面的程度具体地并入。用于形成颗粒的方法还披露于美国专利N0.5，844，107,5,877，302,6,008，336,6,077，835,5,972，901、6，200，801和5，972，900，其各自通过提述完整并入。[0077]在某些实施方案中，递送可更容易地在离体条件下实施。离体指从动物分离细胞，核酸在体外到细胞中，然后将经修饰的细胞返回到动物中。这可能牵涉组织/器官从动物的手术移出或细胞和组织的原`代培养。[0078]在某些实施方案中，要鉴定含有本发明核酸构建体的细胞。可通过在表达构建体中纳入标志物在体外或体内鉴定细胞。这类标志物会赋予细胞已可识别的变化，从而允许对含有表达构建体的细胞的容易的鉴定。通常，纳入药物选择标志协助克隆和转化体的选择,例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是可用的可选择标志。或者，可采用酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。还可以采用免疫学标志。不认为采用的可选择标志是重要的，只要它能与编码感兴趣多核苷酸(即miR-133家族成员的激动剂)的核酸同时表达即可。可选择标志的其他例子是本领域技术人员公知的。[0079]在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防受试者中的骨骼肌病的方法。“骨骼肌病”指其中存在并非由神经病症所导致的骨骼肌疾病的状况。肌病可由遗传的基因缺陷(例如肌营养不良)导致，或由内分泌、炎性(例如多肌炎)和代谢性病症导致。症状可包括但不限于，骨骼肌如近端肌或远端肌的无力和萎缩。一些肌病如肌营养不良在早期年龄段形成，而其他在生命后期形成。[0080]在一些实施方案中，本发明提供一种治疗或预防中央核性肌病(CNM)的方法，包括施用miR-133家族成员的激动剂。CNM是一组先天性肌病，其特征在于肌无力和肌纤维中细胞核的异常中心化(1，2)。CNM可分类成3种主要形式:具有严重的新生期表型的隐性X连锁的肌管性肌病(XLMTM)，其由肌微管素基因(MTMl)中的突变导致；具有轻度、中度或严重表型的经典常染色体显性形式，其由发动蛋白2基因(.Μ2)中的突变导致；和呈现严重和中度表型的常染色体隐性形式，其由双载蛋白2基因(BINl)中的突变导致(1，2)。如此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防受试者中XLMTM、CNM的经典常染色体显性形式、或CNM的常染色体隐性形式的方法。所述方法可包括施用miR-133家族成员的激动剂，如miR-133a或miR-133b的激动剂。在另一个实施方案中，治疗或预防CNM的方法包括对在MTMl、D匪2、或BINl基因中具有突变的受试者施用miR-133家族成员，如miR_133a或miR-133b的激动剂。[0081]CNM的特征通常包括以下常见的病理学特征:(a)I型肌纤维占优势和较小的纤维大小；(b)异常的NADH-四唑还原酶(NADH-TR)染色模式，指示线粒体异常；和(c)缺乏坏死、肌纤维死亡或再生(2)。如此，本文中还提供一种在受试者中维持骨骼肌结构或功能，抑制快到慢的肌纤维转化，和预防或治疗线粒体功能障碍的方法，包括施用miR-133家族成员的激动剂。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，如人、小鼠、马或犬。[0082]在本发明的另一个实施方案中，涵盖与其他治疗药征组合使用miR-133家族成员的激动剂。如此，除了本文中描述的本发明的miRNA激动剂以外，还可以向受试者提供“标准”的药物治疗。这类标准治疗将取决于要治疗的具体骨骼肌病，但可包括药物治疗、物理治疗、支具疗法(bracing)、手术、按摩和针刺疗法。[0083]可通过使骨骼肌细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触，或通过使所述细胞与两种不同的组合物或制剂(其中一种组合物包含miR-133家族成员的激动剂，而另一种包含第二药剂)同时接触来实现组合。或者，使用miRNA激动剂的治疗可在施用其他药剂之前或之后，其相差数分钟到数周的时间间期。在其中分别对细胞应用其他药剂和miRNA激动剂的实施方案中，一般会确保每次递送时间之间不会相隔相当长的时间，从而使得该药剂和miRNA激动剂还会能够对细胞`施加有利组合的影响。在这类情况下，通常用两种药征在彼此的约12-24小时内、更优选在彼此的约6-12小时内、最优选在仅约12小时的延迟时间内接触细胞。然而，在一些情况下，可能期望将治疗的时间段显著延长，其中在分别的施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)时间流逝。[0084]还涵盖会期望miRNA激动剂或其他药剂的超过一次施用。在此方面，可采用各种组合。举例而言，当miRNA激动剂是〃A〃而另一种药剂/治疗是"B"时，例示基于3和4次总施用的以下排列:A/B/A,B/A/B,B/B/A,A/A/B,B/A/A,A/B/B,B/B/B/A,B/B/A/B,A/A/B/B,A/B/A/B,A/B/B/A,B/B/A/A,B/A/B/A,B/A/A/B,B/B/B/A,A/A/A/B,B/A/A/A,A/B/A/A,A/A/B/A,A/B/B/B,B/A/B/B和B/B/A/B。类似地涵盖其他组合。[0085]本发明还涵盖在治疗后净化或清除miR-133家族成员激动剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在骨骼肌细胞中使用肌特异性启动子过表达miR-133家族成员的结合位点区。所述结合位点区优选含有miR-133家族成员的种子区的序列，跨越碱基2-8的miRNA5’部分。在一些实施方案中，所述结合位点可含有来自miR-133家族成员一个或多个靶物3’UTR的序列。例如，在一个实施方案中，针对miR-133a家族成员的结合位点含有D匪2的3’UTR。在另一个实施方案中，可在miR-133家族成员激动剂之后施用miR-133家族成员的抑制剂以减弱或停止该微RNA的功能。这类抑制剂可包括Antagomir、反义或抑制性RNA分子(例如siRNA或shRNA)。[0086]本发明还涵盖包含miR-133家族成员激动剂和药学可接受载体，如miR_133a激动剂和药学可接受载体，或miR-133b激动剂和药学可接受载体的药物组合物。当涵盖临床应用时，药物组合物将以适于意图应用的形式制备。一般而言，这就必须制备基本无致热原以及其他可能对人或动物有害杂质的组合物。[0087]胶体分散系统如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包含水包油乳剂)、微团、混合的微团、和脂质体可用作本文所述微RNA功能激动剂的递送媒介物。适于将本发明核酸递送到组织如骨骼肌组织的商品化脂肪乳剂包括IntralipidTM，Liposyn?,Liposyn?II,Liposyn?III,Nutrilipid和其他类似的脂质乳剂。优选的用作体内递送媒介物的胶体系统是一种脂质体(即人工膜小泡)。这类系统的制备和使用是本领域中公知的。例示性制剂还披露于美国专利N0.5，981，505;美国专利N0.6，217，900;美国专利N0.6，383，512;美国专利N0.5，783，565;美国专利N0.7，202，227;美国专利N0.6，379，965;美国专利N0.6，127，170;美国专利N0.5，837，533;美国专利N0.6，747，014;和W003/093449，其通过提述完整并入本文。[0088]一般会期望采用适宜的盐和缓冲物以使得载体稳定并允许通过靶细胞摄取。当将重组细胞引入患者中时，也将采用缓冲物。本发明的水性组合物包含有效量的递送媒介物，其溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中。短语“药学可接受”或“药理学可接受”指在对动物或人施用时不产生不利、过敏或其它不当反应的分子实体和组合物。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括溶剂、缓冲物、溶液、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等，可接受将其用于配制药物如适用于对人施用的药物。将这类介质和药剂用于药学活性物质是本领域中公知的。除非在任何常规介质或药剂与本发明的活性成分不相容的情况下，否则均涵盖其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可包含在组合物中，只要它们不使组合物的核酸失活。[0089]本发明的活性组合物可包含经典药物制备物。依照本发明的这些组合物的施用可经由任何常见路径，只要可经由该路径到达靶组织。这包括经口、鼻、或含服。或者，施用可通过皮内、经皮、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射，或通过直接注射到骨骼肌组织。正常地，这类组合物会作为如上文所述的药学可接受的组合物施用。[0090]所述活性化合物还可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，活性化合物作为游离碱或药理学可接受盐的溶液可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适宜混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中配制。在普通的储存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物的生长。[0091]适用于注射使用的药物形式包括，例如无菌水性溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。一般地，这些制备物是无菌的，且流动性达到可容易注射的程度。制备物在制备和存储条件下应是稳定的，且应当免于微生物如细菌和真菌的污染行为而保存。合适的溶剂或分散介质可含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适宜的流动性可例如通过使用涂层如卵磷月旨，通过在分散情况下维持要求的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如尼泊金类(parabens)、氯丁醇、苯酹、山梨酸、硫柳萊(thimerosal)等进行对微生物作用的阻止。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶进行。[0092]可通过将活性化合物以适宜量与任何其他成分(例如如上文列举的)一起(如期望的)纳入溶剂中来制备无菌可注射溶液，接着进行过滤灭菌。一般地，通过将各种已灭菌的活性成分纳入含有基础分散介质和期望的其它成分(例如如上文列举的)的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冻干技术，该技术从先前其无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其它期望成分的粉末。[0093]本发明的组合物一般可以中性或盐形式配制。药学可接受的盐包括，例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)。与蛋白质的游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)等)衍生。[0094]在配制时，优选地，以与剂量配制相容的方式和治疗有效的量施用溶液。配制物可容易地以多种剂量形式如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。对于水性溶液中的胃肠外施用，例如，溶液一般是适宜缓冲的且将液体稀释剂首先用例如充足的盐水或葡萄糖使其等渗。可将这类水性溶液例如用于静脉内、肌内、皮下、和腹膜内施用。优选地，如本领域普通技术人员已知的，特别是根据本公开来采用无菌水性介质。举例而言，单剂可溶解于Iml等渗NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注流体或在提出的输注位点注射(参见例如"Remington，sPharmaceuticalSciences"第15版，第1035-1038和1570-1580页)。药理学治疗剂和施用方法、剂量等是本领域技术人员公知的(参见例如，"PhysiciansDeskReference,〃Klaassen的〃ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,^^Remington'sPharmaceuticalSciences,〃和〃TheMerckIndex,EleventhEdition〃，通过提述以相关部分并入本文)，而且根据本文公开可与本发明组合。合适的剂量包括约20mg/kg至约200mg/kg,约40mg/kg至约160mg/kg,或约80mg/kg至约100mg/kg。根据所治疗的受试者的状况，必要地将在剂量中进行一些变更。负责施用的人无论如何会确定个体受试者的合适剂量，而且这类个体确定将在本领域普通技术人员的技能之内。而且，对于人施用，制备物应当满足FDA生物标准部门(FDAOfficeofBiologicalStandards)要求的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。[0095]可将本文中描述的任一种组合物纳入试剂盒中。在一个非限制性例子中，将miR-133a和/或miR_133b激动剂纳入试剂盒。所述试剂盒还可包含水和杂交缓冲液以协助miRNA两条链的杂交。试剂盒还可包含一种或多种转染试剂以协助多核苷酸激动剂到细胞的递送。[0096]可将试剂盒的组分以水性介质或冻干形式包装。容器意指所述试剂盒一般会包含至少一个管形瓶(vial)、试管、烧瓶、颈口瓶(bottle)、注射器或其他容器工具，其中可置有组分，而且优选经过适宜等分。在试剂盒中有超过一种组分的情况下(标记试剂和标记物可包装在一起)，所述试剂盒一般还将含有第二、第三或其他另外的容器，其中可分开放置另外的组分。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包含含有核酸的工具以及任何其他紧密限制用于商业销售的试剂容器。这类容器可包括注射或成形模塑料容器，其中持有期望的小瓶。[0097]当试剂盒的组分在一种和/或多种液体溶液中提供时，所述液体溶液是水性溶液，特别优选无菌水性溶液。然而，试剂盒的组分可以干燥后粉末提供。当试剂和/或组分以干燥粉末提供时，所述粉末可通过添加适宜的溶剂而重构。涵盖所述溶剂还可在另一个容器工具中提供。[0098]所述容器工具一般将包含至少一个管形瓶、试管、烧瓶、颈口瓶、注射器和/或其他容器工具，其中放置核酸配制物，优选是经过适宜分配的。所述试剂盒还可包含用于含有无菌的药学可接受缓冲物和/或其他稀释剂的第二容器。[0099]这类试剂盒还可包含保存或维持miRNA/多核苷酸或保护其免于降解的组分。这类组分可以是无RNA酶的或保护免于RNA酶。这类试剂盒一般将在合适的工具中包含用于每种分别的试剂或溶液的不同容器。[0100]试剂盒还将包含用于使用试剂盒组分以及使用任何其他不包含在试剂盒中的药剂的用法说明书。用法说明书可包含可执行的变更。试剂盒还可包含用于通过各种施用路径如胃肠外或肌内施用来施用miRNA激动剂的器具或装置。[0101]本发明还包括用于诊断受试者中的骨骼肌病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)从受试者获得骨骼肌组织样品；(b)评估miR-133家族成员在该样品中的活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与正常组织样品中miR-133家族成员的活性或表达比较，其中相比于正常组织样品中miR-133家族成员的活性或表达，miR-133家族成员活性或表达中的增加诊断为骨骼肌病。所述miR-133家族成员可以是miR-133a或miR-133b。在一些实施方案中，评估miR-133a和miR-133b两者的活性或表达。所述骨骼肌病可以是CNM。`[0102]在一个实施方案中，评估miR-133家族成员的活性包括评估由miR-133家族成员调节的一种或多种基因的活性，如由miR-133a和/或miR_133b调节的一种或多种基因的活性。例如，在一些实施方案中，由miR-133a调节的一种或多种基因是.Μ2。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括对受试者施用针对骨骼肌病的治疗并再评估miR-133a和/或miR-133b的表达或活性。可在治疗后获得miR-133a和/或miR_133b的表达或活性并与这些miRNA在正常组织样品或先前从受试者获得的组织样品(例如在治疗前)中的表达进行比较。[0103]本发明还包括用于鉴定骨骼肌功能调控物的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供一种用于鉴定骨骼肌中miR-133家族成员的调控物的方法。所鉴定的miR-133家族成员功能的激动剂可用于治疗或预防骨骼肌病如CNM。可将miR-133a和/或miR_133b的调控物(例如激动剂)包含在依照本发明的药物组合物中用于治疗或预防CNM、维持骨骼肌结构或功能、抑制快到慢的肌纤维转化、或预防或治疗线粒体功能障碍。[0104]用于鉴定调控物的测定法可包括随机筛选候选物质的大库；或者，所述测定可用于集中在特定的化合物类上，该类的选择是留心于认为使其更可能抑制或促进miR-133家族成员活性或表达的结构属性而得到的。[0105]为了鉴定miR-133家族成员的调控物，一般可在存在或缺乏候选化合物的情况下测定miR-133家族成员的功能或活性。在一个实施方案中，所述方法包括:(a)使骨骼肌细胞与候选化合物接触；(b)评估miR-133家族成员的活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与缺少该候选化合物情况下的活性或表达比较，其中测量的活性或表达之间的差异指示该候选化合物是miR-133家族成员的调控物，且因此是骨骼肌功能或维持的调控物。还可以在分离的细胞、器官或在活生物体中进行测定。[0106]评估miR-133家族成员的活性或表达可包括评估miR-133家族成员的表达水平，如miR-133a和/或miR_133b的表达水平。本领域技术人员将熟悉多种用于评估RNA表达水平的方法，包括例如Northern印迹或RT-PCR。评估miR-133家族成员的活性或表达可包括评估miR-133家族成员的活性，如miR-133a和/或miR_133b的活性。在其他实施方案中，评估miR-133家族成员的活性包括评估由miR-133家族成员调节的，如由miR_133a和/或miR-133b调节的基因如D匪2的表达或活性。本领域技术人员将熟悉多种用于评估由miR-133家族成员调节的基因的表达或活性的方法。这类方法包括例如，Northern印迹、RT-PCR、ELISA、或Western印迹。[0107]在一些实施方案中，评估miR-133家族成员的活性或表达可包括评估T小管构造、线粒体功能、D匪2蛋白或基因表达、或I型肌纤维组成。本领域技术人员将熟悉多种方法，如但不限于，记载于以下例子中的那些。例如，T小管构造可通过以下评估:电子显微镜、免疫组化和/或检查编码对于兴奋-收缩偶联重要的T小管和SR组分的基因的表达，所述组分包括二氢吡卩定受体(DHPR)的α1、βI和YI亚基(分别由Cacnals、Cacnbl和Cacngl编码)，斯里兰卡肉桂碱(ryanodine)受体I(Ryrl),I和2型SERCA泵(Atp2al和Atp2a2)，Sarcolipin和肌集钙蛋白I和2(Casql和Casq2)。线粒体功能可通过线粒体呼吸和/或脂肪酸氧化评估。对线粒体功能的评估可包括但不限于:(a)呼吸控制比率(RCR)，氧化磷酸化与ATP合成之间的偶联；(b)ADP刺激的3态呼吸，线粒体产生ATP期间的呼吸速率；和(c)羰基氰化物-P-三氟甲氧基苯腙刺激的(FCCP刺激的)呼吸。纤维组成可通过异染性ATP酶染色和/或免疫组化分析。纤维组成还可通过对编码每种MHC同等型，如I型MHC(MHC-1)和II型MHC(MHC-1Ia、MHC-1Ix/d和MHC-1Ib)的转录本表达的定量实时RT-PCR分析来评估。[0108]当然，会理解本发明的所有筛选方法本身均可用，尽管事实上可能未发现有效的候选物。本发明提供用于筛选这类候选物的方法，而非仅仅是发现它们的方法。[0109]如本文中使用的，术语“候选化合物”指任何可能通过miR-133家族成员潜在调控骨骼肌维持和功能的分子。可在“强力”鉴定可用化合物的努力中从多种商业性来源获得认为满足可用药物的基本标准的分子库。对这类库(包括组合生成的库)的筛选是一种快速和有效的筛选大量相关(和不相关)化合物活性的方式。组合性办法还适合通过创建在有活性但不想要的化合物上建模的第二、第三和第四生成化合物来进行到潜在药物的快速进化。可依照本发明方法筛选的候选化合物的非限制性例子是蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。miR-133家族成员的调控物还可以是miR-133家族成员上游调控物的激动剂或抑制剂。[0110]运行的一种快速、便宜且简单的测定法是体外测定法。这类测定法一般使用分离的分子，可快速并以大量运行，由此增加可在短时段内获得的信息量。可使用多种容器来运行该测定法，包括试管、板、皿和其他表面如浸溃片(dipstick)或珠。例如，可评估寡核苷酸对靶miRNA的杂交。用于高通量筛选化合物的一种技术记载于W084/03564。可在固体基质如胶针(plasticpin)或一些其他表面上合成大量小化合物。可快速筛选这类分子与miR-133a和/或miR_133b杂交的能力。[0111]本发明还涵盖筛选化合物在细胞中调控miR-133家族成员表达或功能的能力。可将多种细胞系，包括源自骨骼肌细胞的那些(例如C2C12细胞)用于这类筛选测定法，包括特定工程化以用于该目的的细胞。[0112]体内测定法牵涉使用各种动物模型，如在实施例中描述的miR_133a+小鼠。由于其个头、易于操作和关于其生理学和遗传构成的信息，小鼠是优选的实施方案，特别是对转基因而言。然而，其他动物也是合适的，包括大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠、土拨鼠(woodchuck)、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。调控物的测定可使用源自这些物种中任意一种的动物，包括经修饰以提供骨骼肌病模型的那些动物来进行。[0113]用测试化合物来治疗动物将牵涉以合适的形式将所述化合物施用给动物。施用将通过任何可用于临床目的的路径。测定化合物的体内有效性可牵涉多种不同的标准，包括但不限于改变突触体系或信号传导。还有，测量毒性和剂量应答可在动物中以比体外或胞内测定更有意义的方式实施。[0114]本发明包括一种调节细胞中D匪2表达的方法，包括使细胞与miR-133家族成员的调控物接触。在一个实施方案中，在施用miR-133(即miR-133a)激动剂后，D匪2在细胞中的表达降低。在另一个实施方案中，在施用miR-133(即miR-133a)抑制剂后，D匪2在细胞中的表达升高。在某些实施方案中，所述细胞是骨骼肌细胞。[0115]纳入以下实施例以进一步例示本发明的各个方面。本领域技术人员应领会下面实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明实践中作用良好的技术和/或组合物，如此可视为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应领会到，可在公开的特定实施方案中进行许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。实施例[0116]实施例1.miR-133在骨骼肌中的表达[0117]MiR-133a-l和miR-133a_2对于心脏的形成和功能是重要的(18)。缺少miR-133a-l或miR-133a_2的小鼠是正常的，而缺少这两种miRNA的约50%双敲除(dKO)小鼠在胚胎或新生时死于心室-间隔缺陷(18)。为了探索miR-133a在骨骼肌中的功能，研究了存活的miR-133adKO小鼠。[0118]通过Northern印迹分析测定了miR-133在几种具有不同肌纤维含量的骨骼肌中的表达。氧化性I型(慢缩)肌纤维富集于比目鱼肌，而糖分解II型(快缩)肌纤维富集于其他肌组，如腓肠肌和跖肌(G/P)、胫骨前肌(TA)和趾长伸肌(EDL)。miR-133a在所有这些肌组中以等同水平表达(图1A)，这指示其在I型和II型肌纤维中的可比水平。MiR-133b与miR-206共转录且在主要含有I型纤维的比目鱼肌中富集(17)。[0119]通过杂种繁殖miR-133a-l+/-miR-133a2+/-小鼠生成MiR_133a+(即dKO)小鼠，如先前描述的(18)，且通过定量实时RT-PCR确认dKO骨骼肌中miR-133a表达的丧失(图1B)。在dKO骨骼肌中检测的低水平miR-133表达代表miR-133b的存在，其由miR_133a探针检测。基于来自实时RT-PCR的结果，估算WT小鼠中miR-133a对miR-133b的相对丰度在比目鱼肌中为约15:1，而在G/P、EDL和TA肌中为约50:1，这确认了miR_133b在骨骼肌中丰度低于miR-133a，且富集于比目鱼肌中。[0120]实施例2.中央核性肌纤维在dKO骨骼肌中的积累[0121]dKO小鼠在活动性中未显示明显的异常。在4周龄时，dKO肌由组织学分析和针对核纤层蛋白和DAPI的免疫染色表现为正常，而且肌纤维大小与WT肌的那些可比(图2k-O。然而，到6周龄时，具有中央细胞核的肌纤维开始出现于dKO小鼠中，且具有中心细胞核的肌纤维在EDL、G/P和TA肌中的百分数随着年龄进行性增加(图3A)。到12周龄时，dKO小鼠TA肌中几乎60%的肌纤维含有中心化的细胞核(图4，A-C)。相比之下，dKO比目鱼肌具有相对少的中心化细胞核(图4，A和C)。这些发现表明dKO小鼠中位于中央的细胞核的表型是对于II型肌纤维特异性的。另外，在12周龄时，dKO小鼠在体重和各种肌组的重量(当标准化于胫骨长度时)显著更小(图3B)。dKO小鼠的TA肌纤维在此年龄也具有比正常更小的直径(图3C)。[0122]作为对肌异常性的进一步评估，通过NADH-TR染色分析了12周时dKO肌纤维中的线粒体和肌质网(SR)分布。dKO纤维在G/P、EDL和TA肌中比WT肌纤维显示更多的氧化性酶活性(图5A)，这可能反映了这些肌中快到慢的肌纤维转化(即II型到I型)。在各纤维内的氧化性酶活性也是不均一分布的，而且一些肌纤维显示辐射状肌原纤维间网络(图4D)。在NADH-TR染色时也偶尔观察到环样纤维(图4D)。在dKO和WT同窝出生者之间在比目鱼肌中没有NADH-TR染色中的显著差异(图5A)。有趣的是，在4周龄dKO肌中当不存在位于中央的细胞核时观察到正常的NADH-TR染色模式(图5B)。[0123]中央细胞核的累积通常指示应答疾病或损伤的肌再生(21-23)。如此，检查4周龄dKO肌纤维中肌损伤和再生的迹象。通过在受损细胞中累积的伊文思蓝染料(Evansbluedye(EBD))的摄取来监测肌膜完整性，其显示非常少的染料阳性纤维(少于4根每横切面)(图4E)。检查来自形成肌营养不良的mdx小鼠的肌肉用于比较；这些小鼠显示大量的EBD摄取(图4E)。分析肌酸激酶(CK)活性的血清水平(指示肌膜渗漏)，且观察到在3月龄dKO小鼠中仅稍微升高(2倍)的CK水平(数据未显示)。另外，dKO肌纤维未显示营养不良肌纤维特征性的炎症、纤维化或细胞凋亡的迹象(数据未显示)。在12月龄，未观察到dKO肌纤维中肌纤维形态学的恶化或炎症、纤维化或细胞死亡的指征(图5C)。[0124]为了测定肌再生，分析编码再生的几种肌原性标志物的mRNA的表达。Myog(其编码成肌素(myogenin))的表达在dKOTA肌中上调7倍,但在其他肌原性标志物如Pax3、Pax7和MyoD的表达水平中没有变化(图4F)。尽管在TA肌中通过实时RT-PCR在胚胎(Myh3)和围产期MHC(Mhy8)mRNA水平两者中有强烈提高(图4F)，但胚胎MHC蛋白很少通过免疫组化在dKO肌纤维中检测到(数据未显示)。这些数据指示在dKO小鼠中仅有稀有的肌再生，其不足以解释在这些小鼠中观察到的大量中央核性纤维。如此，dKO小鼠中无明显坏死、肌纤维死亡或显著再生的中央核性肌纤维是令人联想到人CNM的病理学特征(1，2)。[0125]实施例3.dKO小鼠肌纤维中的T小管解体[0126]在骨骼肌中，兴奋-收缩偶联发生于三联征，其由横向小管(T小管)和SR的2个终池构成(24)。在Mtml缺陷性小鼠中，肌纤维具有降低的三联征数和异常的T小管构造(3)。T小管解体也在人CNM患者中报告过(6，25)。[0127]为了评估T小管构造是否在dKO肌中受影响，检查编码T小管和SR中对于兴奋-收缩偶联重要的组分的基因的表达，所述组分包括二氢吡啶受体(DHPR)的α1、β1和YI亚基(分别由Cacnals、CacnbI和Cacngl编码)，斯里兰卡肉桂碱受体I(Ryrl),I和2型SERCA泵(Atp2al和Atp2a2)和肌集钙蛋白I和2(Casql和Casq2)。在mRNA水平上，大多数基因的表达未变化，除了Cancngl中2.5倍的增加以外(图6A)。还检查了RyRl、DHPRa、肌集钙蛋白和SERCA2在蛋白质水平上的表达并观察到最小变化(图7)。相比之下，观察到Sln的mRNA水平中35倍的增加，伴有Sarcolipin蛋白中的可比增加(图6A和图7)。Sarcolipin上调是骨骼肌肌病的普遍特征(26)，但该上调的显著性未知。受磷蛋白的表达在dKO肌中稍微上调，但磷酸化的受磷蛋白在蛋白质水平上稍微降低(图7)。[0128]还分析了三联征的构造，其通过针对DHPRα(一种T小管的标志物)和RyRl(一种SR终池的标志物)的免疫组化。在WT肌纤维的横切面中，T小管和SR的终池均展现出沿肌纤维均衡分布的点样染色模式(图6Β)，这反映了三联征相对于肌节的横向取向。然而，在dKO肌纤维中，T小管和SR均显示聚集的染色、在一些区域染色的缺失、和各纤维中不规则的分布(图6B)。另外，在WT肌中，临近肌纤维显示相同的染色模式。然而，在dKO肌中，临近肌纤维经常展现出不同的染色模式(图6B)，表明在临近纤维中三联征的不同取向。在4周龄当dKO小鼠未形成CNM时，T小管结构正常，如由DHPRa染色显示的(图OT)。[0129]进一步通过电子显微镜分析了三联征在超微结构水平上的形态学(图6，C-J)。在成年dKOTA肌纤维中，一些T小管(用铁氰化钾染黑)显示异常形态学和与肌原纤维方向排列的纵向取向；这些是很少在WT肌纤维中观察到的(图6，G-J)。还观察到沿肌纤维和在dKO肌纤维中三联征处电子致密膜状结构的积累(图6，D-F)。总之，这些发现指示miR-133a对于T小管和三联征的构造是重要的，而且其缺乏导致T小管解体。[0130]实施例4.dKO骨骼肌中的线粒体功能障碍[0131]为了确定miR_133a的缺乏是否改变骨骼肌中的线粒体功能，从来自dKO和WT小鼠的腓肠肌的红色和白色部分分离线粒体。紧接分离后，评估线粒体呼吸和脂肪酸氧化。对线粒体功能的评估包括:(a)呼吸控制比率(RCR)，氧化性磷酸化与ATP合成之间的偶联；(b)ADP刺激的3态呼吸，其中线粒体产生ATP期间的呼吸速率；和(c)羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙刺激的(FCCP刺激的)呼吸，当氧化性磷酸化从ATP合成解偶联时的最大呼吸速率。这些测量中任一种的降低均表明电子传递链、Krebs循环或ATP合酶活性中的缺陷。miR-133a的缺乏导致红色和白色肌中RCR、ADP刺激的3态呼吸、和FCCP刺激的最大呼吸中的显著衰退，尽管对FCCP刺激的最大呼吸的影响似乎在红色肌中更突出(图8A)。另外，总脂肪酸氧化在从来自dKO动物腓肠肌的红色和白色部分分离的线粒体中也显著更低(图SB)。在红色四头肌而非白色四头肌中的柠檬酸合酶中也有降低(图SB)。总之，这些结果证明miR-133a的缺乏导致红色和白色骨骼肌两者中更低的内在线粒体功能和脂肪酸氧化。[0132]实施例5.miR-133a靶向发动蛋白2(C^的一种调节物)[0133]为了探索dKO小鼠中骨骼肌异常性的机制基础，寻找在CNM中具有潜在作用的miR-133a的祀物。强预测的miR_133a祀物之一是Dnm2,—种牵涉胞吞作用、膜运输、和肌动蛋白调节以及微管细胞骨架的大GTP酶(11)。认为以显性阴性方式作用的人.Μ2基因中的点突变导致CNM的常染色体显性形式(7，8，27，28)。Dnm2mRNA的3'UTR含有进化上保守的miR-133a结合位点(图9A)。miR-133a抑制连接于Dnn^mRNAS'UTR的萤光素酶报告基因，而3'UTR中预测的miR-133a结合位点中的突变阻止抑制(图9B)，从而确认了Dnm2mRNA为miR_133a的靶物。而且，与WT小鼠相比，观察到通过定量实时RT-PCR的Dnm2mRNA中的2倍增加和通过Western印迹分析的dKOTA肌中发动蛋白2蛋白中的约7倍增加(图9，C和D)。这些结果指示miR-133在mRNA和蛋白质水平上均抑制发动蛋白2表达。[0134]实施例6.发动蛋白2在骨骼肌中的过表达导致II型肌纤维中的CNM[0135]为了检查如在dKO肌纤维中观察到的升高的发动蛋白2表达是否足以导致CNM，生成其中在肌CK(MCK)启动子控制下表达发动蛋白2蛋白(在C末端具有myc标签)的转基因小鼠(本文中称为MCK-DYN2小鼠)(29，30)。通过Western印迹使用针对发动蛋白2以及myc表位标签的抗体来确认转基因小鼠骨骼肌中发动蛋白2蛋白的过表达(图10A)。观察到两种MCK-DYN2转基因小鼠系Tgl和Tg2相比于WT水平分别显示3倍和6倍的发动蛋白2过表达。在7周龄时，两种转基因系展现中央核性肌纤维的累积(图10B)。有趣的是，在类似于dKO小鼠的水平过表达发动蛋白2的Tg2小鼠在TA肌中展现出与dKO小鼠的那些可比的年龄依赖性中央核性肌纤维(图10C)。[0136]在11周龄时，Tg2小鼠展现出肌萎缩的迹象，在TA和G/P肌两者中肌重量均降低(图11A)。在Tg2和WT同窝出生者之间的体重中没有差异(图11A)。对TA肌的组织学分析显示异质的纤维大小和中央核性纤维在Tg2小鼠中的存在(图10D)。中央核性肌纤维在Tg2小鼠TA肌中的百分数在该年龄时为约23%(数据未显示)。NADH-TR染色揭示氧化性酶活性和辐射状肌原纤维间网络的异常聚集(图10D)。还在Tg2TA肌中观察到T小管的异常构造，如通过针对DHPRa的免疫组化检测到的(图11B)。[0137]发动蛋白2蛋白未在Tg2小鼠的比目鱼肌或心脏中显著过表达(图11C)，这与II型肌纤维中MCK启动子的优先表达一致(29，30)。因此，不令人惊讶地观察到在Tg2小鼠的比目鱼肌或心脏功能中没有`异常(图1lC且数据未显示)。[0138]为了评估肌性能，小鼠进行下坡踏车跑动并分析到力竭时的跑动时间和距离。在10周龄时，Tg2小鼠跑动的时间显著短于WT小鼠(图10E)，指示肌无力。dKO小鼠显示在跑动能力中更急剧的降低(图10E)。然而，dKO小鼠中受损的心功能也可能是运动能力降低的作用因素。[0139]最近在人DW2有关的CNM患者以及携带R456WDnm2突变的杂合小鼠中报告了Dysferlin的胞内累积(9)。还分析了Dysferlin在dKO肌和Tg2肌中的定位。有趣的是，在dKO和Tg2肌纤维两者中均观察到肌纤维内Dysferlin的实质性累积(图12，A和B)。此外，至少一些胞内Dysferlin与发动蛋白2在dKO肌纤维中共定位(图12A)。[0140]这些结果证明骨骼肌中升高的Dnm2表达导致CNM，主要在II型纤维中，其模拟dKO表型。因此，可至少部分通过Dnm2的失调来解释dKO肌中的CNM。[0141]实施例8.dKO小鼠在比目鱼肌中显示增加的I型肌纤维[0142]除了CNM以外，dKO小鼠还在不显示CNM的比目鱼肌中显示增加的I型纤维数。分析来自成年dKO小鼠的比目鱼肌的纤维类型组成，其通过异染性ATP酶染色和针对I型肌球蛋白重链(MHC)的免疫组化，由深褐色染色显示。WT小鼠的比目鱼肌包含约43%的I型纤维(图13，A和B)。dKO小鼠的比目鱼肌显示I型纤维数中的2倍增加(图13，A和B)。[0143]对编码各MHC同等型的转录本表达的定量实时RT-PCR分析揭示，dKO比目鱼肌中相比于WT小鼠I型MHC(MHC-1)的增加和II型MHC(MHC-1Ia,MHC-1Ix/d和MHC-1Ib)中的降低(图13C)。通过对甘油凝胶的银染色检查比目鱼肌、EDL和TA肌中MHC同等型的蛋白质组成:有3条带存在于从WT小鼠分离的比目鱼肌的蛋白质提取物中，对应于MHCIIa/IIx,MHC-1Ib和MHC-1蛋白；2条带存在于来自WT小鼠的TA和EDL肌的蛋白质提取物中，代表MHC-1Ib和MHC-1Ia/IIx(图13C)。与来自定量实时RT-PCR的结果一致，dKO小鼠的比目鱼肌展现出MHC-1蛋白中的增加和MHCIIa/IIx蛋白中的降低。未在dKO比目鱼肌中观察到MHC-1Ib蛋白。有趣的是，在dKO小鼠TA和EDL肌中相比于WT小鼠氧化性MHCIIa/IIx蛋白增加而糖分解性MHC-1Ib蛋白降低，其指示这些肌组还展现出朝向更氧化性(IIa型)纤维的纤维类型转移。[0144]为了确定miR_133a的丧失是否在胚胎发育期间影响I型纤维的形成，通过免疫组化在Pl检查MHC-1表达。在PldKO小鼠的比目鱼肌或EDL肌的MHC-1阳性肌纤维数中没有明显差异(图14A)，其指示miR-133a不影响I型肌纤维的胚胎发育。为了确定dKO小鼠中何时发生纤维类型转换，通过异染性ATP酶染色分析2周龄和4周龄小鼠两者中的纤维类型组成。在这两种年龄处，dKO小鼠比目鱼肌中I型纤维的百分数增加了几乎2倍(图14B)。因此，miR-133a在胚胎发育期间不影响I型肌纤维的规范。相反，miR_133a在出生后抑制I型肌纤维，从而miR-133a的缺失导致成年小鼠I型肌纤维中的增加。[0145]本实施例显示缺少miR_133a的成年小鼠形成进行性CNM，其伴随有线粒体功能障碍和快到慢的肌纤维转化。如此，miR-133a的缺失导致CNM、线粒体功能障碍、肌三联征混乱和快到慢的肌纤维转化(II型到I型)。这些肌异常至少可部分归因于发动蛋白2(—种由miR-133a-l和miR-133a-2抑制的靶物)的上调。如此，所述发现例示了miR_133a在维持成年骨骼肌结构和功能中的必要作用，以及作为CNM调控物。MiR-133a在维持成年骨骼肌的正常结构和功能中具有作用。[0146]dKO小鼠中的骨骼肌异常与人CNM的那些非常相似，指示该miRNA在调控此病症中的重要作用。dKO肌的组织学特征，包括中央核性纤维的存在和坏死或肌纤维死亡的缺失，显示了与人CNM的类似性。dKO纤维中的NADH-TR染色模式模拟D匪有关CNM的典型NADH-TR染色模式，其显示肌质链的径向分布(2)。然而，与人CNM相反，在dKO小鼠的II型纤维而非I型纤维中观察到中央核性纤维。小鼠骨骼肌中miR-133a的丧失仅在II型纤维中导致CNM，这与人EMC有关的CNM患者中I型纤维占优势相反。很可能是因为在小鼠中，比目鱼肌受到保护免于肌损伤。然而，我们不能排除比目鱼肌富集的miR-133b(与miR-133a高度同源)保护比目鱼肌免于CNM的可能性。dKO小鼠比目鱼肌中CNM的缺乏可能是由于在比目鱼肌中富集的miR-133b的表达。或者，小鼠和人之间中央化细胞核的肌纤维分布中的差异可能反映肌功能中的物种差异。[0147]发明人先前报告了缺少Srpk3基因的小鼠中的II型纤维特异性CNM，Srpk3基因编码受MEF2调节的肌特异性丝氨酸、精氨酸蛋白激酶(SRPK)(31)。鉴于本研究中Srpk3-空(null)小鼠和dKO小鼠的骨骼肌之间的组织学相似性，可能miR-133a和Srpk3经由通用机制作用于影响肌结构和功能。[0148]已将.Μ2基因内的许多错义突变与常染色体显性CNM关联(7，8，27，28)。有趣的是，这些突变是杂合的错义突变或小缺失，其不影响D匪2转录本水平、蛋白质表达或定位(8，28)。然而，CNM有关的突变如何影响DW2细胞功能的机制未知。[0149]实施例显示miR-133a直接调节Dnm2mRNA和发动蛋白2蛋白表达。此外，骨骼肌中升高的Dnm2表达(以与dKO小鼠中的那些可比的水平)导致CNM，其指示骨骼肌功能依赖于准确的D匪2表达水平。尽管确切的机制未知，但可能增加的发动蛋白2蛋白导致异常的强发动蛋白装配并破坏有效装配和解体的能量平衡，该平衡是骨骼肌中适宜的D匪2功能所需要的。在此方面，已报告人中CNM相关性D匪2突变以显性-阴性方式作用于消弱膜运输、细胞骨架有关的过程和中心体功能(8，28)。[0150]不清楚dKO小鼠和MCK-DW2转基因小鼠中Dnm2获得功能如何也导致CNM。然而，最近的一项研究显示特定的CNM相关的D匪2突变导致增加的GTP酶活性并促进发动蛋白寡聚化而不改变脂质结合(32)。另一项研究还显示CNM相关的D匪2突变增强发动蛋白聚合物的稳定性而不损害其结合和/或水解GTP的能力(33)。在另一项研究中，表达最频繁的Dnm2突变R456W的杂合小鼠形成具有肌萎缩和无力但并非CNM的肌病(9)。表明发动蛋白2对收缩特性和核定位的影响是独立的。有趣的是，实施例显示Dnm2在骨骼肌中的过表达影响肌功能和核位置两者。这些表型中的差异可由使用的不同模型系统解释(即过表达对敲入)。但是，实施例证明骨骼肌对发动蛋白2蛋白水平敏感且升高的发动蛋白2表达在小鼠中导致CNM。[0151]还预测miR-133a革巴向其他基因，如那些编码肌动蛋白抑制蛋白(profiling)2、钙调蛋白UFGFRl和mastermind样I的基因。萤光素酶报告测定了这些mRNA的3'UTR并确认其在体外被miR-133a靶向；然而，miR_133a在体内对它们的调节在骨骼肌中不那么突出(数据未显示)。因此，尽管miR-133a靶向骨骼肌中的多个基因，但主要影响来自其对D匪2的调节。[0152]骨骼肌由具有独特收缩和代谢特性的异质性肌纤维构成(34)。成年肌纤维是高度可塑性的，且可应答工作加载、激素刺激和疾病在I型和II型表型之间转换。dKO小鼠的表型指示miR-133a抑制I型肌纤维基因程序。认为I型肌纤维比II型纤维对疾病或损伤更具抗性(35)。在许多肌肉疾病如迪谢内肌营养不良中，存在向I型的纤维类型转换，其可能充当保护性机制(36，37)。可能dKO肌中纤维类型中的变化继发于CNM表型。[0153]线粒体功能障碍牵连于许多肌病，包括迪谢内肌营养不良和代谢性和神经学病症(38-40)，以及老化过程(41，42)。来自实施例的结果与先前的发现，即线粒体异常与.Μ2相关的CNM有关一致(43)。然而，该结果可能似乎与dKO小鼠中快到慢的肌纤维转化不相容，因为认为I型纤维具有更多的氧化性酶活性。然而，不清楚在该差异下的确切机制且有几种可能的解释。到I型纤维的转换可能是不影响线粒体含量的肌球蛋白组成中变化的结果。另外，快到慢的肌纤维转化与毛细管和线粒体密度中的增加有关。这并未考虑各线粒体的功能能力。最后，线粒体功能中的损伤导致肌肉的降低的ATP可获性。如此，可能dKO肌中的纤维类型转化是针对线粒体功能障碍和降低的ATP可获性的保护机制(35)。[0154]来自实施例的结果证明，在心脏和骨骼肌两者中均表达的miR_133a在这些组织中起着不同作用。在心脏中，miR-133a在心脏形成期间调节心肌细胞增殖并抑制平滑肌基因程序(18)。miR-133a是骨骼肌发育不必要的，因为dKO小鼠直至4周龄后才展现出任何骨骼肌异常。dKO小鼠的骨骼肌在4周龄后形成CNM，而心脏在更后的年龄形成扩张型心肌病，其在一小组小鼠中导致心力衰竭和猝死(18)。有趣的是，dKO小鼠的心脏在4月龄时显示突出的肌节解体和受破坏的Z盘，以及严重的线粒体异常(18)。在另一方面，肌节结构和线粒体形态在dKO骨骼肌中很大程度上未受影响(图3)。更确切地，miR-133a特定地影响骨骼肌纤维中的三联征。不清楚为何心脏和骨骼肌应答miR-133a的损失显示不同的异常性。它可能反映了miR-133a对骨骼肌(如发动蛋白2)和心脏(如细胞周期蛋白D2和SRF)中不同靶基因的调节。另一个原因可能是以下事实，即在dKO骨骼肌中而非dKO心脏中表达高度同源的miR-133b，虽然以较低的水平。尽管可想到dKO小鼠中的心肌病可能有作用，但CNM与其他心肌病小鼠模型不相关。因此，所述结果指示，认为dKO小鼠中由miR-133a调节的骨骼肌异常主要由miR-133a在骨骼肌中的细胞自发(autonomous)功能导致。[0155]dKO小鼠和人CNM患者中骨骼肌异常的相似性表明，miR-133a在人肌病中起着调控作用。在这一方面,本发明提供了用于调控miR-133amRNA靶物如.Μ2的组合物和方法，其通过施用miR-133a激动剂如miR_133a多核苷酸。[0156]^[0157]MCK-DNM2转某闵小鼠的牛成。MCK-DNM2转基因通过将C末端带myc标签的大鼠Dnm2cDNA(来自J.Albanesi,UniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter,Dallas,Texas,USA的赠礼)置于4.8_kbMCK启动子下游生成。该构建体含有下游人生长激素聚(A)信号。转基因小鼠如先前描述的生成(44，45)。分析两个称为Tgl和Tg2的Fl系。[0158]Northern印迹分析。从小鼠骨盤肌组织分离总RNA,其使用miRNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)。如先前描述的实施Northern印迹来检测miR_133a和U6(18)。在杂交中使用用32P标记的Star-Fire寡核苷酸探针(IDT)对成熟miR_133a和U6探针。[0159]RT-PCR和实时分析。将RNA用TurboRNase-freeDNase(AmbionInc.)处理，接着进行逆转录步骤。使用随机六聚体引物(Invitrogen)实施RT-PCR。使用TaqMan探针(ABI)或SybrGreen探针实施定量实时RT-PCR。图6中使用的SybrGreen引物(如(3)描述的):[0160]CacnalsFor引物:5，—tccagctactgccatgctgat-3，(SEQIDNO:5)[0161]CacnalsRev引物5，_tcgacttcctctggttccat_3’(SEQIDNO:6)[0162]CacnblFor引物5，-ctttgcctttgagctagacc-3’(SEQIDNO:7)[0163]CacnblRev引物5，-gcacgtgctctgtcttctta-3’(SEQIDNO:8)[0164]CacnglFor引物5，-catctgcgcatttctgtcct-3，(SEQIDNO:9)[0165]CacnglRev引物5，-atcatacgcttcaccgactg-3，(SEQIDNO:10)[0166]RyrlFor引物5，-gttatcgtcattctgctggc-3，(SEQIDNO:11)[0167]RyrlRev引物5，-gcctattccacagatgaagc-3，(SEQIDNO:12)[0168]Atp2alFor引物5，-tggctcatggtcctcaagat-3，(SEQIDNO:13)[0169]Atp2alRev引物5，-cctcagctttggctgaagat-3’(SEQIDNO:14)[0170]Atp2a2For引物5，-agcttggagcaggtcaagaa-3，(SEQIDNO:15)[0171]Atp2a2Rev引物5，-gctctacaaaggctgtaatcg-3，(SEQIDNO:16)[0172]CasqlFor引物5，-actcagagaaggatgcagct-3，(SEQIDNO:17)[0173]CasqlRev引物5，-ctctacagggtcttctagga-3’(SEQIDNO:18)[0174]Casq2For引物5，-gtgtcttcagacaaggtctc-3’(SEQIDNO:19)[0175]Casq2Rev引物5，-acccttcagaacatacaggc-3’(SEQIDNO:2。)。[0176]图13中使用的SybrGreen引物(如(52)中描述的):[0177]MHC-1For引物5，-CCTTGGCACCAATGTCCCGGCTC-3，(SEQIDN0:21)[0178]MHC-1Rev引物5，-GAAGCGCAATGCAGAGTCGGTG-3’(SEQIDNO:22)[0179]MHC-1IaFor引物5，-ATGAGCTCCGACGCCGAG-3’(SEQIDNO:23)[0180]MHC-1IaRev引物5，-TCTGTTAGCATGAACTGGTAGGCG-3，(SEQIDNO:24)[0181]MHC-1IxFor引物5，-AAGGAGCAGGACACCAGCGCCCA-3，(SEQIDNO:25)[0182]MHC-1IxRev引物5，-ATCTCTTTGGTCACTTTCCTGCT-3’(SEQIDNO:26)[0183]MHC-1IbFor引物5，-GTGATTTCTCCTGTCACCTCTC-3’(SEQIDNO:27)[0184]MHC-1IbRev引物5，-GGAGGACCGCAAGAACGTGCTGA-3’(SEQIDNO:28)。[0185]依照制造商方案使用Taq-ManmiRNA测定试剂盒(ABI)来实施miRNA上的定量实时RT-PCR。[0186]骨骼肌的组织学分析。收获各种肌肉组，速冻于含有TissueFreezingMedium(TriangleBiomedicalSciences)和黄苗胶(Sigma-Aldrich)的3:1混合物的包埋培养基，或固定在4%多聚甲醒(paraformaldehyde)中，并加工用于常规石腊组织学。将冷冻的切片在低温切片机(cryotome)上切割并用H&E染色，如先前描述的(45)。依照标准方案实施在冷冻切片上的NADH-TR染色。如先前描述的实施在冷冻切片上的异染性ATP酶染色(44，45)。为了测定具有中央化细胞核的肌纤维的数目，在每只小鼠中对TA和G/P肌计算超过500根肌纤维，而对比目鱼肌和EDL肌计算超过300根肌纤维。使用ImageJ测定肌纤维横截面面积，并检查超过200根纤维每肌肉切面。[0187]电子显微镜。将小鼠麻醉，然后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.3)接着是0.1M二甲胂酸钠缓冲液中2.5%戍二醒和2%多聚甲醒经心脏(transcardially)灌注。将TA肌切开并加工用于T小管的选择性染色，如先前描述的(3)。[0188]EBD摄取。如先前描述的实施EBD摄取(46)。简言之，对小鼠腹膜内施用(0.1ml每IOg体重)EBD(10mg/ml于PBS)。使用转动车轮过夜让小鼠进行运动(所有小鼠均经历车轮跑动)，并在约18小时后收获肌肉。将腓肠肌和TA肌速冻于包埋介质中。将冷冻的切片用一抗家兔抗核纤层蛋白(Sigma-Aldrich,1:200),接着是二抗缀合AlexaFluor488的山羊抗家兔IgG(Invitrogen，1:400)免疫染色。EBD使用荧光显微镜检测为红色自体荧光。[0189]免疫组化。将冷冻的切片在新鲜制备的4%多聚甲醛中在冰上固定20分钟，然后用PBS中0.3%TritonX-100在室温处理20分钟。将切片与在PBS中0.01%TritonX-100中稀释的小鼠IgG`封闭溶液(来自M.0.M.试剂盒(VectorLab))于室温温育I小时。然后将切片与M.0.M.蛋白稀释剂中5%山羊血清(Sigma-Aldrich)温育30分钟。将切片与在M.0.M.蛋白稀释剂中稀释的一抗于4°C过夜温育。第二天早上，将载玻片用PBS清洗并与在M.0.M.蛋白稀释剂中稀释的二抗于室温温育45分钟。然后，清洗切片并用VectoShieldMountingMedium和DAPI封固。用Zeiss共聚焦显微镜取图像。一抗和二抗如下:DHPRa(ThermoScientific,1:100)、RyRl(克隆34C,Sigma-Aldrich,1:100)、核纤层蛋白(Sigma-Aldrich,1:200)、MHC-1(克HN0Q7.5.4D,Sigma-Aldrich,1:5,000)>Dysferlin(Hamlet,Novocastra,1:40)>发动蛋白2(Abeam,1:400)、缀合AlexaFluor594的山羊抗小鼠IgGl(Invitrogen,1:400)、缀合AlexaFluor488的山羊抗家兔IgG(Invitrogen，1:400)。如先前描述的实施小麦胚凝集素染色(46)。将MHC-1(克隆N0Q7.5.4D,Sigma-Aldrich,1:5,000)用于I型肌球蛋白的初级检测，而将缀合HRP的二抗(A8924,Sigma-Aldrich)接着是DAB发色团反应(DAKO)用于检测。然后将样品用苏木精复染色。[0190]Western印迹分析。从骨骼肌组织提取总细胞裂解物并在SDS-PAGE上解析。通过标准方案进行Western印迹。使用针对发动蛋白2(SantaCruzBiotechnology,1:100)、c-Myc(SantaCruzBiotechnology,1:1,000)>DHPRa(ThermoScientific,1:100)、RyRl(克隆34C,Sigma-Aldrich,1:100)、SERCA2(BDBiosciences,1:1,000),sarcolipin(来自M.Periasamy,OhioStateUniversity,Columbus,Ohio,USA的赠礼，1:1，000)、受磷蛋白(Upstate,1:1,000)、磷酸受磷蛋白(Millipore,1:1,000)、肌集钙蛋白2(SantaCruz,1:1,000)、微管蛋白(Sigma-Aldrich,1:5,000)和α-肌动蛋白(Sigma-Aldrich,1:2，000)的抗体。对Western印迹的定量通过密度计量使用PhosphoImager实施。[0191]细胞培养、转染和帝光素酶测定。将含有miR-133a结合位点的Dnm23'UTRl-kb片段克隆到pMIRREPORT载体(Ambion)中。如先前描述的实施miR_133a结合位点的诱变、细胞培养和萤光素酶测定(18)。[0192]踏车测试。使用Exer_6M(ColumbusInstruments)在15。下坡实施踏车测试。在踏车上以5m/min5分钟训练小鼠达2个连续日。接下来的一天，小鼠在踏车上以5m/min2分钟，以7m/min2分钟，8m/min2分钟,和10m/min5分钟跑动。其后，速度以lm/min增加至最终速度20m/min。力竭定义为尽管电刺动物也不能保持在踏车上。[0193]MHC同等型的电泳。从骨骼肌分离肌球蛋白并通过在甘油-SDS-PAGE凝胶上电泳分开，如先前描述的(47)。将凝胶用硝酸银染色试剂盒(Bio-Rad)染色。[0194]从腓肠肌分离线`粒体。线粒体分离自从腓肠肌切开的红色和白色骨骼肌，如先前描述的(48)，但有修改。将组织样品收集在含67mM蔗糖、50mMTris/HCl、50mMKClUOmMEDTA/Tris和10%牛血清清蛋白的缓冲液中。将样品切碎并在0.05%胰蛋白酶中消化30分钟。然后，将样品匀浆，通过差速离心分离线粒体。[0195]分离的线粒体中的呼吸。使用XF24胞外通量分析仪(extracellularfluxanalyzer)(SeahorseBioscience)来实施对分离的线粒体的呼吸测量。在分离和蛋白定量后，立即将线粒体以5μg/孔铺板于Seahorse细胞培养板上，其在存在IOmM丙酮酸盐和5mM苹果酸盐的情况下。实验组成为25秒混合和4至7分钟的测量周期。在基础条件、ADP刺激的(5mM)3态呼吸、寡霉素诱导的(2μM)4态呼吸和在存在FCCP(0.3μM)情况下的解偶联呼吸测量氧消耗以评估最大氧化性能力。RCR计算为3态/4态呼吸比率。所有实验均在37°C实施。[0196]脂肪酸代谢。在分离的线粒体中通过测量并加总来自[1-14C]-棕榈酸氧化的14CO2产生和用14C标记的酸可溶性代谢物来评估脂肪酸氧化，如先前描述的(49，50)。如先前描述的测量柠檬酸合酶活性(51)。[0197]动物护理。所有动物实验规程均由InstitutionalAnimalCareandUseCommitteesofUniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter评审和批准。[0198]统计。数据呈现为均倌土SEM。使用不配对双加尾的Student’st检验来检验组间差异的统计学显著性。低于0.05的P值视为显著的。[0199]参考文献[0200]1.JungbluthH,Wallgren-PetterssonC，LaporteJ.Centronuclear(myotubular)myopathy.0rphanetJRareDis.2008;3:26.[0201]2.RomeroNB.Centronuclearmyopathies:awideningconcept.NeuromusculDisord.2010;20(4):223-228.[0202]3.Al-QusairiL等，T_tubuledisorganizationanddefectiveexcitation-contractioncouplinginmusclefiberslackingmyotubularinlipidphosphatase.ProcNatlAcadSciUSA.2009;106(44):18763-18768.[0203]4.Buj-Bel1A等，AAV-mediatedintramuscuIardeliveryofmyotubularincorrectsthemyotubularmyopathyphenotypeintargetedmurinemuscleandsuggestsafunctioninplasmamembranehomeostasis.HumMolGenet.2008;17(14):2132-2143.[0204]5.Buj-BelloA等，Thelipidphosphatasemyotubularinisessentialforskeletalmusclemaintenancebutnotformyogenesisinmice.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99(23):15060-15065.[0205]6.DowlingJJ等，LossofmyotubularinfunctionresultsinT—tubuledisorganizationinzebrafishandhumanmyotubularmyopathy.PLoSGenet.2009;5(2):el000372.[0206]7.BitounM等，Dynamin2mutationscausesporadiccentronuclearmyopathywithneonatalonset.AnnNeurol.2007;62(6):666-670.[0207]8.BitounM等,Mutationsindynamin2causedominantcentronuclearmyopathy.NatGenet.2005;37(11):1207-1209.[0208]9.DurieuxAC等，Acentronuclearmyopathy-dynamin2mutationimpairsskeletalmusclestructureandfunctioninmice.HumMoIGenet.2010;19(24):4820-4836.[0209]10.HeymannJAjHinshawJE.Dynaminsataglance.JCellSc1.2009;122(Ptl9):3427-3431.[0210]11.DurieuxAC，PrudhonBjGuicheneyP，BitounM.Dynamin2andhumandiseases.JMolMed.2010;88(4):339-350.[0211]12.FilipowiczWjBhattacharyyaSN，SonenbergN.Mechanismsofpost-transcriptionalregulationbymicroRNAs:aretheanswersinsight?NatRevGenet.2008;9(2):102-114.[0212]13.WilliamsAHjLiuNjvanRooijE，OlsonEN.MicroRNAcontrolofmuscledevelopmentanddisease.CurrOpinCellBiol.2009;21(3):461-469.[0213]14.EisenbergI,AlexanderMS,KunkelLM.miRNASinnormalanddiseasedskeletalmuscle.JCellMolMed.2009;13(I):2-11.[0214]15.EisenbergI等,DistinctivepatternsofmicroRNAexpressioninprimarymuscuIardisorders.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(43):17016-17021.[0215]16.LiuN，OlsonEN.MicroRNAregulatorynetworksincardiovasculardevelopment.DevCell.2010;18(4):510-525.[0216]17.WilliamsAH等，MicroRNA_206delaysALSprogressionandpromotesregenerationofneuromuscularsynapsesinmice.Science.2009;326(5959):1549-1554.[0217]18.LiuN等，microRNA_133aregulatescardiomyocyteproliferationandsuppressessmoothmusclegeneexpressionintheheart.GenesDev.2008;22(23):3242-3254.[0218]19.ZhaoY等，Dysregulationofcardiogenesis，cardiacconduction,andcellcycleinmicelackingmiRNA-1-2.Cell.2007;129(2):303-317.[0219]20.ChenJF等，TheroleofmicroRNA-landmicroRNA-133inskeletalmuscleproliferationanddifferentiation.NatGenet.2006;38(2):228-233.[0220]21.ShiX，GarryDJ.Musclestemcellsindevelopment,regeneration,anddisease.GenesDev.2006;20(13):1692-1708.[0221]22.McNallyEMjPytelP.Musclediseases:themusculardystrophies.AnnuRevPathol.2007;2:87-109.[0222]23.TedescoFSjDellavalleA,Diaz-ManeraJ，MessinaG，CossuG.Repairingskeletalmuscle:regenerativepotentialofskeletalmusclestemcells.JClinInvest.2010;120(1):11-19.[0223]24.Franzin1-ArmstrongC，JorgensenA0.StructureanddevelopmentofE-Ccouplingunitsinskeletalmuscle.AnnuRevPhysiol.1994;56:509-534.[0224]25.ToussaintA等，Defectsinamphiphysin2(BINl)andtriadsinseveralformsofcentronuclearmyopathies.ActaNeuropathol.2011;121(2):253-266.[0225]26.BabuGJ等，Ablationofsarcolipinenhancessarcoplasmicreticulumcalciumtransportandatrialcontractility.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(45):17867-17872.[0226]27.BitounM等，Anewcentronuclearmyopathyphenotypeduetoanoveldynamin2mutation.Neurology.2009;72(I):93-95.[0227]28.BitounM等，Dynamin2mutationsassociatedwithhumandiseasesimpairclathrin-mediatedreceptorendocytosis.HumMutat.2009;30(10):1419-1427.[0228]29.DonovielDB，ShieldMA，BuskinJN，HaugenHS，CleggCH，HauschkaSD.Analysisofmusclecreatinekinasegeneregulatoryelementsinskeletalandcardiacmusclesoftransgenicmice.MolCellBiol.1996;16(4):1649-1658.[0229]30.ShieldMAjHaugenHS，CleggCH，HauschkaSD.E-boxsitesandaproximalregulatoryregionofthemusclecreatinekinasegenedifferentiallyregulateexpressionindiverseskeletalmusclesandcardiacmuscleoftransgenicmice.MolCellBiol.1996;16(9):5058-5068.[0230]31.Nakagawa0等，Centronuclearmyopathyinmicelackinganovelmuscle-specificproteinkinasetranscriptionallyregulatedbyMEF2.GenesDev.2005;19(17):2066-2077.[0231]32.KennistonJA，LemmonMA.DynaminGTPaseregulationisalteredbyPHdomainmutationsfoundincentronuclearmyopathypatients.EMBOJ.2010;29(18):3054-3067.[0232]33.WangL，BarylkoB，ByersC，RossJAjJamesonDM,AlbanesiJP.Dynamin2mutantslinkedtocentronuclearmyopathiesformabnormallystablepolymers.JBiolChem.2010;285(30):22753-22757.[0233]34.Bassel-DubyR，OlsonEN.Signalingpathwaysinskeletalmuscleremodeling.AnnuRevBiochem.2006;75:19-37.[0234]35.WebsterCjSilbersteinLjHaysAP，BlauHM.FastmusclefibersarepreferentiallyaffectedinDuchennemusculardystrophy.Cell.1988;52(4):503-513.[0235]36.WangJFjForstJjSchroderSjSchroderJM.CorrelationofmusclefibertypemeasurementswithclinicalandmoleculargeneticdatainDuchennemusculardystrophy.NeuromusculDisord.1999;9(3):150-158.[0236]37.CrosD，HarndenP，PellissierJF，SerratriceG.MusclehypertrophyinDuchennemusculardystrophy.Apathologicalandmorphometricstudy.JNeurol.1989;236(I):43-47.[0237]38.NaumannM等,Mitochondrialdysfunctioninadult-onsetmyopathieswithstructuralabnormalities.ActaNeuropathol.1995;89(2):152-157.[0238]39.KimJAjWeiYjSowersJR.Roleofmitochondrialdysfunctionininsulinresistance.CircRes.2008;102(4):401-414.[0239]40.JongpiputvanichS，SueblinvongT，NorapucsuntonT.Mitochondrialrespiratorychaindysfunctioninvariousneuromusculardiseases.JClinNeurosc1.2005;12(4):426-428.[0240]41.HebertSLjLanzaIR，NairKS.MitochondrialDNAalterationsandreducedmitochondrialfunctioninaging.MechAgeingDev.2010;131(7-8):451-462.[0241]42.LanzaIR，NairKS.Mitochondrialfunctionasadeterminantoflifespan.PflugersArch.2010;459(2):277-289.[0242]43.ZanoteliEjVerganiN，CamposYjVainzofMjOliveiraAS，d，Azzo`A.Mitochondrialalterationsindynamin2_relatedcentronuclearmyopathy.ArqNeuropsiquiatr.2009;67(I):102-104.[0243]44.NayaFJjMercerB，SheltonJjRichardsonJA，WilliamsRS，OlsonEN.Stimulationofslowskeletalmusclefibergeneexpressionbycalcineurininviv0.JBiolChem.2000;275(7):4545-4548.[0244]45.WuH等，RegulationofmitochondrialbiogenesisinskeletalmusclebyCaMK.Science.2002;296(5566):349-352.[0245]46.MiIlayDP等,Geneticandpharmacologicinhibitionofmitochondrial—dependentnecrosisattenuatesmusculardystrophy.NatMed.2008;14(4):442-447.[0246]47.KimMS等,ProteinkinaseDlstimulatesMEF2activityinskeletalmuscleandenhancesmuscleperformance.MolCellBiol.2008;28(11):3600-3609.[0247]48.FrezzaC，CipolatS，ScorranoL.0rganelleisolation:functionalmitochondriafrommouseIiver,muscleandculturedfibroblasts.NatProtoc.2007;2(2):287-295.[0248]49.FrisardMI等，Toll-likereceptor4modulatesskeletalmusclesubstratemetabolism.AmJPhysiolEndocrinolMetab.2010;298(5):E988-E998.[0249]50.HulverMW等，Elevatedstearoyl-CoAdesaturase-1expressioninskeletalmusclecontributestoabnormalfattyacidpartitioninginobesehumans.CellMetab.2005;2(4):251-261.[0250]51.HeilbronnLK等,Glucosetoleranceandskeletalmusclegeneexpressioninresponsetoalternatedayfasting.0besRes.2005;13(3):574-581.[0251]52.0hjM.等,Calcineurinisnecessaryforthemaintenancebutnotembryonicdevelopmentofslowmusclefibers.MolCellBiol.2005;(25):6629-6638.[0252]本文中论述和引用的所有文献、出版物、专利和专利申请通过提述完整并入本文。应理解本公开发明不限于描述的特定的方法学、方案和材料，因为这些均可以变化。还应理解本文中使用的术语学目的仅为描述具体的实施方案且不意图限制本发明的范围，所述范围仅由所附权利要求限制。[0253]本领域中的技术人员会仅使用常规实验法，认可或能确定对本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同体。这类等同体意图涵盖在所附权利要求中。【权利要求】1.一种治疗或预防有此需要的受试者中的中央核性肌病的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。2.一种在有此需要的受试者中维持骨骼肌结构或功能的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。3.一种在有此需要的受试者中抑制快到慢的肌纤维转化的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。4.一种在有此需要的受试者中预防或治疗线粒体功能障碍的方法，包括对所述受试者施用miR-133家族成员的激动剂。5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述miR-133家族成员是miR_133a。6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述miR-133家族成员是miR_133b。7.权利要求5的方法，其中所述激动剂是包含miR-133a序列的多核苷酸。8.权利要求7的方法,其中所述多核苷酸包含pr1-miR-133a、preniR-133a、或成熟miR-133a序列。9.权利要求8的方法，其中所述多核苷酸包含5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’的序列(SEQIDNO:2)。10.权利要求6的方法，其中所述激动剂是包含miR-133b序列的多核苷酸。11.权利要求10的方法,其中所述多核苷酸包含pr1-miR-133b、pre-miR-133b、或成熟miR-133b序列。12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸包含5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’的序列(SEQIDNO:4)。13.权利要求7-12任一项的方法，其中所述多核苷酸配制在脂质递送媒介物中。14.权利要求7-13任一项的方法,其中所述多核苷酸由表达载体编码。15.权利要求7-14任一项的方法，其中所述多核苷酸在骨骼肌启动子的调控下。16.权利要求15的方法，其中所述骨骼肌启动子是肌肉肌酸激酶启动子。17.权利要求7-16任一项的方法,其中所述多核苷酸为双链。18.权利要求7-16任一项的方法，其中所述多核苷酸缀合于胆固醇。19.权利要求7-18任一项的方法，其中所述多核苷酸长度为约70至约100个核苷酸。20.权利要求7-18任一项的方法，其中所述多核苷酸长度为约18至约25个核苷酸。21.权利要求7-20任一项的方法，其中通过皮下、静脉内、肌内或腹膜内施用路径对所述受试者施用所述激动剂。22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述受试者是人。23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述受试者在肌微管素(MTMl)基因中具有突变。24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述受试者在发动蛋白2(.Μ2)基因中具有突变。25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述受试者在双载蛋白2(ΒΙΝ1)基因中具有突变。26.一种用于鉴定骨骼肌中miR-133家族成员的调控物的方法，包括:(a)使骨骼肌细胞与候选化合物接触；(b)评估miR-133家族成员的活性或表达；并(c)将步骤(b)中的活性或表达与在缺少所述候选化合物情况下的活性或表达比较，其中测量的活性或表达之间的差异指示所述候选化合物是所述miR-133家族成员的调控物。27.权利要求26的方法，其中所述miR-133家族成员是miR-133a。28.权利要求26的方法，其中所述miR-133家族成员是miR-133b。29.权利要求26-28任一项的方法，其中使所述细胞与所述候选化合物在体外或体内接触。30.权利要求26-29任一项的方法,其中所述候选化合物是肽、多肽、多核苷酸或小分子。31.权利要求26-30任一项的方法，其中评估所述活性包括确定T小管构造、线粒体功能、D匪2蛋白或基因表达或I型肌纤维组成。【文档编号】A61K38/17GK103764173SQ201280042810【公开日】2014年4月30日申请日期:2012年7月2日优先权日:2011年7月1日【发明者】E.N.奥尔森申请人:得克萨斯系统大学董事会