天冬氨酰-tRNA合成酶-FC缀合物的制作方法

天冬氨酰-tRNA合成酶-FC缀合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了天冬氨酰-tRNA合成酶与Fc区的缀合多肽（DRS-Fc缀合物）如DRS-Fc融合蛋白、包含其的组合物，以及使用该缀合物和组合物治疗或诊断各种病症的方法。相对于对应的未改性的DRS多肽，本发明的DRS-Fc缀合物具有改善的受控释放特性、稳定性、半衰期和其他药代动力学和生物学特性。
【专利说明】天冬氨酰-tRNA合成酶-FC缀合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请基于35U.S.C. § 119(e)要求于2011年12月29日递交的美国临时申请第 61/581，550号的权益，其通过引用整体并入本文。
[0003] 关于序列表的声明
[0004] 与本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸件副本，其通过引用并入本说明书 中。含有该序列表的文本文件的名称为ATYR_109_01W0.ST25.txt。该文本文件大小为约 263KB，创建于2012年12月20日，其通过EFS-Web电子递交。
[0005] 发明背景

【技术领域】
[0006] 本发明总体涉及一个或多个天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)多肽和免疫球蛋白Fc区的缀合物如融合蛋白、含有其的组合物，以及使用该多肽和组合物治疗或诊断各种病症 的方法。
[0007] 相关领域的描述
[0008] 最近已经表明，天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)及其片段和变体（总称DRS或AspRS多肽）具有多种与治疗和诊断相关的非经典活性。具体地，已经确定某些天冬氨酰-tRNA合 成酶片段为内源性生成的高效力Toll样受体调节剂。不受任何一种具体操作理论的束缚， 据认为这类DRS多肽在蛋白水解切割后或通过全长DRStRNA合成酶的替代性剪切自巨噬 细胞释放，且能够结合至其他细胞类型并调节免疫调节活性。当给予这类DRS多肽时，提供 了选择性调节炎症反应的新机制，且没有通常与传统抗炎剂如类固醇关联的副作用特性。
[0009]Toll样受体（TLR)是在启动生物体的快速先天免疫反应中发挥重要作用的模式 识别受体家族。TLR识别某些病原体或源自宿主的细胞组分，其特征通常分别为病原体相关 的分子樽式（PAMP)或损伤相关的分子模式（DAMP)。PAMP对于给定类型的病原体通过为独 特的，并包括例如细菌组分如革兰氏阴性细菌的脂多糖，以及病毒特异性核酸基序或者病 毒特异性的RNA或DNA修饰。相反，DAMP通常为内源性分子，其在细胞应激或组织损伤后 子垂死的宿主细胞释放。
[0010] TLR通过不同的可能机制参与几种慢性炎症和免疫介导的病症，包括那些被认为 是感染试剂启动了疾病发展的病症。例如，内源性损伤信号或自体抗原以TLR依赖性方式 引起慢性炎症的情况，或者其中TLR可能与免疫耐受性崩溃有关。已发现TLR与慢性炎症 疾病的发病机理有关，如炎症性肠病、风湿性关节炎、牛皮癣和多发性硬化。
[0011]目前越来越认识到，组织的一些自体免疫性和炎症病症的成功治疗，需要有 效控制炎症反应，以便保护组织的完整性和功能而不造成患者的免疫损伤。近来的实 验证据表明，TLR途径的具体调控引起一些炎症病症的改善而没有损伤组织功能或促 进细菌或病毒感染，这暗示了具有明显改善的副作用特性的新抗炎治疗策略的可能 性。此外，已经证明TLR激动剂可用于过敏性、感染性和自体免疫疾病的临床试验，并正 发展用于多种其他疾病，包括癌症、关节炎、多发性硬化、炎症性肠病，一般参见Zhu和 Mohan(2010),MediatorsofInflammationdoi:10. 1155/2010/781235;Hennessyet al.，Nat.Rev. 9:293-307, 2010)。因此，TLR越来越被认为是调控多种疾病和病患的可能的 新治疗靶标。
[0012] 为了最好地开发治疗或诊断环境中的这些和其他活性，本领域需要具有改善的药 代动力学特性的DRS多肽。这些改善的治疗形式的DRS多肽使得能够开发出治疗各种疾病 和病患的更有效的治疗方案，并比未改性的蛋白需要明显更少的给药频率。

【专利附图】

【附图说明】
[0013]图 1 显示了纯化的蛋白AspRSlN1(C76S) (DRS(1-154) (C76S)(SEQIDN0:29)和相 应的非突变蛋白AspRSlN1(DRS(l-154))(SEQIDN0:31)的SDS-PAGE分析。在还原性条 件下运行泳道1-3,并在非还原性条件下运行泳道4-6。泳道1和4:AspRSlN1DRS(l-154)lot#D-Nl-V5H-046，泳道 2 和 5AspRSlN1(DRS(l-154))lot#D-Nl-V5H-047，泳道 3 和 6:AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)lot#D-Nl:l-V5H-048。
[0014] 图2显示了HEK-Blue2细胞中针对AspRSlN1(SEQIDN0:31)(灰色方块）和AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)(黑色圆圈）刺激受TLR2受体介导的报告基因活性的能力 的直接比较。灰色三角形_Pam3CSK4。
[0015] 图3显示了HEK-Blue4细胞中针对AspRSlN1(SEQIDN0:31)(灰色方块）和AspRSlN1(C76S)(SEQIDN0:29)(黑色圆圈）刺激受TLR4受体介导的报告基因活性的能力 的直接比较。
[0016] 图4显示了DRS-Fc(SEQIDN0:37)纯化的SDS-PAGE分析。泳道1，澄清的裂解 产物；泳道2,MabSelect穿流（flow-through);泳道3,MabSelect洗漆；泳道4,纯化的DRS-Fc〇
[0017] 图5显示了DRS-Fc融合蛋白（SEQIDNO:37)的SEC分析。上面的迹线（trace) 是280nm处的吸光度，而下面的迹线是260nm处的吸光度。
[0018] 图6显示了示例性免疫球蛋白的结构组成，并提供了抗体类型和亚类的概述。
[0019] 图 7 显示了 来自人IgAl(SEQIDN0:66)、IgA2(SEQIDN0:67)、IgM(SEQID N0:68)、IgGl(SEQIDN0:69)、IgG2(SEQIDN0:70)、IgG3(SEQIDN0:71)、IgG4(SEQID N0:72)和IgE(SEQIDN0:73)的Fc区的比对。序列上方显示了Fca的二级结构。脱字符O和星号（*)显示了分别占结合表面的0-4%和5-12%的残基。
[0020] 图8显示了在身体局部辐照生存模型中给予AspRSlN1(C76S)的结果；AspRSlN1 (C76S)显示为正方形，而PBS对照显示为菱形。
[0021] 图9A和9B显示了相比媒介物对照（PBS)(菱形）和阳性对照（地塞米松（三角 形），在痛风炎症（正方形）的MSU诱导的模型中给予AspRSlN1(C76S)的结果。插图显示 了AspRSlN1(C76S)( "稳定素（Homeokine)"）相比媒介物对照的统计显著性。
[0022] 发明概述
[0023] 本发明的实施方案总体上涉及具有一个或多个与其共价结合的免疫球蛋白Fc区 的天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)多肽缀合物、包含这类分子的药物组合物、生产方法及其治 疗应用方法。除其他优势外，相对于相应的未修饰的DRS多肽，本发明的DRS-Fc缀合物可 具有改善的药代动力学特性和/或改善的治疗相关的生物学活性。
[0024] 因此，某些实施方案包括DRS融合多肽，其包含与SEQIDN0:l、3_24、29、31或 154-197中任一序列具有至少80%同一性的DRS氨基酸序列，和至少一个融合至所述DRS多肽的C-末端、N-末端或两端的Fc区。在一些实施方案中，所述DRS多肽包含与SEQID NO: 1、3-24、29、31或154-197中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在具体的实 施方案中，所述DRS多肽包含SEQIDN0:l、3-24、29、31或154-197中任一序列所示的氨基 酸序列。
[0025] 在某些实施方案中，所述DRS多肽长度为约130-300个氨基酸，且包含SEQID N0:1 的氨基酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174、1-182、1-184、1-224 或 1-274,或者包含与SEQIDN0:1 的残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174、 I- 182、1-184、1-224或1-274具有至少90 %同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所 述DRS多肽长度为约130-200个氨基酸，且包含SEQIDN0:1的氨基酸残基1-154、11-146、 13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184,或者包含与SEQIDN0:1 的残基 1-154、 II- 146、13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184 具有至少 90% 同一性的氨基酸序列。 在某些实施方案中，所述DRS多肽长度为约130-175个氨基酸，且包含SEQIDNO: 1的氨 基酸残基1-154、23-154、1-171或1-174，或者包含与5￡0 1〇勵：1的残基1-154、23-154、 1-171或1-174具有至少90%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述DRS多肽包 含SEQIDNO: 1 的氨基酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174。在特定的实 施方案中，所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的氨基酸残基1-154组成。在一些实施方 案中，所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的氨基酸残基13-146组成。在具体的实施方案 中，所述DRS多肽包含0B折叠结构域、N-末端两亲性螺旋或两者。
[0026] 在一些实施方案中，所述Fc区和DRS多肽被肽连接子隔开。在某些实施方案中， 所述肽连接子长度为约1-200个氨基酸、约1-150个氨基酸、约1-100个氨基酸、约1-90个 氨基酸、约1-80个氨基酸、约1-70个氨基酸、约1-60个氨基酸、约1-50个氨基酸、约1-40 个氨基酸、约1-30个氨基酸、约1-20个氨基酸、约1-10个氨基酸或约1-5个氨基酸。在具 体的实施方案中，肽连接子长度为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽连接子 由或基本上由Gly和/或Ser残基组成。在一些实施方案中，所述肽连接子为生理学上稳 定的连接子。在其他实施方案中，所述肽连接子为可释放的连接子，任选地为可酶切的连接 子。在特定的实施方案中，所述肽连接子包含SEQIDN0:80-139中任一序列。
[0027] 在一些实施方案中，所述Fc区融合至DRS多肽的C-末端。在某些实施方案中，所 述Fc区融合至DRS多肽的N-末端。
[0028] 在某些实施方案中，所述Fc区包含以下的一个或多个：来自哺乳动物IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 / 或IgM的铰链、CH2、CH3 和 / 或CH4 结构域。在具体的 实施方案中，所述DRS融合多肽不包含免疫球蛋白的CHpQ、'和VH区。在特定的实施方 案中，所述Fc区包含SEQIDN0: 38-64中任一序列或者其变体、片段或组合。
[0029] 在某些情况下，相对于相应的DRS多肽，所述DRS融合多肽具有改变的药代动力 学。所述改变的药代动力学的实例包括增加的血清半衰期、增加的生物利用度和/或降低 的清除率。在一些情况下，相对于相应的DRS多肽，所述DRS融合多肽具有改变的免疫效应 子活性。这类免疫效应子活性的实例包括以下一种或多种：补体活化、补体依赖性细胞毒 作用（CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用 (ADCP)。
[0030] 在某些实施方案中，相对于野生型Fc区，所述Fc区包含Fc区变体。在一些实施 方案中，所述Fc区变体包含与SEQIDN0:38-64中任一序列具有至少90%同一性的序列或 所述序列的组合。在某些实施方案中，所述Fc区变体包含来自不同物种、不同Ig类型或不 同Ig亚类的一个或多个Fc区的杂合体。在具体的实施方案中，所述Fc区变体包含来自不 同物种、不同Ig类型和/或不同Ig亚类的Fc区的一个或多个铰链、012、013和/或014结 构域的杂合体。
[0031] 在某些实施方案中，相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体为改性的糖型。在 具体的实施方案中，相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的药代动力学。这 类改变的药代动力学的实例包括血清半衰期、生物利用度和/或清除率。在一些实施方案 中，相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的效应子活性。这类效应子活性的 实例包括以下一种或多种：补体活化、补体依赖性细胞毒作用（CDC)、抗体依赖性细胞介导 的细胞毒作用（ADCC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP)。
[0032] 在某些实施方案中，相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有对一种或多种Fcy受体的改变的结合。示例性Fcy受体描述于本文中且为本领域已知。
[0033] 在一些实施方案中，相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的（例 如，增加的）溶解度；且相对于相应的未改性DRS多肽，DRS-Fc融合蛋白具有改变的溶解 度。
[0034] 在特定的实施方案中，所述DRS-Fc融合多肽在生理溶液中或在其他生理条件如 体内条件下基本上为二聚体形式。在特定的实施方案中，如通过UV圆二色谱分析所测定， 所述DRS-Fc融合多肽具有和相应未改性的或不同地改性的DRS多肽基本上相同的二级结 构。
[0035] 在一些实施方案中，当给予至哺乳动物时，所述DRS-Fc融合多肽具有的血浆或血 清药代动力学AUC谱为相应的未改性DRS多肽的至少5倍。
[0036] 在某些实施方案中，在基于TLR2或TLR4的分析中，所述DRS-Fc融合多肽具有 与相应未改性的或不同地改性的DRS多肽基本上相同的活性。
[0037] 在某些实施方案中，在基于TLR2或TLR4的分析中，所述DRS-Fc融合多肽具有 的活性大于相应未改性的或不同地改性的DRS多肽的2倍。
[0038] 在某些实施方案中，当于室温和类似条件下，在pH7. 4的PBS中进行7天的比较 时，所述DRS-Fc融合多肽具有的稳定性比相应未改性的或不同地改性的DRS多肽大至少 30%。
[0039] DRS-Fc融合多肽的特定实例包含SEQIDN0:36或37,或者与SEQIDN0:36或37 具有至少80%、90%、95%、98%同一性的氨基酸序列。
[0040] 在一个实施方案中，本发明包括给药方案，当采用的给药间隔为3天或更长时，其 将对象血浆中DRS多肽的平均稳态浓度维持在约0. 3yg/ml至约3yg/ml，所述方案包括将 治疗剂量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽给予至该患者。
[0041] 在一个实施方案中，本发明包括在有需要的对象中维持DRS多肽水平高于最低有 效治疗水平的方法，包括将治疗剂量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽给予至所述对象。
[0042] 在另一个方面，本发明包括治疗对象中的炎症反应的方法，包括将前述公开的本 文描述的任何DRS-Fc融合多肽给予至有需要的对象。
[0043] 在另一个方面，本发明包括治疗有需要的对象中TLR相关的疾病的方法，包括将 治疗剂量的本文描述的任何DRS-Fc融合多肽给予至所述对象。
[0044] 在另一个方面，本发明包括调节对象中的TLR活性的方法，包括将治疗剂量的本 文描述的任何DRS-Fc融合多肽给予至所述对象。
[0045] 在另一个方面，本发明包括杀死癌症细胞的方法，包括将包含本文描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
[0046] 在另一个方面，本发明包括治疗患癌对象或防止对象中癌症发展的方法，包括将 包含本文描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
[0047] 在另一个方面，本发明包括克服对象中对抗原的耐受性的方法，包括将包含本文 描述的任何DRS-Fc融合多肽的疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
[0048] 还包括分离的多核苷酸，其包含编码本文描述的DRS-Fc融合多肽的核苷酸序列， 包括包含这类多核苷酸的载体，以及包含所述多核苷酸和/或载体的宿主细胞。
[0049] -些实施方案包括制备本文描述的DRS融合多肽的方法，其包括a)培养宿主细胞 以表达DRS-Fc融合多肽，其中所述宿主细胞包含编码本文描述的DRS-Fc融合多肽的多核 苷酸，其任选地连接至调控元件；以及b)从所述宿主细胞中分离DRS-Fc融合多肽。
[0050] 发明详述
[0051] 除非另有相反的说明，本发明的实施可使用本【技术领域】的分子生物学和重 组DNA技术的常规方法，为说明的目的其中许多在下文有描述。这类技术在文献中 有充分的描述。参见，例如Sambrook，etal.，MolecularCloning:ALaboratory Manual(3rdEdition, 2000)；DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.) ；01igonucleotideSynthesis(N.Gait,ed. , 1984) ；01igonucleotide Synthesis:MethodsandApplications(P.Herdewijn,ed. , 2004)；NucleicAcid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds. , 1985)；NucleicAcidHybridization:Modern Applications(BuzdinandLukyanov,eds. , 2009)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds., 1984)；AnimalCellCulture(R.Freshney,ed., 1986)；Freshney,R.I. (2005)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique, 5thEd.HobokenNJ,Johnffiley&Sons；B.Perbal,APracticalGuidetoMolecular Cloning(3rdEdition2010) ；Farre11,R. ,RNAMethodologies:ALaboratory GuideforIsolationandCharacterization(3rdEdition2005).Poly(ethylene glycol),ChemistryandBiologicalApplications,ACS,Washington,1997 ；Veronese,F. ,andJ.M.Harris,Eds. ,PeptideandProteinPEGylation,AdvancedDrug DeliveryReviews, 54(4)453-609(2002) ；Zalipsky,S. ,etal. ,^Useoffunctionalized Poly(EthyleneGlycols)formodificationofpolypeptides"，PolyethyleneGlycol Chemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications。
[0052] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用方式整体并入本文。
[0053] 定义
[0054] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通 常所理解的相同的含义。尽管任何与本文描述的类似或等同的方法和材料均可用于实施或 测试本发明，本文描述了优选的方法和材料。为本发明的目的，对以下术语定义如下。
[0055] 本文所用冠词（"a/an"）是指一个或多于一个（即至少一个）该冠词的语法上的 宾语。举例来说，"成分"是指一种成分或多于一种成分。
[0056] "约"是指相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或 长度，变化达30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的数 量、水平、数值、数目、频率、百分比、容积、尺寸、量、重量或长度。
[0057] 如本文所用，术语"氨基酸"是指天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类 似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白质生物合成中所用的20种（L)-氨基酸和其他 氨基酸如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天 然存在的氨基酸包括，例如，（D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨基酪 酸等，其为本领域技术人员所知。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形 式。这类修饰可包括，例如，氨基酸上的化学基团和部分的取代或替换，或者通过氨基酸的 衍生化。氨基酸模拟物包括例如，表现出与参考氨基酸功能上类似的特性如电荷和电荷间 距（chargespacing)特性的有机结构。例如，模拟精氨酸（Arg或R)的有机结构具有的正 电荷部分（moiety)以类似的分子间距布置，，并具有与天然存在的Arg侧链的e-氨基相同 的迁移率。模拟物还包括受约束的结构，从而维持氨基酸或氨基酸功能基团的最佳间隔和 电荷相互作用。本领域技术人员知道或能够确定什么结构构成了功能上等同的氨基酸类似 物和氨基酸模拟物。
[0058] 在整个本申请文件中，除非上下文另有要求，词语"包含/包括（comprise/comprises/comprising) "应理解为是指包括所陈述的步骤或成分或者步骤或成分的组，但 不排除任何其他步骤或成分或者步骤或成分的组。"由…组成（consistingof)"是指包括 且限于词组"由…组成"后所列举的内容。因此，词组"由…组成"表示所列举的成分为必 需的或必要的，且不可以存在其他成分。"基本上由…组成（consistingessentiallyof)" 是指包括该词组后所列举的任何成分，并限于不干扰或促进本公开中明确的所列举成分的 活性或作用的其他成分。因此，词组"基本上由…组成"表示所列举的成分为必需的或必要 的，但其他成分是任选的，且根据其是否实质上影响所列举成分的活性或作用而可以存在 或不可以存在。
[0059] 术语"缀合物"是指由于将分子例如生物活性分子共价连接至免疫球蛋白Fc区而 形成的实体。缀合多肽的一个实例为"融合蛋白"或"融合多肽"，即通过将最初编码单独的 多肽的两个或更多个编码序列连接起来而形成的多肽；连接的编码序列翻译后产生单一的 融合多肽，其通常具有源自各单独的多肽的功能特性。
[0060] 词语"无内毒素"或"基本上无内毒素"通常是指组合物、溶剂和/或容器，其包含 至多微量（例如对于对象没有临床不良生理作用的量）的内毒素，优选为无法检测到的内 毒素量。内毒素是与某些细菌，通常为革兰氏阴性菌有关的毒素，尽管内毒素可发现于革兰 氏阳性菌，如单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes)。最普遍的内毒素是发现 于多种革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖（LPS)或脂寡糖（L0S)，其代表这些细菌导致疾病的 重要致病特性。人体中少量的内毒素可引起发烧、血压降低以及炎症和凝聚等的激活及其 他不良生理作用。
[0061] 因此，在药物生产中，通常最好是从药物产品和/或药物容器中去除大多数的或 所有微量的内毒素，因为即使少量也可在人体中引起不良作用。除热原烘箱可用于该目的， 因为通常需要超过300°C的温度来破坏大多数的内毒素。例如，基于初级包装材料如注射器 或小瓶，结合250°C的玻璃温度和30min的保持时间通常足以获得3个对数的内毒素水平减 少。本文包括其他去除内毒素的方法，包括例如,如本文所述和本领域已知的色谱法和过滤 法。还包括在真核细胞如哺乳动物细胞中产生DRS多肽并从其中分离出DRS多肽的方法， 以降低（如果没有消除）本发明的组合物中存在内毒素的风险。优选在无血清的细胞中产 生DRS多肽并从其中分离出DRS多肽的方法。
[0062] 可采用本领域已知的常规技术检测内毒素。例如，鲎变形细胞裂解物检测法（其 利用马蹄蟹（鲎）的血）是检测内毒素存在的非常灵敏的检测方法。在该检测中，由于有 力的酶促级联放大了该反应，很低水平的LPS可导致鲎裂解物的可检测凝聚。也可通过酶 联免疫法（ELISA)来定量内毒素。基本上无内毒素为，内毒素水平可小于约0.00U0. 005、 0? 01、0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06、0. 08、0. 09、0. 1、0. 5、1. 0、1. 5、2、2. 5、3、4、5、6、7、8、9 或 10EU/ml。通常，lng脂多糖（LPS)对应于约1-10EU。
[0063] 如本文所用，术语"功能"和"功能的（functional) "等是指生物学、酶学或治疗上 的功能。
[0064] "同源性"是指相同的或构成保守替换的氨基酸百分数。可使用序列比较程序如GAP(Deverauxetal.，NucleicAcidsResearch. 12, 387-395, 1984)测定同源性，其通过引 用并入本文。以这种方式，与本文所列举的序列长度类似或完全不同的序列，可通过将空位 插入至该比对中来进行比较，例如通过使用GAP的比较算法来确定这类空位。
[0065] "生理上稳定的"连接子是指在水中或在生理条件下（例如在体内、体外培养条件 下，例如在一种或多种蛋白酶存在下）基本上稳定的连接子，也就是说，在生理条件下其在 较长时期内不会经历任何可评估程度的降解反应（例如，可酶促降解的反应）。通常，生理 上稳定的连接子其在生理条件下表现的降解率小于每天约〇. 5 %、约1 %、约2 %、约3 %、约 4%或约5%。
[0066] "分离的"是指基本上或实质上与天然状态下通常伴随其的组分分开的材料。如本 文所用，例如，"分离的肽"或"分离的多肽"等，包括从其天然的细胞环境中，以及从结合的 其他细胞组分中，体外分离和/或纯化肽或多肽分子；即其不再结合有大量体内物质。
[0067] 术语"半最大有效浓度"或"EC5Q"是指本文描述的DRS-Fc缀合物的浓度，在该浓 度下在一些特定的暴露时间后其诱导基线和最大值间的一半反应；因此，分级剂量反应曲 线的EC5(I表示观察到其最大效果的50 %时的化合物浓度。在某些实施方案中，本文提供的 试剂的EC5(I相对于上文所述的"非经典的"活性表示。EC5(I还表示获得50%的体内最大效 果所需的血浆浓度。同样地，"EC9/表示观察到其最大效果的90%时的试剂或组合物浓度。 "EC9(I"可从"EC5(I"和Hill斜率计算，或者使用本领域常规知识从数据直接确定。在一些实 施方案中，DRS-Fc缀合物的EC5Q 小于约 0? 01、0. 05、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0?9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、 90或100nM。优选地，生物治疗性组合物具有的EC5(I值为约InM或更小。
[0068]DRS-Fc缀合物的"半衰期"可指相对于给予至生物体的血清或组织中时的该活性， 或者相对于任何其他限定的时间点，该缀合物失去其一半的药理学、生理学或其他活性所 用的时间。"半衰期"也可指相对于给予至生物体的血清或组织中时的该量或浓度，或者相 对于任何其他限定的时间点，DRS-Fc缀合物的量或浓度减少为最初给予至生物体的血清或 组织中的量的一半所用的时间。半衰期可在血清和/或任何一种或多种选定的组织中测 量。
[0069] 本文所用术语"连接（linkage) "、"连接子（linker) "、"连接部分（linker moiety) "或"L"是指可用于将DRS多肽与另一DRS多肽和/或与一个或多个Fc区隔开的 连接子。所述连接子可为生理上稳定的或者可包括可释放的连接子如可酶促降解的连接子 (例如可蛋白切割的连接子）。在某些方面，所述连接子可为肽连接子，例如作为DRS-Fc融 合蛋白的一部分。在一些方面，所述连接子可为非肽连接子。
[0070] 术语"调节"和"改变"包括通常为相对于对照的统计意义上或生理学意义上的量 或程度的"增加"、"促进"或"刺激"，以及"减少"或"降低"，通常为相对于对照统计上显著的 或生理上显著的量或度。"增加"、"刺激"或"促进"的量通常为"统计上显著的"量，且可包 括增加为没有组合物（例如，无任何本发明的DRS-FC缀合物）时或对照组合物、样品或测 试对象所产生的量的1. 1、1. 2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍（例如，500、1000 倍）（包括其间的且大于1的所有整数和小数部分，例如，1. 5、1. 6、1. 7、1. 8等）。"减少"或 "降低"的量通常为"统计上显著的"量，且可包括没有组合物（无试剂或化合物）时或对照 组合物产生的量的 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、 15 %U6 %U7 %U8 %U9 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %, 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括其间的所有整数）的减少。作为一个非限 制性实例，比较经典和非经典活性中的对照可包括相比相应的（按序列）未改性的、或不同 地改性的DRS多肽的目标DRS-Fc缀合物。本文描述了比较和"统计上显著的"量的其他实 例。
[0071] 如本文所用，"非经典的"活性通常指：i)本发明的DRS多肽具有的新活性，其为完 整的天然全长亲本蛋白在任何明显的程度上所不具有的，或者ii)完整的天然全长亲本蛋 白所具有的活性，其中相比完整的天然全长亲本蛋白，针对非经典的活性，所述DRS多肽表 现出明显更高（即至少大20% )的特定活性，或者在新环境中表现出该活性；例如，通过将 该活性与完整的天然全长亲本蛋白具有的其他活性分开。在DRS多肽的情况下，非经典的 活性的非限制性实例包括胞外信号转导，包括调节TLR、调节细胞增殖、调节细胞迁移、调节 细胞分化（例如，血细胞生成、神经细胞生成、肌细胞生成、骨细胞生成和脂肪细胞生成）、 调节基因转录、调节细胞凋亡或其他形式的细胞死亡、调节细胞信号转导、调节细胞摄取或 分泌、调节血管生成、调节细胞结合、调节细胞代谢、调节细胞因子产生或活性、调节细胞因 子受体活性、调节炎症和免疫原性等。
[0072] 在某些实施方案中，组合物中任何给定试剂（例如，DRS-Fc缀合物如融合蛋白）的 "纯度"可具体限定。例如，某些组合物包含的试剂的纯度可为至少80%、85%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，包括其间的所有小数，如通过例如 但不限于高压液相色谱（HPLC)(其为生物化学和分析化学中经常使用的用于分离、鉴定和 定量化合物的柱层析的一种熟知的形式）所测定的。
[0073] 不希望受限于任何具体理论，"可酶促降解的连接子"是指可被一种或多种酶如肽 酶或蛋白酶降解的连接子，例如氨基酸序列。
[0074] 术语"多肽"和"蛋白"在本文中可互换使用，指氨基酸残基聚合物及其变体和合 成的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨 基酸的氨基酸聚合物如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚 合物。
[0075]"可释放的连接子"包括但不限于，生理上可切割的连接子和可酶促降解的连接 子。因此，"可释放的连接子"是在生理条件下可进行自发水解或通过一些其他机制切割（例 如，酶催化的切割、酸催化的切割、碱催化的切割等）的连接子。例如，"可释放的连接子"可 包括具有碱性移去质子（例如，可电离的氢原子，Ha)作为驱动力的消除反应。为本文的目 的，"可释放的连接子"与"可降解的连接子"同义。在具体的实施方案中，可释放的连接子 于pH7. 4、25°C，例如生理pH、人体温度（例如在体内）的半衰期为约30min、约lh、约2h、 约3h、约4h、约5h、约6h、约12h、约18h、约24h、约36h、约48h、约72h、或约96h或更多。
[0076]"统计上显著的"是指该结果不可能随机出现。可通过本领域任何已知的方法确定 统计显著性。通常使用的显著性测量包括P-值，如果零假设为正确的，其为观察的事件会 发生的频率或可能性。如果获得的P-值小于该显著性水平，那么该零假设被拒绝。在简单 的情况下，该显著性水平限定在P-值为〇. 05或更小。
[0077] 术语"溶解度"是指本文提供的DRS-Fc缀合多肽溶解于液体溶剂中形成均匀溶液 的特性。溶解度通常表示为浓度，通过每单位体积的溶剂中的溶质质量（g溶质/kg溶剂、g/dL(100mL)、mg/ml等）、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或浓度的其他类似描述。每量的 溶剂能够溶解的溶质的最大平衡量，是特定条件（包括温度、压力、pH和溶剂的特性）下该 溶质在该溶剂中的溶解度。在某些实施方案中，在生理pH或其他pH下测量溶解度，例如pH 5. 0、pH6.0、pH7.0或pH7. 4。在某些实施方案中，在水或生理缓冲液如PBS或NaCl(有 或没有NaP)中测量溶解度。在特定的实施方案中，在相对较低的pH(例如，pH6.0)和相 对较高的盐（例如，500mMNaCl和10mMNaP)下测量溶解度。在某些实施方案中，在生物 流体（溶剂）如血液或血清中测量溶解度。在某些实施方案中，所述温度可为约室温（例 如，约20、21、22、23、24、25°C)或约体温（37°C)。在某些实施方案中，DRS-Fc缀合多肽在 室温或 37°C具有的溶解度为至少约 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1、2、3、4、5、 6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25 或 30mg/ml。
[0078] 如本文所用，"对象"包括任何表现有症状或有表现症状风险的动物，该症状可用 本发明的DRS-Fc缀合多肽治疗或诊断。合适的对象（患者）包括实验动物（如小鼠、大鼠、 兔或豚鼠）、农场动物和家养动物或宠物（如猫或狗）。包括非人的灵长类，以及优选地，人 患者。
[0079]"基本上"或"实质上"是指几乎整个或全部地，例如，95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或更多的某给定量。
[0080] 如本文所用，术语"治疗有效量"是指治疗或改善病症或减少伤害或损伤而不引起 明显负面效果或不利副作用所需的试剂如DRS-Fc缀合多肽或其衍生物的水平或量。
[0081] 如本文所用，"治疗（Treatment/treating) "包括对于疾病或病症的症状或病理的 任何所需的效果，且可包括接受治疗的疾病或病症的一种或多种可测量标记的甚至最小的 变化或改善。"治疗（Treatment/treating)"不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其 相关症状。接受该治疗的对象是任何有需要的对象。临床改善的示例性标记对本领域技术 人员来说是显而易见的。
[0082] 天冬氨酰-tRNA合成酶衍生的多肽
[0083] 本发明的实施方案涉及天冬氨酰-tRNA合成酶多肽（DRS或AspRS多肽）的应 用，包括野生型序列、天然存在的序列和非天然存在的序列，还包括其变体和片段。天冬氨 酰-tRNA合成酶衍生的多肽的特定实例包括具有改变的半胱氨酸含量的那些。
[0084] 天冬氨酰-tRNA合成酶属于I型tRNA合成酶家族，其在活性位点具有两个高度保 守序列基序HIGH(SEQIDN0:152)和KMSKS(SEQIDN0:153)。I型tRNA合成酶普遍被认 为在2-步骤反应中负责氨基酸特异性结合至其同源tRNA:首先由ATP活化氨基酸（AA)以 形成AA-AMP，然后转移至tRNA的受体末端。全长天冬氨酰-tRNA合成酶通常存在为同源二 聚体；并且还形成多亚基复合体的部分，该复合体通常包括蛋白AMP1、AMP2、EEF1A1以及Arg、Asp、Glu、Gin、lie、Leu、Lys、Met和Pro的tRNA合成酶。
[0085] 最近已经证明，真核生物天冬氨酰-tRNA合成酶的某些生物片段或者替代性地剪 接的同种型，或在某些情况下完整的合成酶，能够从该多亚基复合体分离，并激活某些细胞 信号转导通路，或在细胞核中起作用以调节转录。这些不同于蛋白合成中tRNA合成酶的经 典作用的活性，在本文总称为"非经典的活性"。这些DRS多肽可通过替代性剪切或蛋白水 解而天然产生，且能够以细胞自发性（即在宿主细胞内）或者非细胞自发性方式（即在宿 主细胞外）发挥作用，以调节各种自我平衡机制。例如，如本发明所提供的，天冬氨酰-tRNA合成酶的N-末端片段DRS(1-154)能够调节体内某些TLR的活性。而且，相对于全长DRS多肽序列的某些突变和缺失赋予了增加的TLR结合或其他非经典的活性。各种示例性DRS多肽的序列提供于表D1-D5和D7中。
[0086]

【权利要求】
1. 天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)融合多肽，其包含与SEQID勵:1、3-24、29、31或 154-197中任一序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和融合至所述DRS多肽的C-末 端、N-末端或两端的至少一个Fc区。
2. 根据权利要求1所述的DRS融合多肽，其包含与SEQID勵：1、3-24、29、31或 154-197中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的DRS融合多肽，其包含SEQIDNO: 1或3-24中任一序列的氨 基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽为约130-300个氨基酸的 长度，且包含SEQIDN0:1 的氨基酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171或1-174、 1-182、1-184、1-224 或 1-274,或者与SEQIDN0:1 的残基 1-154、23-154、1-171、或1-174、 1-182、1-184、1-224或1-274具有至少90%同一性的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽为约130-200个氨基酸的长 度，且包含SEQIDN0:1 的氨基酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184,或者与残基 1-154、23-154、1-171、1-174、1-182 或 1-184 具有至少 90% 同一性的 氨基酸序列。
6. 根据权利要求1所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽为约130-175个氨基酸的 长度，且包含SEQIDNO: 1 的氨基酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174,或 者与SEQIDN0:1的残基1-154、23-154、1-171或1-174具有至少90%同一性的氨基酸序 列。
7. 根据权利要求6所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽包含SEQIDNO: 1的氨基 酸残基 1-154、11-146、13-146、23-154、1-171 或 1-174。
8. 根据权利要求7所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的 氨基酸残基1-154组成。
9. 根据权利要求7所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽基本上由SEQIDNO: 1的 氨基酸残基13-146组成。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述DRS多肽包含至少一 个半胱氨酸残基突变，所述半胱氨酸残基选自Cys76、Cysl30、Cys203、Cys259、Cys334和Cys349〇
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区和所述DRS多肽 被肽连接子隔开。
12. 根据权利要求11所述的DRS融合多肽，其中所述肽连接子为约1-200个氨基酸、 1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨 基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸或1-5 个氨基酸的长度。
13. 根据权利要求11所述的DRS融合多肽，其中所述肽连接子为约1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90 或 100 个氨基酸的长 度。
14. 枏掘叔刹要龙n-n中仵一顶所沭的DRS融合名肽，中所沭肽连捽子某本卜由 Gly和/或Ser残基组成。
15. 根据权利要求11-13中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述肽连接子为生理学上 稳定的连接子。
16. 根据权利要求11-13中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述肽连接子为可释放的 连接子，任选地为可酶切的连接子。
17. 根据权利要求11-16中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述肽连接子包含SEQID N0:80-139中任一序列。
18. 根据权利要求1-17中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区融合至所述DRS多肽的C-末端。
19. 根据权利要求1-17中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区融合至所述DRS多肽的N-末端。
20. 根据权利要求1-19中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区包含一个或多个 来自哺乳动物IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 / 或IgM的铰链、CH2、CH3 和 /或014结构域。
21. 根据权利要求1-20中任一项所述的DRS融合多肽，其不包含免疫球蛋白的CHpQ、 八和VH区。
22. 根据权利要求1-21中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区包含SEQID NO:38-64中任一序列或其变体、片段或组合。
23. 根据权利要求1-22中任一项所述的DRS融合多肽，相对于相应的DRS多肽，其具有 改变的药代动力学。
24. 根据权利要求23所述的DRS融合多肽，其中所述改变的药代动力学为增加的血清 半衰期、增加的生物利用度和/或降低的清除率。
25. 根据权利要求1-22中任一项所述的DRS融合多肽，相对于相应的DRS多肽，其具有 改变的免疫效应子活性。
26. 根据权利要求23所述的DRS融合多肽，其中所述免疫效应子活性为下述一种或多 种：补体活化、补体依赖性细胞毒作用（CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC)或 抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP)。
27. 根据权利要求1-26中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于野生型Fc区，所述Fc区包含Fc区变体。
28. 根据权利要求27所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区变体包含与SEQID NO: 38-64中任一序列具有至少90%同一性的序列或所述序列的组合。
29. 根据权利要求27或28所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区变体包含来自不同物 种、不同Ig类型或不同Ig亚类的一个或多个Fc区的杂合体。
30. 根据权利要求27-29中任一项所述的DRS融合多肽，其中所述Fc区变体包含来自 不同物种、不同Ig类型和/或不同Ig亚类的Fc区的一个或多个铰链、CH2、CH3和/或CH4结构域的杂合体。
31. 根据权利要求27-30中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体为改性的糖型。
32. 根据权利要求27-31中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于相应的野生型Fc 区，所述Fc区变体具有改变的药代动力学。
33. 根据权利要求32所述的DRS融合多肽，其中所述改变的药代动力学包括血清半衰 期、生物利用度和/或清除率。
34. 根据权利要求27-33中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的效应子活性。
35. 根据权利要求34所述的DRS融合多肽，其中所述效应子活性为下述一种或多种：补体活化、补体依赖性细胞毒作用（CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC)或抗 体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP)。
36. 根据权利要求27-35中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有针对一个或多个FcY受体的改变的结合。
37. 根据权利要求27-36中任一项所述的DRS融合多肽，其中相对于相应的野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的溶解度。
38. 根据权利要求1-37中任一项所述的DRS融合多肽，其在生理溶液中基本上为二聚 体形式。
39. 根据权利要求1-38中任一项所述的DRS融合多肽，如通过UV圆二色谱分析所测 定，其具有与相应的未改性DRS多肽基本上相同的二级结构。
40. 根据权利要求1-39中任一项所述的DRS融合多肽，当给予至哺乳动物时，其具有的 血浆或血清药代动力学AUC谱为相应的未改性DRS多肽的至少5倍。
41. 天冬氨酰-tRNA合成酶（DRS)-Fc融合多肽，其包含与SEQIDNO:36或37具有至 少80%同一性的氨基酸序列。
42. 给药方案，当采用的给药间隔为3天或更长时，其将对象血浆中DRS融合多肽的平 均稳态浓度维持在约0. 3yg/ml至约3yg/ml，所述方案包括将治疗剂量的权利要求1-41 中任一项所述的DRS融合多肽给予至患者。
43. 在有需要的对象中维持DRS多肽水平高于最低有效治疗水平的方法，包括将治疗 剂量的权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽给予至所述对象。
44. 治疗对象中的炎症反应的方法，包括将治疗剂量的权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽给予至有需要的对象。
45. 治疗有需要的对象中的TLR相关疾病的方法，包括将治疗剂量的权利要求1-41中 任一项所述的DRS融合多肽给予至有需要的对象。
46. 调节对象中的TLR活性的方法，包括将治疗剂量的权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽给予至有需要的对象。
47. 杀死癌症细胞的方法，包括将包含权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽的 疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
48. 治疗患癌对象或防止对象中癌症发展的方法，包括将包含权利要求1-41中任一项 所述的DRS融合多肽的疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
49. 克服对象中对抗原的耐受性的方法，包括将包含权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽的疫苗或免疫原性组合物给予至有需要的对象。
50. 药物组合物，其包含权利要求1-41任一项中所述的DRS融合多肽以及药学上可接 受的载体或赋形剂。
51. 根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述组合物包含约lOnM至约lOOnM精氨 酸。
52. 分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽的核苷 酸序列。
53. 载体，其包含权利要求52所述的分离的多核苷酸。
54. 宿主细胞，其包含权利要求53所述的载体。
55. 制备权利要求1-41中任一项所述的DRS融合多肽的方法，包括 a) 培养宿主细胞以表达DRS融合多肽，其中所述宿主细胞包含权利要求49所述的多核 苷酸，其可操作地连接至调控元件；以及 b) 从所述宿主细胞中分离所述DRS融合多肽。
【文档编号】A61K38/16GK104220461SQ201280069923
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】纪英, 吴其芳, 赖安·A·亚当斯, 杰弗里·D·沃特金斯, 约翰·D·门德莱恩 申请人:Atyr医药公司