可用于被动流感免疫的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明揭示与包括第1组和第2组代表在内的多个流感病毒进化枝具有交叉反应性的特异性单克隆抗体和片段，包括其双特异性抗体。这些抗体可用于控制流感流行和大范围流行，以及用于提供对抗季节性流感的预防性或治疗性保护。
【专利说明】可用于被动流感免疫的抗体
[0001] 相关申请案
[0002] 本申请案要求2011年12月5日提交的美国申请案第61/567, 046号的权益，该案 以全文引用的方式并入本文中。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及被动免疫以对抗流感的领域。更具体说来，描述结合于流感血球凝集 素A的HAtl成熟裂解位点共有序列附近的特异性抗体，包括由人类细胞分泌的抗体。
【背景技术】
[0004] 流感病毒的血球凝集素蛋白（HA)具有在流感病毒株之间高度异质的球状头部结 构域，和含有进入细胞中所需的融合位点的茎区。HA以三聚体形式存在于病毒包膜上。血 球凝集素蛋白的未裂解形式（HAtl)通过由胰蛋白酶裂解成HA1和HA2部分以允许融合位点 影响毒性来活化。这两个裂解的部分保持使用二硫键偶合，但在低PH环境中经历宿主细胞 内体小室的构象变化，导致病毒和宿主细胞膜的融合。
[0005] 裂解位点含有A型流感和B型流感以及A型和B型流感的各种病毒株所共有的共 有序列。未裂解的血球凝集素蛋白三聚体（HAtl)是称为不活化形式，而当裂解成HA1和HA2 部分时，血球凝集素蛋白是称为呈活化形式。
[0006]比安奇（Bianchi，E.)等人，病毒学杂志（J.Virol.) (2005)79 :7380-7388 描述基 于这一裂解位点的共有序列的"通用"B型流感疫苗，其中包含这一位点的肽当结合于脑膜 炎双球菌（Neisseriameningitidis)的外膜蛋白复合物时能够在小鼠中产生抗体。还描 述了看来结合于所述共有序列的单克隆抗体。此外，在小鼠中观察到抗血清的成功被动转 移。包含衍生自流感的M2和/或HA蛋白的肽的其它现有技术疫苗，诸如W02004/080403 中所述的那些，诱导具有微弱功效或在病毒株间无效的抗体。
[0007] 所属领域中描述的结合HA茎区的抗体包括由库赛尔（Crucell)开发的那些，即在 以下文献中描述的CR6261和CR8020 :思罗斯比（Throsby，M.)等人，公共科学图书馆-综 合（PLoSOne) (2008)3 :e3942 ;爱可尔特（Ekiert，D.C.)等人，科学（Science) (2011)333 : 843-850 ;和隋（Sui，J.)等人，自然结构和分子生物学（Nat.Struct.Mol.Biol.) (2009) 16 : 265-273。也已经针对保守M2E抗原开发MAB，如格兰迪（Grandea，A.G.)等人，美国国家科 学院院刊（PNASUSA) (2010) 107 :12658-12663所述。M2E在受感染细胞的表面上且也是金 刚胺和金刚乙胺的靶标。针对这些抗生素已产生抗药性，暗示这一靶标并未满足基本功能。
[0008] 额外抗体已经由兰泽瓦西亚小组（LanzavecchiaGroup)描述：柯蒂（Corti，D.) 等人，科学（Science) (2011) 333 :850-856,其结合并中和A型流感的第1组和第2组病毒 株，但效力不如以下实例中所示的本文所述的那些抗体高。此外，如德莱弗斯（Dreyfus，C.) 等人，科学（Science) (2012)337 :1343-1348所述的针对A型和B型流感具有免疫反应性的 MB具有比下文所述的那些抗体低的效力。
[0009]PCT申请公开案第W02011/160083号以引用的方式并入本文中，描述源自人类细 胞且适用于被动疫苗的单克隆抗体。所述抗体展示结合于流感病毒进化枝Hl的高亲和力，所述进化枝在第1组中，且一些抗体还展示与也在第1组中的H9和/或与在第2组中的H7 和/或在第1组中的H2的高亲和力。一些所揭示的抗体仅结合不活化三聚体形式，大概在 共有裂解区域处，而其他抗体能够结合已经裂解的活化的血球凝集素蛋白。
[0010] 仍需要结合额外进化枝且展示增强的与所述进化枝的亲和力的抗体。
【发明内容】
[0011] 本发明提供以增强的亲和力结合代表A型流感的第1组和第2组中任一者或两者 的三聚体的抗体。所述抗体能够在由例如先前未鉴别的流感病毒株或目前可获得的季节性 疫苗无法赋予保护作用的病毒株引起的大范围流行事件中赋予被动免疫性。因为至少一些 抗体结合多种病毒株，指示靶向基本位点，所以其可能结合先前甚至未遇到过的病毒株。所 述抗体还可用于改善或预防疫苗接种无法产生完全保护反应或因弱免疫系统而处于高风 险的个体（例如，非常年幼者、老年人、移植患者、经癌症或HIV化学疗法治疗的患者）的感 染。
[0012] 因此，在一个方面，本发明针对与作为模式标本的第1组（包括H1、H2、H5、H6、H8、 H9、Hll、H13、H16)或第2组（包括H3和H7)的A型流感病毒具有广泛交叉反应性或展示 跨组反应性的结合部分，特别是单克隆抗体或其免疫反应性片段。一些下文说明的抗体特 异性结合于HAtl蛋白中所含的表位且识别HA的原生三聚体形式以及活化形式。
[0013] 特别重要的是双特异性抗体和其片段，其能够放大可特异性结合的病毒进化枝的 范围。
[0014] 所属领域中应充分了解，基于非免疫球蛋白的蛋白质可具有与抗体类似的表位识 别特性且也可提供合适的实施例，包括基于纤维连接蛋白、转铁蛋白或脂质运载蛋白的结 合剂。基于核酸的部分，诸如适体也具有这些结合特性。
[0015] 在其它方面，本发明针对使用本发明的结合部分来被动抑制已经暴露于病毒或已 经受感染的个体的病毒感染的方法。本发明还针对重组物质和产生抗体或片段的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1展示所属领域中已知的流感病毒的分类，分为有效进化枝的各组。
[0017] 图2展示活体外MAB579结合于各种H7和H3病毒株的结果，这两种病毒株都表示 第2组。
[0018] 图3A和3B展示两种核心mAb，MAB53 (第1组）和MAB579 (第2组），其对跨越各 别组的进化枝具有亚nM未和力。
[0019] 图4A和4B对比MAB486和MAB579的中和活性。如图4A中所展示，MAB486以及 来自兔免疫的多克隆制剂在胰蛋白酶不存在下有效地仅中和H1N1。相比之下，图4B展示 MAB579在胰蛋白酶存在和不存在下都有效。
[0020] 图5为包含MAB579和MAB53的可变区的双特异性抗体的图解。
[0021] 图6A-6E展示MAB53、MAB579、其混合物和图5中展示的双特异性抗体的活体内功 效。
【具体实施方式】
[0022]本发明提供可用结合部分，包括抗体和其片段，以及提供鉴别分泌所述抗体的细 胞的有效方式，使得可获取并存储相关编码序列用于后续容易地进行所述抗体的重组产 生。
[0023]本发明的抗体或类似结合部分适用于预防和治疗。因此，其可用于保护个体免受 病毒攻击以及治疗已经暴露于流感或受到流感感染的个体。最密切关注的个体为人类个体 且对于在人类个体中的使用，是传统天然抗体或其免疫反应性片段的结合部分的人类形式 或人类化形式是优选的。然而，含有如当用于实验动物研究时由CDR区所指示的适当结合 特征的抗体可保留非人类特征。用于以下实例的研究（尽管在小鼠中进行）中的抗体仍然 含有人类可变区和恒定区二者。
[0024] 除人类以外，可使用包括本发明抗体的结合部分进行治疗和预防的个体还包括易 受流感感染的任何个体。因此，各种哺乳动物，诸如牛、猪、绵羊和其它哺乳动物个体（包括 马和家庭宠物）将受益于这些结合部分的预防和治疗用途。此外，已知流感会感染鸟类物 种，鸟类物种也将受益于含有本发明抗体的组合物。
[0025]用于预防和治疗的方法为常规方法且一般众所周知。抗体或其它结合部分通常通 过注射提供，但口服疫苗也可认为有效。剂量水平和投药时间安排容易优化且在所属领域 的技能范围内。
[0026] 分泌适用抗体的人类细胞可尤其使用在美国专利7, 413, 868中描述的细胞斑点 (CellSpot)?方法来鉴别，这一专利的内容以引用的方式并入本文中。简而言之，所述方法 能够在利用以微粒标记作标记和显微镜观察的高通量分析中筛选从人类（或其它）个体 获得的个别细胞。在一个说明性实施例中，通过使所分泌的抗体吸附或偶合到表面上且接 着用各自偶合到独特微粒标记的所需抗原处理所述表面，甚至可分析单一细胞所分泌的抗 体。因此可借助于显微镜鉴别细胞印迹。使用这种技术，可针对所需抗体分泌筛选数百万 个细胞，且甚至可回收罕见的抗体，诸如本文中在病毒株间进行被动流感免疫所需的那些 抗体。由于人类个体具有针对至少一些流感病毒株的现有抗体，且由于通过本发明方法获 得的抗体结合保守序列，因此这些抗体用于对新病毒株以及人类群体已经历的病毒株进行 定址的目的。
[0027] 获得合适抗体的方法不限于细胞斑点?技术，它们也不限于人类个体。产生合适 抗体的细胞可通过各种方式鉴别且所述细胞可为诸如小鼠或其它啮齿动物的实验动物的 那些细胞。编码这些抗体的核酸序列可为分离的且产生多种形式的抗体，包括由非人类细 胞产生的嵌合和人类化形式的抗体。此外，重组产生的抗体或片段包括单链抗体或其Fab 或Fab2区域。人类抗体也可使用诸如具有人类化免疫系统的XenoMcmse?的宿主获得。用 于产生供针对合适结合特征进行筛选的抗体的方法为所属领域中众所周知的。
[0028]类似地，以所需结合模式构建适体的方法也为所属领域中已知的。
[0029] 如上文所注，抗体或其它结合部分可结合血球凝集素蛋白的活化形式、不活化形 式或两者。在一些情况下有利的是，表位处于这种蛋白质的裂解位点处，因为其在病毒株之 间相对保守，但优选所述结合部分结合三聚体和活化形式两者。
[0030]A型流感和B型流感的各种病毒株的裂解位点为已知的。举例来说，上文所引用的 比安奇（Bianchi)等人的文章在表1中展示数种所述病毒株的裂解位点周围的序列：
[0031] 复I A型和B型流感病毒成熟裂解位点的溶剂暴露区域的共有序列
[0032]
【权利要求】
1. 一种结合部分，其为单克隆抗体，包括双特异性抗体或其免疫反应性片段，或其为 抗体模拟物，所述结合部分与 MAB383、MAB486、MAB579、MAB699、MAB700、MAB708、MAB710、 MAB711或MAB723结合到A型流感病毒的相同表位。
2. 根据权利要求1所述的结合部分，其中和H3和H7感染。
3. 根据权利要求1所述的结合部分，其与MAB579结合到相同表位。
4. 根据权利要求3所述的结合部分，其进一步与MAB53结合到相同表位。
5. 根据权利要求4所述的结合部分，其为双特异性抗体或其片段，其为人类或人类化 或嵌合的。
6. 根据权利要求1所述的结合部分，其为抗体或其片段且包含包含以下序列的重链： QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCRASGYTFTSFGFSWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKSPQKLQGRVTMTTD TSTNTAYMELRSLISDDTAVYYCARAPPLYYSSWSSDYWGQGTLLTVSS(MAB383)或 QVQLVESGGGMVQPGGSRRLSCAASGFSFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGEKQYYLDSVKGRFTISRD NSKDTLYLQMNSLTAEDTAVYYCVKESARRLLRYFEWLLSSPFDNWGQGALVTVSS(MAB486)或 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTAYTIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGHTKYSQRFKGRVTITRD TSARTTYMELRSLTSEDTALYFCARGPETYYYDKTNWLNSHPDEYFQHWGHGTQVTVSS(MAB579)或 QLQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSYTLHWVRQAPGQTLEWMGWINAGNGKTKYPPKFRGRVTITRD TSATTVDMHLSSLTSEDTAVYFCARGPESYYYDRSDWLNSHPDEYFQYWGQGTLVIVSS(MAB699)或 QVQLVESGADVKKPGASVTVSCKASGYTFRSFTMHWVRQVPGQRLEWMGWINAGNGKTKYSQKFQGRVIVTRD TSASTAYMELSSLTSEDTAVYYCARGPETYYYDSSNWLNSHPDEYLQYWGQGTPVTVSS(MAB700)或 QVQLVQSGADVKRPGASVTVSCKASGYTFRSFTMHWVRQVPGQRLEWMGWINAGNGKTKYSQKFQGRVIVTRD TSANTAYMELSSLTSEDTAVYYCARGPETYYYDSSNWLNSHPDEYFQHWGQGTPVTVSS(MAB708)或 QVQLQESGAEVKKPGASVQVSCKASGYTFTSYSVHWVRQAPGQRPEWMGWINAGNGKTKYPQKFKGRVTITRD TLARTVNIHLSSLTSEDTAVYFCARGPDSYYYDRNDWLNSHPDEYFQHWGQGTVVIVSS(MAB710)或 QVQLVESGAEVKKPGASVKITCEASGYTFNTYTIHWLRQAPGQRLEWMGWINAANGHTKYSRKLRSRVTIKRD TSARTSYMELSSLGSEDTAVYYCARGPETYYFDKTNWLNSHPDEYFQHWGQGTLVTVSS(MAB711)或 QVQLVQSGAAVNKPGASVKVSCKASGYSFTSYTLHWVRQAPGQRPEWIGWINAGNGKVKYPRKLQGRITITRD VSATTVHMELRSLTSEDTGLYYCARGPESYFFDTSNHLNSHPDEYFQFWGQGTLVTVSS(MAB723)。
7. 根据权利要求6所述的抗体或片段，其包含包含以下序列的轻链： DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKHGQAPRPLIYGASRRATDVPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKLEIK(MAB383)或 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYTSNKKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGS GTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTSPYTFGQGTKLEIK(MAB486)或 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQTINNYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQEYNNDSPLTFGGGTKVEIK(MAB579)或 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIACRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASQLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TINSLQPDDFATYYCQLYNVYSPLTFGGGTRVDIK(MAB699)或 DIVLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQEYNNNSPLTFGGGTKVEIK(MAB700)或 DIQMTQSPSTLPASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQEYNNNSPLTFGGGTKVEIK(MAB708)或 DIVMTQSPSTLSASV⑶RVTISCRASQSIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQLYNVHLITFGGGTRVDIK(MAB710)或 DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLESGVPARFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQEYNNDSPLILGGGTTVEIK(MAB711)或 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPDDFATYYCQEYNNNSPLTFGAGTKVEIK(MAB723)。
8. 根据权利要求6所述的抗体或片段，其进一步包含包含以下序列的重链： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWVRQAPGQGLEWVSSITRTSSNIYYADSVEGRFTISRD NAKNSLYLQMHSLRVEDTAVYYCARISGVVGPVPFDYWGQGTLITVSS(MAB8)或 QVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKVSGGIIRKYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIAIFNTANYAQKFQGRVTITAD ESTSTVYMELSSLRSEDTALYYCARGMNYYSDYFDYWGQGSLVTVSP(MAB53)〇
9. 根据权利要求8所述的抗体或片段，其进一步包含包含以下序列的轻链： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISKYLNWYQQKPGRAPKLLIYSASSLQSGVPSRFTGSGSGTDFTL TITSLQPEDFATYYCQQSYRPSQITFGPGTKVDIK(MAB8)或 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSNNLAWYQHKPGQAPRLLIFGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFT LTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPALTFGGGTKVEIK(MAB53)〇
10. 根据权利要求1所述的结合部分，其中重链可变区包含 具有序列AYTIH的⑶R1，和 具有序列 WINAGNGHTKYSQRFKGR 的 CDR2,和 具有序列 GPETYYYDKTNWLNSHPDEYFQH 的 CDR3(MAB579);或 具有序列SYTLH的CDR1，和 具有序列 WINAGNGKTKYPPKFRGR 的 CDR2,和 具有序列 GPESYYYDRSDWLNSHPDEYFQY 的 CDR3(MAB699);或 具有序列SFTMH的⑶R1，和 具有序列 WINAGNGKTKYSQKFQGR 的 CDR2,和 具有序列 GPETYYYDSSNWLNSHPDEYLQY 的 CDR3(MAB700);或 具有序列SFTMH的⑶R1，和 具有序列 WINAGNGKTKYSQKFQGR 的 CDR2,和 具有序列 GPETYYYDSSNWLNSHPDEYFQH 的 CDR3(MAB708);或 具有序列SYSVH的CDR1，和 具有序列 WINAGNGKTKYPQKFKGR 的 CDR2,和 具有序列 GPDSYYYDRNDWLNSHPDEYFQH 的 CDR3(MAB710);或 具有序列TYTIH的⑶R1，和 具有序列 WINAANGHTKYSRKLRSR 的 CDR2,和 具有序列 GPETYYFDKTNWLNSHPDEYFQH 的 CDR3(MAB711);或 具有序列SYTLH的CDR1，和 具有序列 WINAGNGKVKYPRKLQGR 的 CDR2,和 具有序列 GPESYFFDTSNHLNSHPDEYFQF 的 CDR3 (MAB723)。
11. 根据权利要求10所述的结合部分，其中轻链可变区包含 具有序列RASQTINNYLA的CDR1和具有序列KASSLES的CDR2以及具有序列QEYNNDSPLT 的 CDR3(MAB579);或 具有序列RASQSISSWLA的CDR1和具有序列KASQLES的CDR2以及具有序列QLYNVYSPLT 的 CDR3(MAB699);或 具有序列RASQSISSWLA的CDR1和具有序列KASTLES的CDR2以及具有序列QEYNNNSPLT 的 CDR3(MAB700);或 具有序列RASQSISSWLA的CDR1和具有序列KASSLES的CDR2以及具有序列QEYNNNSPLT 的 CDR3(MAB708);或 具有序列RASQSIDSWLA的CDR1和具有序列KASNLES的CDR2以及具有序列QLYNVHLI 的 CDR3(MAB710);或 具有序列RASQSISTWLA的CDR1和具有序列KASNLES的CDR2以及具有序列QEYNNDSPLI 的 CDR3(MAB711);或 具有序列RASQSISSYLA的CDR1和具有序列KASNLES的CDR2以及具有序列QEYNNNSPLT 的 CDR3(MAB723)。
12. 根据权利要求11所述的结合部分，其进一步含有重链可变区，所述可变区包含 具有序列KYAIN的⑶R1，和 具有序列 GIIAIFNTANYAQKFQG 的 CDR2,和 具有序列 GMNYYSDYFDY 的 CDR3 (MAB53)。
13. 根据权利要求12所述的结合部分，其进一步含有轻链可变区，所述可变区包含 具有序列RASQSVRSNNLA的CDR1，和 具有序列GASSRAT的CDR2,和 具有序列 QQYGSSPALT 的 CDR3 (MAB53)。
14. 根据权利要求13所述的结合部分，其为双特异性抗体或片段，其为嵌合、人类或人 类化的。
15. 根据权利要求1所述的结合部分，其为双特异性抗体或片段，其包含 重链可变区，所述可变区含有 具有序列AYTIH的⑶R1，和 具有序列 WINAGNGHTKYSQRFKGR 的 CDR2,和 具有序列 GPETYYYDKTNWLNSHPDEYFQH 的 CDR3(MAB579);和 重链可变区，所述可变区含有 具有序列KYAIN的⑶R1，和 具有序列 GIIAIFNTANYAQKFQG 的 CDR2,和 具有序列 GMNYYSDYFDY 的 CDR3 (MAB53);以及 所述双特异性抗体或片段包含轻链可变区，所述可变区含有 具有序列RASQTINNYLA的CDR1，和 具有序列KASSLES的CDR2,和 具有序列 QEYNNDSPLT 的 CDR3(MAB579);和 轻链可变区，所述可变区含有 具有序列RASQSVRSNNLA的CDR1，和 具有序列GASSRAT的CDR2,和 具有序列 QQYGSSPALT 的 CDR3 (MAB53)。
16. 根据权利要求15所述的结合部分，其为双特异性抗体或片段，其为嵌合、人类或人 类化的。
17. 根据权利要求1所述的结合部分，其包含MAB383、MAB486、MAB579、MAB699、MAB700、 MAB708、MAB710、MAB711 或 MAB723 的重链的 CDR3。
18. -种医药组合物，其包含根据权利要求1到17中任一权利要求所述的结合部分。
19. 一种治疗或预防个体的流感感染的方法，所述方法包含向个体投与有效量的根据 权利要求18所述的组合物。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述个体感染流感。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述个体经保护以免于流感感染。
22. -种重组表达系统，其包含一或多个编码根据权利要求1到17中任一权利要求所 述的抗体或片段的重链和/或轻链可变区的核苷酸序列，所述序列可操作地连接到控制序 列以供表达。
23. -种重组宿主细胞，其经修饰以含有根据权利要求22所述的表达系统。
24. -种产生与流感病毒具有免疫反应性的单克隆抗体或片段的方法，所述方法包含 在其中表达所述核苷酸序列的条件下培养根据权利要求23所述的细胞。
【文档编号】A61K38/04GK104302321SQ201280067362
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2011年12月5日
【发明者】劳伦斯·M·卡乌瓦尔, 斯托特·埃尔斯沃思, 威廉·乌辛格, 克里斯塔·莫琳·麦卡琴, 明哈·帕克 申请人:特瑞利斯生物科学有限责任公司