结合肽聚糖识别蛋白1的抗体的制作方法
【专利摘要】本文所公开的是用于鉴定TREM-1的配体和抗体或其片段的方法，其能够修饰TREM-1的配体的功能。使用此方法可以鉴定和选择降低或阻断TREM-1活化的抗体。结合TREM-1的配体并降低TREM-1活性的抗体可以适合用作药物。
【专利说明】结合肽聚糖识别蛋白1的抗体 发明领域
[0001] 本发明涉及免疫学领域。更具体地，本发明涉及用于鉴定能够刺激髓样细胞上表 达的触发受体（TREM-1)的配体的方法，以及结合TREM-1的配体的抗体。这些抗体能够调 节髓样细胞活化和因此调节免疫应答。
[0002] 背景 肽聚糖识别蛋白1 (另外称为PGLYRP1、PGRP-S、TNFSF3L、PGRP、TAG7和PGRPS)在嗜 中性粒细胞中表达并在它们活化后释放。PGLYRP1在患病组织中高度丰富，并且已显示在 通过先天免疫系统的细菌感染的清除中起重要作用。PGLYRP蛋白家族（PGLYRPUPGLYRP2、 PGLYRP3、PGLYRP4)均与细菌肽聚糖（PGN)相互作用，但在蛋白的PGN结合位点中有重要区 另ij。PGLYRP1具有附加的沟，假定其构成未知效应物或信号传导蛋白的结合位点（J. Mol. Biol. 347:683-691 (2005))。PGLYRP1是高度保守的、196个氨基酸长度的蛋白，由信号肽 和肽聚糖结合域组成。
[0003] 为了理解并由此操纵此蛋白在各种感染性和炎性疾病中的功能，鉴定由PGLYRP1 介导的信号传导机制是重要的。
[0004] TREM-1在免疫调节中同样地具有充分描述的效果，但是迄今为止，尚未了解导致 TREM-1介导的免疫功能的机制。TREM-1是在髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒 细胞上表达的受体。其是由234个氨基酸组成的跨膜蛋白，包括单个细胞外免疫球蛋白结 构域和短的胞质尾。TREM-1不具有明显的信号传导基序，但是，当被活化时，形成二聚体/ 多聚体，并通过与含ITAM的信号接头蛋白DAP12相关联介导信号传导。下游信号传导可包 括Syk和Zap70的磷酸化。下游信号传导可包括NFAT、ELK、NK-kB转录因子的活化。当 TREM-1被活化时，其触发促炎性细胞因子，如TNF -a (TNF-a)、IL_8和单核细胞趋化蛋 白-1从髓样细胞中的释放。
[0005] TREM-1在患有败血症、类风湿关节炎（RA)和炎性肠病（IBD)的患者中上调，并且 越来越多的证据支持该理论认为TREM-1有助于炎性疾病的发生和进展。TREM-1信号传导 的阻断已进一步在RA和IBD的体内小鼠模型中显示具有治疗活性。
[0006] TREM-1活化的作用方式仍然很难以捉摸，因为活化TREM-1的配体不是本领域中 已知的。因此，在本领域中，存在对鉴定TREM-1的配体的手段的需求。在本领域中对于鉴 定能够降低、阻断、或者干扰TREM-1与其配体的相互作用分子(如抗体）的方法存在需求。 在本领域中对于能够结合TREM-1的配体，并从而降低、阻断，或干扰TREM-1被其配体的刺 激的分子，如抗体存在需求。在本领域中对于能够结合TREM-1的配体的分子，如抗体存在 需求。在本领域中对于能够结合TREM-1的配体并从而阻断TREM-1的活化和信号传导的分 子，如抗体存在需求。在本领域中对于能够结合TREM-1的配体，并从而降低或阻断从表达 TREM-1的髓样细胞的细胞因子释放的分子，如抗体存在需求。
[0007] 本文所公开的是用于鉴定TREM-1的配体以及能够结合TREM-1的配体的分子如抗 体的方法和测定法。本文描述的是，能够影响TREM-1活化的抗体。因此，本文所公开的抗 体适于用作药物。结合TREM-1的配体，并且降低或阻断TREM-1与其配体相互作用的抗体 对于患有慢性炎性疾病如类风湿性关节炎、银屑病关节炎和炎症性肠疾病的个体的生活质 量可以具有实质性的影响。
[0008] 概述 本发明涉及用于鉴定TREM-1的配体和结合TREM-1的配体的分子如抗体(本文中鉴定 为PGLYRP1)的方法。本发明还涉及可通过本发明的方法鉴定PGLYRP1抗体。因此，本发明 涉及PGLYRP1抗体，其能够通过PGLYRP1修饰TREM-1的活化，诸如能够通过PGLYRP1降低 TREM-1活性(信号传导和/或活化)的PGLYRP1抗体。降低TREM-1的活性的抗体可用于炎 症治疗。
[0009] 用于鉴定TREM-1的配体的方法，其包括：（a)培养表达TREM-1、TREM-1的信号 传导蛋白和报道基因构建体的细胞，所述报道基因构建体被所述信号蛋白活化；（b)当它 与细胞、化合物或流体，例如生物流体或组织接触时(其触发TREM-1的活化)，对所述表达 TREM-1的细胞的活性进行检测，优选定量；（c)使（b)的培养物与TREM-1活化组分接触； (d)分离结合TREM-1的组分以及（e)表征所分离的组分。TREM-1的配体，通过本发明鉴定 为PGLYRP1，可用于修饰TREM-1的活性。
[0010] 用于鉴定特异性结合PGLYRP1并且修饰TREM-1介导的细胞活性的分子的方法，其 包括：（a)根据实施方案1-18中任一项培养细胞；（b)当它与PGLYRP1和任选地，多聚化试 剂如PGN接触时，对表达TREM-1的所述细胞的活性进行检测，优选定量；（c)将（b)的培养 物与特异性结合PGLYRP1的分子接触；并且（d)检测，优选定量表达TREM-1的所述细胞的 活性小于或大于如（b)中测量的它的活性。
[0011] 用于鉴定修饰TREM-1介导的细胞活性的PGLYRP1抗体的方法，其包括：（a)培养 表达TREM-1、TREM-1的信号传导蛋白和由所述信号传导蛋白活化的报道基因构建体的细 胞；（b)当它与PGLYRP1和任选地，组合多聚化试剂如PGN接触时，对表达TREM-1的所述细 胞的活性进行检测，优选定量；（c)将（b)的培养物与结合PGLYRP1的抗体接触；并且（d)检 测，优选定量表达TREM-1的所述细胞的活性小于或大于如（b)中测量的它的活性。
[0012] 鉴定降低TREM-1介导的细胞活性的PGLYRP1抗体的一种方法，其包括：（a)培养 细胞，例如表达TREM-1、信号传导蛋白例如DAP12和报道基因例如荧光素酶或β -半乳糖 苷酶的Τ细胞；（b)将所述细胞与活化的嗜中性粒细胞和任选地，组合多聚化试剂例如PGN 一起孵育；（c)检测，优选定量所述细胞的发光；（d)将所述细胞和活化的嗜中性粒细胞的 培养物与PGLYRP1抗体接触；以及（e)检测，优选定量所述细胞的发光少于（c)中测量的活 性。
[0013] 附图简述 图1显示嗜中性粒细胞活化BWZ-TREM-1报道基因细胞系。BWZ报道基因细胞系表达 人TREM-1并介导NFAT-连接的β -半乳糖苷酶报道基因的活化，其可以使用来自Promega， Denmark的Beta-Glo测定系统试剂盒通过发光定量。该图显示当在含有TNF-α、IL-6、 IFN- γ 和 GM-CSF 或 Toll 样受体（TLR)活化"混合物（cocktails) "（TLRL 和 TLR2 混合物， tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Denmark)的细胞因子混合物的存在下，以及 这些活化混合物的分开的组分的存在下与嗜中性粒细胞一起培养时，报道基因细胞系的活 化。
[0014] 图2显示用TREM-1四聚体重组蛋白的PGN刺激的嗜中性粒细胞的流式细胞染色。 对照蛋白不结合（图2A)，而TREM-1四聚体（SEQ ID NO: 2)结合PGN-活化的嗜中性粒细 胞的亚群（图2B)，并且这可以被另一种TREM-1蛋白竞争（图2D)，但不被对照蛋白竞争（图 2C)，证实了相互作用的特异性。
[0015] 图3 :用TREM-1通过免疫沉淀（IP)/质谱（MS)鉴定PGLYRP1。可溶性TREM-Fc与 PGN-活化的嗜中性粒细胞一起孵育，交联，免疫沉淀，随后进行清洗，胰蛋白酶消化和质谱。 TREM-1结合蛋白的免疫沉淀得到3个特异性蛋白，73个蛋白与对照蛋白重叠，并且72个被 对照蛋白单独沉淀(背景)。表显示了 TREM-1特异性免疫沉淀和后续质谱的结果。
[0016] 图4显示可溶性TREM-1结合PGLYRP1。通过用TREM-1在表达重组PGLYRP1的 HEK293转染子上流式细胞染色（图4A)和通过PGLYRP1和TREM-1四聚体（SEQ ID N0: 2) 之间的相互作用的Biacore和ForteBio分析显示。在存在或不存在10 Pg/ml的可溶性大 肠杆菌肽聚糖（PGN)的情况下可溶性人PGLYRP1结合固定化人TREM-1 (图4B)。PGN本身 也结合固定化的人PGLYRP1(图4C)，并且在PGLYRP1表面暴露于和被PGN结合之前和之后， 可溶性人TREN-1结合固定化的PGLYRP1 (图4D)。
[0017] 图5显示TREM-1报道基因细胞系被重组PGLYRP1活化。TREM-1报道基因细胞系 用重组 PGLYRP1 (目录号 2590-PG-050 R&D Systems Minneapolois MN, USA)的刺激，以 及内部（in-house)生成的PGLYRP1 (SEQ ID NO: 1)在PGN的存在下导致剂量依赖性的应 答（图5A)。此PGLYRP1诱导的应答可以被TREM-1-Fc融合蛋白特异性阻断（图5B)验证了 TREM-1特异性信号。
[0018] 图6显示单克隆抗-PGLYRP1抗体可以阻断在报道基因测定中用PGN-活化的嗜 中性粒细胞刺激的TREM-1应答。抗体杂交瘤克隆上清液的实例在多个板中筛选它们阻 断活化信号的能力。少数抗体(那些在虚线下的抗体，例如F10、F95)能够阻断此信号。黑 点表示每个板中的同种型对照（图6A)。图6B显示来自另一个融合体的测试引起2个额 外的阻断PGLYRP1抗体M-hPGRPS-2F5和-2F7。商购可得的抗-PGLYRP1 mAb的测试显示 它们不能阻断此信号，即使在高剂量，而多克隆的商购可得的PGLYRP1 pAb (AF2590，R&D Systems Minneapolois MN, USA)可以。图6C显不来自 Thermo Scientific 的商购可得的抗 PGLYRP1 mAb 188C424(Thermo Scientific, Waltham MA, USA)与同种型对照（MAB002)和 多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比较。图6D显示商购可得的抗PGLYRP1 mAb 4H230(US Biological, Salem MA, USA)与同种型对照（MAB002)和多克隆抗 PGLYRPlpAb (AF2590) 的比较。图 6E 显示商购可得的抗 PGLYRP1 mAb 9A319(US Biological, Salem MA, USA) 与同种型对照（MAB002)和多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比较，图6F显示商购可得的 抗PGLYRP1 mAb 6D653 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA)与同种型对照 (MAB002)和多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比较。对于SC 6D653 mAb所见的活性轻微 下降似乎由于含叠氮化物的制剂，因为用1 ug/ml板结合的抗TREM-1 mAb触发TREM-1的 PGLYRP1独立的信号显示相同的现象（图6G)。
[0019] 图7显示在人RA滑液中存在的TREM-1配体能够刺激TREM-1。
[0020] 图 7 显示板结合的对抗抗 TREM-1 mAb (R&D MAB1278, Minneapolis, MN, USA) 刺激TREM-1 (星号)并且已向其中添加 PGN的RA滑液（SF)样品显示hTREM-1配体活性，其 可以被PGLYRP1多克隆抗体（AF2590)中和，表明TREM-1活性是PGLYRP1依赖性的。
[0021] 图8显示II型PGLYPR1构建体的总体结构。1C表示细胞内结构域，TM是跨膜结 构域-其两者源自MDL-1蛋白序列，组合hPGLYRPl的EC (细胞外）结构域。
[0022] 序列简述 SEQ ID NO: 1表示成熟、全长hPGLYRPl肽序列的氨基酸序列。
[0023] SEQ ID N0: 2表示包含下列元件的重组蛋白序列：人TREM-1 E⑶、接头肽、人 TREM-1 ECD、具有 7 个不同于野生型的突变（L15A、L16E、G18A、A111S、P112S、D137E、L139M) 的人同种异型IgGl Fc。
[0024] SEQ ID NO: 3 表示具有 5 个不同于野生型的突变：L15A、L16E、G18A、A111S、P112S 的人同种异型IgGl Fc。
[0025] SEQ ID NO: 4表示从N至C末端包含下列元件的重组蛋白序列：6xHIS标签、两个 拷贝的链霉抗生物素蛋白结合蛋白结构域（SBP)、GS接头、软骨寡聚蛋白C末端（C0MP)、GS 接头、hDCIR-ECD。
[0026] SEQ ID NO: 5表示包含下列元件的重组蛋白序列：hTREM-l-E⑶、GS接头、软骨寡 聚蛋白C末端（C0MP)、GS接头、两个拷贝的链霉抗生物素蛋白结合蛋白结构域（SBP)、6xHIS 标签。
[0027] SEQ ID N0: 6表示从N至C末端的顺序包含下列元件的重组蛋白序列：人⑶83 E⑶、G4Sx3接头肽、人⑶83 E⑶、人同种异型IgGl Fc突变体。
[0028] SEQ ID勵:7表示具有(：末端6?1信号序列的全长人？61^1^1编码〇0嫩序列。 经由EcoRl和Xhol限制性位点将此序列克隆入pcDNA3. lzeo(+) (Invitrogen: V860-20, Carlsbad, CA, USA)〇
[0029] SEQ ID NO: 8 表示成熟全长 hTREM-1 ECD (aa. 21-200)。
[0030] SEQ ID N0:9表示被G4Sx3接头分开的CD33前导肽串联hTREM-1细胞外结构域 的cDNA。合成cDNA具有5' EcoRl限制性位点、GCCACC Kozak序列CD33前导序列随后是 人TREM-1的细胞外结构域（aal7-200)，具有相互间隔的ΚρηΙ限制性位点和重复3次的甘 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸间隔序列（G4Sx3)随后是人TREM-1的细胞外结构域的额 外拷贝（aal7_200)和Apal位点以允许克隆。
[0031] SEQIDN0:10表示五聚体hTREM-C0MP-SBP38x2-6HIS。EcoRl位点和Kozak是0RF 的5'并且BamHl位点是0RF的3'。
[0032] SEQ ID N0:11 表示用 EcoRl 和 Apal 克隆入 pJSV002-hFc6mut 载体的 hCD83 四聚 体。EcoRl位点和Kozak是0RF的5'并且Apal位点是0RF的3'。
[0033] SEQIDN0:12表示五聚体6HIS-SBP38x2-C0MP-hDCIR。EcoRl位点和Kozak是0RF 的5'并且BamHl是0RF的3'。
[0034] SEQIDN0:13表示单克隆PGLYRPl抗体（lF36，mAb0182)的可变重链的核酸序 列。
[0035] SEQIDN0:14表示单克隆PGLYRPl抗体（lF36，mAb0182)的可变轻链的核酸序 列。
[0036] SEQIDN0:15表示单克隆PGLYRPl抗体（lF36，mAb0182)的可变重链的氨基酸 序列。
[0037] SEQIDN0:16表示单克隆PGLYRPl抗体（lF36，mAb0182)的可变轻链的氨基酸 序列。
[0038] SEQ ID NO: 17表示单克隆PGLYRP1抗体（1F10)的可变重链的核酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 18表示单克隆PGLYRP1抗体（1F10)的可变轻链的核酸序列。
[0040] SEQ ID N0:19表示单克隆PGLYRP1抗体（1F10)的可变重链的氨基酸序列。
[0041] SEQ ID N0:20表示单克隆PGLYRP1抗体（1F10)的可变轻链的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID N0:21表示单克隆PGLYRP1抗体（1F105, mAb 0184)的可变重链的核酸 序列。
[0043] SEQIDN0:22表示单克隆PGLYRPl抗体（lF105，mAb0184)的可变轻链的核酸 序列。
[0044] SEQIDN0:23表示单克隆PGLYRPl抗体（lF105，mAb0184)的可变重链的氨基 酸序列。
[0045] SEQIDN0:24表示单克隆PGLYRPl抗体（lF105，mAb0184)的可变轻链的氨基 酸序列。
[0046] SEQ ID N0:25表示单克隆PGLYRP1抗体（1F95)的可变重链的核酸序列。
[0047] SEQ ID N0:26表示单克隆PGLYRP1抗体（1F95)的可变轻链的核酸序列。
[0048] SEQ ID N0:27表示单克隆PGLYRP1抗体（1F95)的可变重链的氨基酸序列。
[0049] SEQ ID N0:28表示单克隆PGLYRP1抗体（1F95)的可变轻链的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID N0:29表示单克隆PGLYRP1抗体（2F5)的可变重链的核酸序列。
[0051] SEQ ID N0:30表示单克隆PGLYRP1抗体（2F5)的可变轻链的核酸序列。
[0052] SEQ ID N0:31表示单克隆PGLYRP1抗体（2F5)的可变重链的氨基酸序列。
[0053] SEQ ID N0:32表示单克隆PGLYRP1抗体（2F5)的可变轻链的氨基酸序列。
[0054] SEQ ID N0:33表示单克隆PGLYRP1抗体（2F7)的可变重链的核酸序列。
[0055] SEQ ID N0:34表示单克隆PGLYRP1抗体（2F7)的可变轻链的核酸序列。
[0056] SEQ ID N0:35表示单克隆PGLYRP1抗体（2F7)的可变重链的氨基酸序列。
[0057] SEQ ID N0:36表示单克隆PGLYRP1抗体（2F7)的可变轻链的氨基酸序列。
[0058] SEQ ID N0:37 表示 II 型 1. 0 PGLYRP1 的氨基酸序列。
[0059] SEQ ID N0:38 表示 II 型 2. 0 PGLYRP1 的氨基酸序列。
[0060] SEQ ID N0:39表不表位标签的氨基酸序列。
[0061] SEQ ID N0:40表示全长人PGLYRP2的氨基酸序列。
[0062] SEQ ID N0:41表示全长人PGLYRP3的氨基酸序列。
[0063] SEQ ID N0:42表示全长人PGLYRP4的氨基酸序列。
[0064] SEQ ID N0:43 表示 hCD33-hTREM-l ECD(aal7-200)-Fc6mut 的核酸序列。
[0065] SEQ ID N0:44 表示 hCD33-hTREM-l ECD(aal7-200)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0066] SEQ ID N0:45 表示 hCD33-hTremLl ECD(aal6-162)-Fc6mut 的核酸序列。
[0067] SEQ ID N0:46 表示 hCD33-hTremLl ECD(aal6-162)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID N0:47 表示 hCD33-hTremL2 ECD(aal9-268)-Fc6mut 的核酸序列。
[0069] SEQ ID N0:48 表示 hCD33-hTremL2 ECD(aal9-268)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID N0:49 表示 hCD33-hTREM2-Fc6mut 二聚体的核酸序列。
[0071] SEQ ID N0:50 表示 hCD33-hTREM2-Fc6mut 二聚体的氨基酸序列。
[0072] SEQ ID N0:51表示引物的核酸序列。
[0073] SEQ ID N0:52表示引物的核酸序列。
[0074] SEQ ID NO :53表示hCD33的氨基酸序列。
[0075] 描述 本发明涉及用于鉴定分子例如抗体的方法，所述分子能够特异性结合TREM-1的信号 传导配偶体(本文鉴定为PGLYRP1)，并影响PGLYRP1与其信号传导配偶体TREM-1的结合。 PGLYRP1可以用于修饰TREM-1的活性。因此，本发明涉及影响由PGLYRP1介导的炎症应答 的分子，例如抗体。已经产生并鉴定了能够结合PGLYRP1并影响TREM-1活化和信号传导的 抗体。
[0076] 用于鉴定TREM-1的配体和用于鉴定能够特异性结合PGLYRP1并降低或阻断 TREM-1的PGLYRP1活化的分子例如抗体的方法或测定法可以如下产生： 第一细胞或第一细胞的群体用编码TREM-1或其片段、信号传导蛋白和报道基因构建 体的基因转染。该细胞可以是造血来源的，诸如髓样细胞，其可以是T细胞，或者其可以 是能够被转染和表达这些分子任何其它的细胞类型。信号传导蛋白可以是无论直接或间 接地能够从TREM-1向报道基因构建体发送或传送信号的任何蛋白，并且可以包括DAP10、 DAP12、TCR4、FC yRIII、Fc受体，或能够从TREM-1向报道基因构建体发送或传送信号的 任何其它蛋白。可选地，所述信号传导蛋白可以是TREM-1/信号传导嵌合分子。所述报道基 因构建体包含转录因子和报道基因，其依次编码产生可检测的信号例如可定量的信号的报 道蛋白。所述转录因子可以是NFAT或NFkB或本领域已知的任何其它合适的转录因子。报道 基因可以编码β -半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白（GFP)、氯霉素转移酶或能够产生 可检测的信号的任何其它报道蛋白。可以用于此生物测定的一个合适的细胞系是BWZ. 36/ hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ Τ-细胞(本文也鉴定为"BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞")，在实施 例中详细描述其产生。当被活化时，BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞产生β-半乳糖苷酶，其产 生可以使用本领域已知的设备或试剂盒，例如Beta Glow? (Promega Ε4720, Madison, WI, USA)进行测量。
[0077] 可以通过与PGLYRP1和任选地，多聚化试剂一起孵育活化第一细胞或第一细胞的 群体。任选的多聚化试剂作为PGLYRP1的支架，并且可以是肽聚糖（PGN)、嗜中性粒细胞的 细胞外陷讲（neutrophil extracellular traps, NETs)、透明质酸（hyaloronic acid)、蛋 白聚糖结构（如多功能蛋白聚糖（versican)、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或纤维蛋白），或 能够多聚化或呈递PGLYRP1的任何其它天然存在的基质结构或分子。所述第一细胞可以 通过与一种或多种在其表面或细胞内表达PGLYRP1的第二细胞一起孵育被活化。细胞内 表达的实例可以是PGLYRP1在分泌颗粒中的储存。所述第二细胞可以因此是表达或转染有 编码PGLYRP1的基因和在其表面表达PGLYRP1的任何细胞(或细胞群体)。该第二细胞可以 是原核或真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如CH0细胞、BHK细胞或HEK细胞。所述第二细 胞还可以是活化的嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞可以从个体的全血或组织中获得,并大量 (in bulk)或作为纯化的嗜中性粒细胞使用。模拟嗜中性粒细胞的细菌活化的任何试剂， 例如来自细菌细胞壁的肽聚糖（PGN)，例如PGN-SA、PGN-EB、PGN-EC、PGN-BS (InVivogen， tlrl-pgnsa, SanDiego, CA)可以用于活化嗜中性粒细胞。
[0078] 然后检测并优选测量第一细胞或第一细胞的群体的活性。
[0079] 第一细胞和一种或多种表达PGLYRP1的第二细胞的培养物和/或第一细胞与 PGLYRP1孵育的培养物，以及任选地，多聚化试剂例如PGN，与已产生的针对PGLYRP1的抗体 接触。检测并优选测量第一细胞或第一细胞的群体的活性。
[0080] 以此方式，可以鉴定能够结合TREM-1的配体PGLYRP1和影响PGLYRP1与TREM-1 相互作用的抗体。导致第一细胞的活性增加的PGLYRP1抗体增强PGLYRP1与TREM-1的相 互作用并且在本文鉴定为"刺激性PGLYRP1抗体"。导致第一细胞的活性降低的PGLYRP1抗 体降低、干扰或阻断PGLYRP1与TREM-1的相互作用并且在本文鉴定为"抑制性PGLYRP1抗 体"。抑制性PGLYRP1抗体降低或阻断TREM-1活化和信号传导。
[0081] 因此，本发明涉及表征PGLYRP1抗体功能的方法。能够特异性结合PGLYRP1并具 有对TREM-1活化和下游信号传导的任何影响的抗体在本文中称为"功能性PGLYRP1抗体"。 因此，术语"功能性PGLYRP1抗体"意在涵盖刺激性PGLYRP1抗体和抑制性PGLYRP1抗体。
[0082] 此外，本发明涉及能够特异性结合PGLYRP1和降低、干扰或阻断其与TREM-1的相 互作用，从而降低TREM-1活化和下游信号传导的抗体。本发明的抗体可以具有免疫调节 功能，降低表达TREM-1的髓样细胞的细胞因子产生。例如，本发明的抗体可以降低或阻止 TNF- a、IL-1 β、IL-6、IFN- γ、ΜΙΡ-1 β、MCP-1、IL-8 和 / 或 GM-CSF 从髓样细胞例如巨噬 细胞和/或嗜中性粒细胞和/或患病组织例如滑膜组织中髓样细胞的释放。本发明的抗体 可以能够下调嗜中性粒细胞应答。
[0083] 根据本发明的PGLYRP1抗体可以通过直接或间接影响TREM-1的一种机制或几种 不同机制的组合降低或阻断TREM-1活化。本发明的抗体可以阻止PGLYRP1产生与TREM-1 的功能复合物。
[0084] 本发明的抗体可以通过降低或阻断TREM-1活化和下游信号传导阻断PGLYRP1功 能。
[0085] 本发明还涉及可通过本文公开的方法之外的其它手段鉴定的抑制性PGLYRP1抗 体。
[0086] 本发明的抗体可以能够结合人PGLYRP1和来自人之外的物种的PGLYRP1。如本 文所用术语"PGLYRP1"从而涵盖PGLYRP1的任何天然存在形式，其可以衍生自任何合适的 生物，例如无脊椎动物物种或脊椎动物物种。如本文所述使用的PGLYRP1可以是脊椎动 物PGLYRP1，例如哺乳动物PGLYRP1，例如来自灵长类(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴）的 PGLYRP1 ;啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，兔形目动物(如兔)，或偶蹄动物(如牛、绵羊、猪或骆 驼)等等。优选地,PGLYRP1 是人 PGLYRP1 (SEQ ID Ν0: 1)。PGLYRP1 可以是 PGLYRP1 的成 熟形式，例如在合适的细胞内已经经历翻译后加工的PGLYRP1蛋白。这样的成熟PGLYRP1 蛋白可以例如是糖基化的。PGLYRP1可以是全长PGLYRP1蛋白。PGLYRP1可以是剪接变体。
[0087] 本发明的抗体还可以能够特异性结合PGLYRP1的变体，例如SEQ ID N0: 37 (II 型 1.0 PGLYRP1)和 / 或 SEQ ID NO: 38 (II 型 1.0 PGLYRP1)。
[0088] 本发明的抗体可以能够影响，例如抑制/降低/阻断人TREM-1和来自人以外的另 一物种的TREM-1的活性(信号传导和/或活化)。如本文所用术语"TREM-1"从而涵盖TREM-1 的任何天然存在形式，其可以衍生自任何合适的生物。例如，如本文所述使用的TREM-1可 以是脊椎动物TREM-1，例如哺乳动物TREM-1，例如来自灵长类(例如人、黑猩猩、食蟹猴或 恒河猴）的TREM-1 ;啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，兔形目动物(如兔)，或偶蹄动物(如牛、绵 羊、猪或骆驼）等等。优选地，所述TREM-1是人TREM-1。TREM-1可以是TREM-1的成熟形 式，例如在合适的细胞内已经经历翻译后加工的TREM-1蛋白。这样的成熟TREM-1蛋白可 以例如是糖基化的。TREM-1可以是全长TREM-1蛋白。TREM-1可以是剪接变体。
[0089] 本文术语"抗体"指衍生自种系免疫球蛋白序列的蛋白，其能够特异性结合 PGLYRP1或其部分。所述术语包括任何同种型（S卩，IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY)的全长 抗体和任何单链或其片段。特异性结合PGLYRP1或其部分的抗体，可以排他性结合PGLYRP1 或其部分，或其可以结合有限数目的同源性抗原或其部分。
[0090] 本发明的抗体可以是单克隆抗体，在这个意义上，它们可以直接或间接地衍生自B 淋巴细胞的单一克隆。本发明的抗体可以是单克隆抗体，前提是其不是188C424 (Thermo Scientific)、4H230 或 9A319 (US Biological)或克隆 6D653(Santa Cruz Biotechnology)。
[0091] 本发明的抗体可以是分离的。术语"分离的抗体"指已从其天然环境的另一种/其 它一种或多种组分中分离和/或回收，和/或从其天然环境中组分的混合物纯化的抗体。
[0092] 抗体可以在原核细胞、真核细胞或衍生自细胞提取物的无细胞系统中重组表达。 所述原核细胞可以是大肠杆菌。所述真核细胞可以是酵母、昆虫或哺乳动物细胞，例如衍 生自下列生物的细胞：灵长类(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)、啮齿动物(例如小鼠或大 鼠)、兔形目动物(如兔)或偶蹄动物(如牛、绵羊、猪或骆驼)。合适的哺乳动物细胞系包括但 不限于HEK293细胞、CH0细胞和HELA细胞。PGLYRP1抗体还可以通过本领域技术人员已知 的其它方法产生，例如噬菌体展示或酵母展示。本发明的抗体可以在体内通过用PGLYRP1、 表达PGLYRP1的细胞或两者的组合免疫合适的哺乳动物产生。
[0093] 可以使用例如实施例中描述的方法产生、筛选和纯化PGLYRP1抗体。简而言之， 任何合适的小鼠，包括PGLYRP1敲除（K0)小鼠或TREM-1 K0小鼠都可以用PGLYRP1、表达 PGLYRP1的细胞或两者的组合进行免疫。可以使用直接ELISA或FMAT进行杂交瘤上清液的 初筛并且可以使用流式细胞术来进行复筛。可以随后筛选结合例如全长PGLYRP1的阳性杂 交瘤上清液以及纯化的抗体。然后可以测试阳性杂交瘤上清液或纯化的抗体其降低或阻断 TREM-1携带细胞的PGLYRP1刺激的能力。本发明的方法可以用于此目的。
[0094] 本发明的全长抗体可以包含至少四条多肽链：即通过二硫键相互连接的两条重 (H)链和两条轻（L)链。一个具有特定药物兴趣的免疫球蛋白亚类是IgG家族，其可以细 分为同种型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子由通过两个或更多个二硫键相互连接的两 条重链和各自通过二硫键连接到重链的两条轻链构成。重链可以包含重链可变区（VH)和 至多三个重链恒定（CH)区：CH1、CH2和CH3。轻链可以包含轻链可变区（VL)和轻链恒定区 (CL)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区（⑶R)，其间散布更保守的称 为框架区（FR)的区域。VH和VL区通常由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基端向 羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的高变区形成能够与抗原 (PGLYRP1)相互作用的[结合]结构域，而抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白对宿主组织或 因子的结合，包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的第 一组分（Clq)。
[0095] 抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab'）2、F(ab)S、Fv(通常为抗 体的单个臂的VL和VH结构域）、单链Fv(scFv;参见例如Bird等，Science 1988; 242:42S-426;和 Huston 等 PNAS 1988 ;85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常为 VH 和 CHI 结 构域）以及dAb (通常为VH结构域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单 个VL链的单价分子；微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和κ抗体（kappa bodies) (参见，例如111等Protein Eng 1997;10:949-57);骆驼IgG;IgNAR;以及一个或多个分 离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，以 便形成功能抗体片段。抗体片段的各种类型已描述于或综述于，例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和公开的美国专利申请 20050238646 和 20020161201。
[0096] 在本发明的背景下抗体的某些抗原结合片段可以是合适的，因为其已经显示，可 以通过全长抗体的片段实现所述抗体的抗原结合功能。术语抗体的"抗原结合片段"指抗体 的一个或多个片段，其保留特异性结合如本文所述的抗原例如人PGLYRP1或来自另一物种 的卩61^1^1的能力。抗原结合片段的实例包括？ &13、？&13'、？祕)2、？祕'）2、？祕)5、？奴通 常为抗体的单个臂的VL和VH结构域）、单链Fv(scFv ;参见例如Bird等，Science 1988; 242:42S-426;和 Huston 等 PNAS 1988 ;85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常为 VH 和 CHI 结 构域）以及dAb (通常为VH结构域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单 个VL链的单价分子；微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和κ抗体（kappa bodies) (参见，例如111等Protein Eng 1997;10:949-57);骆驼IgG;IgNAR;以及一个或多个分 离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，以 便形成功能抗体片段。抗体片段的各种类型已描述于或综述于，例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和公开的美国专利申请 20050238646 和20020161201。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以 与完整抗体相同的方式筛选该片段的效用。
[0097] 本发明的抗体可以是人抗体或人源化的抗体。如本文所用术语"人抗体"意在包 括具有可变区的抗体，其中至少框架区的一部分和/或至少CDR区的一部分衍生自人种系 免疫球蛋白序列。（例如，人抗体可以具有可变区，其中框架区和CDR区均衍生自人种系免 疫球蛋白序列)。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。 本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过随机或 位点特异性诱变体外引入的突变或通过体细胞突变体内引入的突变)。
[0098] 这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生， 其包括融合无限增殖化细胞的从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因 非人动物，例如转基因小鼠获得的B细胞。
[0099] 可以从建立在人种系序列的选择上，进一步用天然和合成序列多样性进行多样化 的序列文库中分离人抗体。
[0100] 可以通过人淋巴细胞的体外免疫随后是用EB病毒进行淋巴细胞转化来制备人抗 体。
[0101] 术语"人抗体衍生物"指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一试剂或另一抗体 的缀合物。
[0102] 如本文所用术语"人源化抗体"指包含衍生自非人免疫球蛋白的一种或多种序列 (CDR区）的人/非人嵌合抗体。因此，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体)，其中至少来 自受体高变区的残基被来自非人物种的高变区(供体抗体）的残基取代，所述非人物种例如 来自小鼠、大鼠、兔或具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物。在一些情况 下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基取代。这样的修饰的实例是一个或多个所谓 回复突变的引入。
[0103] 此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰 以进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含至少一个一通常两个一可变结构 域，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白的那些，并且其中所有或基本上所 有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可以任选地还包含至少一部分免疫 球蛋白恒定区（Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。
[0104] 术语"人源化抗体衍生物"指人源化抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一试剂或 另一抗体的缀合物。
[0105] 如本文所用术语"嵌合抗体"指其轻链和重链基因已从源自不同物种的免疫球蛋 白可变和恒定区基因进行构建(通常通过遗传工程化）的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体 的基因的可变区段可以连接到人恒定区段。
[0106] 抗体的可结晶区片段("Fc区"/ "Fc结构域"）是抗体的N末端区域，其包含恒定 CH2和CH3结构域。Fc结构域可以与称为Fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋 白相互作用。Fc区使抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面，抗体可以被 工程化以在Fc区内包括修饰，通常改变一种或多种其功能特性，例如血清半衰期、补体结 合、Fc-受体结合、蛋白稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性、或其缺乏，等等。此外，本发明 的抗体可以被化学修饰(例如，一种或多种化学基团可以连接到抗体）或被修饰以改变其糖 基化，仍然为了改变抗体的一种或多种功能特性。优选地，修饰的Fc结构域包含一种或多 种，并且可能所有下列突变，其将分别导致对某些Fc受体的亲和力下降（L234A、L235E和 G237A)和Clq介导的补体结合降低（A330S和P331S)(残基编号根据EU索引）。
[0107] 本发明的抗体的同种型可以是IgG，例如IgGl，例如IgG2,例如IgG4。如果需要， 抗体的种类可以被已知技术"转换"。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可以类别转换为 IgG抗体。类别转换技术也可以用于将一种IgG亚类转换为另一种，例如，从IgGl到IgG2 或IgG4 ;从IgG2到IgGl或IgG4 ;或从IgG4到IgGl或IgG2。还可以通过组合来自不同 IgG亚类的区域进行抗体的工程化以产生恒定区嵌合分子。
[0108] 在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区使得铰链区中半胱氨酸残基的数目被改 变，例如增加或降低。此方法例如在美国专利号5, 677, 425中由Bodmer等进一步描述。
[0109] 可以进一步修饰恒定区以稳定抗体，例如以降低二价抗体分成两个单价VH-VL片 段的风险。例如，在IgG4恒定区，可以突变残基S241成脯氨酸（P)残基以允许在铰链处完 全的二硫键形成（参见，例如 Angal 等，Mollmmunol. 199S;30:105-8)。
[oho] 抗体或其片段还可以根据它们的互补决定区（⑶R)进行限定。当用于本文时， 术语"互补决定区"或"高变区"指涉及抗原结合的氨基酸残基位于其中的抗体区域。所 述⑶R通常由轻链可变结构域中氨基酸残基24-34 (Ll)、50-56 (L2)和89-97 (L3)以 及重链可变结构域中 31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)构成；（Kabat 等（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services，NIH Publication No. 91-3242)和 / 或来自"高变环" 的那些残基（轻链可变结构域中残基26-32 (LI)、50-52 (L2)和91-96 (L3)，以及重链 可变结构域中 26_32 (HI)、53-55 (H2)和 ％-101 (H3);Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol 1987; 196:901-917)构成。通常，此区域中氨基酸残基通过上文Kabat等中所述方法进行编 号。短语例如"Kabat位置"、"Kabat残基"和"根据Kabat"本文指此编号系统用于重链可 变结构域或轻链可变结构域。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可包含对应 可变结构域的框架（FR)或CDR的缩短或插入的更少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构 域可以包括在⑶R H2的残基52后的氨基酸插入(根据Kabat，残基52a、52b和52c)和在重 链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。对于给定的抗 体，残基的Kabat编号可以通过在抗体序列的同源性区域与"标准"Kabat编号的序列的比 对来确定。
[0111] 如本文所定义的术语"框架区"或"FR"残基指不在⑶R内的那些VH或VL氨基酸 残基。
[0112] 本发明的抗体可以包含来自一种或多种本文公开的特异性抗体的CDR区，例如来 自 SEQ ID N0: 15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35 或 36 内的 CDR 区。
[0113] 1F36抗体具有如SEQ ID N0: 15所示的重链和如SEQ ID N0: 16所示的轻链。本 发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述1F36抗体具有SEQ ID NO: 15的氨基酸31至35、50至66和98至108和SEQ ID NO: 16的氨基酸24至34、51至 56和89至97所示的⑶R序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些⑶R序 列。
[0114] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 15的氨基酸残基31至35(SYWMN) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 15的氨基酸50至66 (MIHPSDSETRLNQKFKD)的⑶RH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 15的氨基酸残基98至 108 (DYSDYDGFAY])的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的 氨基酸取代。
[0115] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 16的氨基酸残基24至34 (RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 16的氨基酸残基51至56 (ASQSIS)的CDRL2序列，其中 这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 16的氨 基酸残基89至97 (QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被 不同的氨基酸取代。
[0116] 1F10抗体具有如SEQ ID N0:19所示的重链和如SEQ ID N0:20所示的轻链。本 发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述1F10抗体具有SEQ ID NO: 19的氨基酸31至35、50至66和99至109和SEQ ID NO: 20的氨基酸24至33、49至 55和88至96所示的⑶R序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些⑶R序 列。
[0117] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 19的氨基酸残基31至35(DYNMY) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 19的氨基酸50至66 (HDPYNGDTSYNQKFKG)的⑶RH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 19的氨基酸残基99至 109 (⑶YGNPFYLDY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的 氨基酸取代。
[0118] 根据本发明的抗体可以包含对应SEQ ID NO: 20的氨基酸残基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 20的氨基酸残基49至55 (DTSKLPS)的CDRL2序列，其中 这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 20的氨 基酸残基88至96 (QQWTSNPPT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被 不同的氨基酸取代。
[0119] 1F105抗体具有如SEQ ID N0: 23所示的重链和如SEQ ID N0: 24所示的轻链。 本发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述1F105抗体具有SEQ ID N0: 23的氨基酸31至35、50至66和99至108和SEQ ID N0: 24的氨基酸24至33、 49至55和88至96所示的CDR序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些 CDR序列。
[0120] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 23的氨基酸残基31至35(DTYIH) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 23的氨基酸50至66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的CDRH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 23的氨基酸残基99至 108 (SDNSDSWFAY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨 基酸取代。
[0121] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 24的氨基酸残基24至33 (SVSSSVNFMN)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 24的氨基酸残基49至55 (DTSKLAP)的CDRL2序列，其中 这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 24的氨 基酸残基88至96 (HQWSSYSLT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被 不同的氨基酸取代。
[0122] 1F95抗体具有如SEQ ID N0: 27所示的重链和如SEQ ID N0: 28所示的轻链。本 发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述1F95抗体具有SEQ ID NO: 27的氨基酸31至35、50至66和99至106和SEQ ID NO: 28的氨基酸24至33、49至 54和87至95所示的⑶R序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些⑶R序 列。
[0123] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 27的氨基酸残基31至35(DYNMH) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 27的氨基酸50至66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG)的⑶RH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 27的氨基酸残基99至 106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代。
[0124] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 28的氨基酸残基24至33 (VASSSVTYMY)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 28的氨基酸残基49至54 (THPLAS)的CDRL2序列，其中 这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 28的氨 基酸残基87至95 (PHWNTNPPT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被 不同的氨基酸取代。
[0125] 2F5抗体具有如SEQ ID N0: 31所示的重链和如SEQ ID N0: 32所示的轻链。本 发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述2F5抗体具有SEQ ID NO: 31的氨基酸35至31、50至66和99至109和SEQ ID NO: 32的氨基酸24至33、49至 55和88至96所示的⑶R序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些⑶R序 列。
[0126] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 31的氨基酸残基31至35(DYYMY) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 31的氨基酸50至66 (AISDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 31的氨基酸残基99至 109 (GGYGNLYAMDY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的 氨基酸取代。
[0127] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 32的氨基酸残基24至35 (TASSSVSSSYLH)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨 基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 32的氨基酸残基51至57 (STSNLAS)的CDRL2序列，其 中这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 32的 氨基酸残基90至98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以 被不同的氨基酸取代。
[0128] 2F7抗体具有如SEQ ID N0: 35所示的重链和如SEQ ID N0: 36所示的轻链。本 发明的抗体可以包含此可变重链序列和/或此可变轻链序列。所述2F5抗体具有SEQ ID NO: 35的氨基酸31至35、50至66和99至109和SEQ ID NO: 36的氨基酸24至34、50至 56和89至96所示的⑶R序列。本发明的抗体可以包含1、2、3、4、5或所有6个这些⑶R序 列。
[0129] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 35的氨基酸残基31至35(NYVMH) 的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN)的CDRH2序列，其中这些氨基酸的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 35的氨基酸残基99至 109 (SGFITTLIEDY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的 氨基酸取代。
[0130] 根据本发明的抗体可以包含：对应SEQ ID N0: 36的氨基酸残基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可以被不同的氨基 酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 36的氨基酸残基50至56 (GASNRYT)的⑶RL2序列，其中 这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 36的氨 基酸残基89至96 (GQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被不 同的氨基酸取代。
[0131] 术语"抗原"(Ag)指用于免疫具有免疫能力的脊椎动物以产生识别Ag的抗体(Ab) 的分子实体。本文中，Ag更广泛地定义并且通常意在包括被Ab特异性识别的目标分子， 从而包括在免疫方法或用于生成Ab的其它方法如噬菌体展示中使用的分子的片段或模拟 物。
[0132] 如本文所用术语"表位"在"抗原结合多肽"例如抗体(Ab)，与其相应抗原（Ag)之 间的分子相互作用的背景下进行定义。通常，"表位"指Ab特异性结合到的Ag上的面积或 区域，即与Ab物理接触的面积或区域。可以使用各种标准(例如，2-6 A的距离截止值，例 如3 A，例如4 A，例如5 A ;或溶剂可及性）对于Ab和Ag分子中的原子定义物理接触。蛋 白表位可以包含Ag中结合Ab直接参与的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性成分)和不直 接参与结合的其它氨基酸残基，例如被Ab有效封闭的Ag的氨基酸残基，即在Ab的"溶剂排 除表面"和/或"足迹"内的氨基酸残基。
[0133] 本文术语表位包含特异性结合PGLYRP1抗体的PGLYRP1的任何特定区域中两种类 型的结合区域。PGLYRP1可以包含许多不同表位，其可以包括但不限于构象表位(其由成熟 PGLYRP1构象中位置彼此接近的一个或多个非邻接氨基酸组成)，和翻译后表位(其整体或 部分由共价连接PGLYRP1的分子结构，例如碳水化合物基团组成)。PGLYRP1还可以包含线 性表位。
[0134] 对于给定抗体(Ab) /抗原（Ag)对的表位可以使用多种实验性的和计算的表位作 图方法在不同的细节层次上进行描述和表征。所述实验性方法包括诱变、X射线晶体学、 核磁共振（NMR)光谱、氢氘交换质谱（ΗΧ-MS)和各种竞争结合的方法；这是本领域已知的方 法。由于每个方法依赖于独特的原理，所以表位的描述与确定其的方法密切相关。因此，取 决于所采用的表位作图的方法，对于给定的Ab/Ag对的表位可以不同地描述。
[0135] 在其最详细的水平上，用于Ag和Ab之间的相互作用的表位可以通过限定Ag-Ab 相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息来 描述。在更不详细的水平上，该表位可以通过限定Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标来 表征。在甚至更不详细的水平上，表位可以通过氨基酸残基表征，所述氨基酸残基包括由特 定标准所定义的氨基酸残基，诸如Ab:Ag复合物中原子之间的距离或溶剂可及性。在进一 步更不详细的水平上，表位可以通过功能，例如通过竞争结合其它Ab来表征。该表位也可 以更一般地定义为包括这样的氨基酸残基，其被另一种氨基酸的取代将改变Ab和Ag之间 的相互作用的特征。
[0136] 在由Ab如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结 构的背景下，术语表位在本文中，除非另有说明或根据上下文矛盾，明确限定为PGLYRP1残 基，其特征在于距离Ab中的重原子（S卩，非氢原子)，例如2-6 A，例如3 A，例如4 A，例如5 A内具有重原子。
[0137] 根据表位的描述和定义取决于所使用的表位作图方法在不同细节水平获得的事 实，可以得出，对于相同Ag上的不同Ab的表位的比较可以类似地在不同的细节水平上进 行。
[0138] 在氨基酸水平描述的表位，例如根据X射线结构确定，如果它们包含同一组氨基 酸残基，则认为是相同的。如果至少一个氨基酸被多个表位共有，则认为表位是重叠的。如 果没有氨基酸残基被多个表位共有，则认为表位是分开的(独特的)。
[0139] 术语"互补位"的定义通过反转角度（reversing the perspective)衍生自"表 位"的上述定义。因此，术语"互补位"指Ab上的Ag特异性结合的面积或区域，即Ab用其 与Ag进行物理接触。
[0140] 在由Ab如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结 构的背景下，术语互补位在本文中，除非另有说明或根据上下文矛盾，明确限定为Ag残基， 其特征在于距离PGLYRP1中的重原子（S卩，非氢原子）4 A内具有重原子。
[0141] 对于给定抗体（Ab) /抗原（Ag)对的表位和互补位可以通过常规方法鉴定。例 如，表位的通常定位可以通过评价抗体结合不同片段或变体PGLYRP1多肽的能力来确定。 PGLYRP1内与抗体接触的特定氨基酸(表位）和抗体内与PGLYRP1接触的特定氨基酸(互补 位）也可以使用常规方法确定。例如，可以组合抗体和目标分子，并且可以结晶Ab :Ag复合 物。可以确定复合物的晶体结构并用于鉴定抗体和其目标之间的相互作用的特异性位点。
[0142] 结合相同抗原的抗体可以关于它们同时结合它们共同的抗原的能力进行表征，并 且可以进行"竞争性结合"/ "框并"（binning)。在本上下文中，术语"框并"指对结合相同 抗原的抗体分组的方法。抗体的"框并"可以基于两种抗体对它们共同的抗原的竞争性结 合，在基于标准技术例如表面等离子共振（SPR)、ELISA或流式细胞术的测定中。
[0143] 抗体的"框（bin) "使用参考抗体进行限定。如果第二抗体不能与参考抗体同时结 合抗原，则所述第二抗体被认为属于与参考抗体相同的"框"。在此情况下，参考抗体和第二 抗体竞争性结合抗原的相同部分并且共同称为（coined) "竞争性抗体"。如果第二抗体能 够与参考抗体同时结合抗原，则所述第二抗体被认为属于分开的"框"。在此情况下，参考抗 体和第二抗体不竞争性结合抗原的相同部分并且共同称为"非竞争性抗体"。
[0144] 抗体"框并"不提供关于表位的直接信息。竞争抗体，即属于相同"框"的抗体，可 以具有相同的表位、重叠的表位或甚至分开的表位。后者是这样的情况，即结合抗原上其表 位的参考抗体是否占据了第二抗体接触抗原上其表位所需的空间（"空间位阻")。非竞争性 抗体通常具有分开的表位。
[0145] 根据本发明的抗体可以能够与1F10竞争结合PGLYRP1。根据本发明的抗体可以 能够与lF36/mAb 0182竞争结合PGLYRP1。根据本发明的抗体可以能够与1F95竞争结合 PGLYRP1。根据本发明的抗体可以能够与lF105/mAb 0184竞争结合PGLYRP1。根据本发明 的抗体可以能够与2F5竞争结合PGLYRP1。根据本发明的抗体可以能够与2F7竞争结合 PGLYRP1。因此，根据本发明的抗体可以属于与这些抗体的任何一种或多种相同的框。
[0146] 本文术语"结合亲和力"指两个分子，例如抗体，或其片段，和抗原之间非共价相互 作用的强度的测量。术语"结合亲和力"用于描述单价相互作用（内在活性)。
[0147] 两个分子，例如抗体或其片段和抗原之间通过单价相互作用的结合亲和力可以通 过确定平衡解离常数（K D)来定量。接下来，KD可以通过测量复合物形成和解离的动力学来 确定，例如通过SPR法。单价复合物的结合和解离相应的速率常数分别称作结合速率常数 ka (或km)和解离速率常数kd (或kj。KD通过公式KD = kd / ka与ka和kd相关。
[0148] 按照上述定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定 抗原的结合亲和力的比较，可以通过比较单个抗体/抗原复合物的K D值进行比较。
[0149] 本发明的PGLYRP1抗体对于其目标（PGLYRP1)可以具有1 X 1(Γ6Μ或更低，1 X ΚΓ7 Μ或更低，1 X 1(Γ8Μ或更低，或1 X 1(Γ9Μ或更低，或1 X Κ^Μ或更低，1 X 1(ΓηΜ或更 低，1 X 1(Γ12Μ或更低或1 X 1(Γ13Μ或更低的KD。
[0150] 根据本发明的抗体可以能够与另一分子，例如天然存在的配体或受体或另一种抗 体竞争结合PGLYRP1。因此，根据本发明的抗体可以能够结合PGLYRP1，具有比也能够结合 PGLYRP1的另一分子更高的亲和力。抗体与天然配体/受体竞争结合抗原的能力可以通过 确定和比较目的相互作用的KD值和非目的相互作用的KD值来评估，所述目的相互作用例如 抗体和抗原之间的特异性相互作用。
[0151] 本文术语"结合特异性"指分子例如抗体或其片段与单个专属抗原，或与有限数目 的高度同源性抗原（或表位）的相互作用。能够特异性结合PGLYRP1的抗体不能结合不相 似的分子。根据本发明的抗体可以不能结合PGLYRP家族成员，例如PGLYRP2、PGLYRP3和 PGLYRP4。根据本发明的抗体可以不能结合人PGLYRP家族成员，例如人PGLYRP2、人PGLYRP3 和人 PGLYRP4。
[0152] 相互作用的特异性和平衡结合常数的值可以通过熟知的方法直接确定。评价配体 (例如抗体）结合它们的目标的能力的标准测定法是本领域已知的，并且包括，例如ELISA、 蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力也可以通过本领域 已知的标准测定，例如SPR来评价。
[0153] 可以进行竞争性结合测定，其中抗体对目标的结合与该目标的另一配体(例如另 一抗体）对目标的结合进行比较。
[0154] 在另一方面，本发明提供了包含本发明的分子，例如本文所述PGLYRP1抗体、多核 苷酸、载体和细胞的组合物和制剂。例如，本发明提供了与药学上可接受的载体一起配制的 包含一种或多种本发明的PGLYRP1抗体的药物组合物。
[0155] 因此，本发明的一个目标是提供包含这样的PGLYRP1抗体的药物制剂，所述抗体 以0.25 mg/ml至250 mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。所 述制剂可以进一步包含一种或多种缓冲系统、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂或表面活性 齐U，以及它们的各种组合。防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中 的用途是本领域技术人员熟知的。可以参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。
[0156] 在一个实施方案中，所述药物制剂是含水制剂。该制剂通常是溶液或悬浮液，但是 还可以包括胶体、分散液、乳状液和多相材料。术语"含水制剂"定义为包含至少50%w/w水 的制剂。类似地，术语"水溶液"定义为包含至少50%w/w水的溶液，并且术语"水悬浮液"定 义为包含至少50%w/w水的悬浮液。
[0157] 在另一实施方案中，所述药物制剂是冻干的制剂，在使用前医师或患者向其中添 加溶剂和/或稀释剂。
[0158] 在进一步的方面，所述药物制剂包含这样的抗体的水溶液，和缓冲液，其中所述抗 体以lmg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述制剂具有约2. 0至约10. 0的pH。
[0159] 本发明的PGLYRP1抗体和包括这样的抗体的药物组合物可用于炎性疾病的治疗， 例如下列炎性疾病：炎性肠病（IBD)、克罗恩病（CD)、溃疡性结肠炎（UC)、肠易激综合征、类 风湿关节炎（RA)、银屑病、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮（SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、 格雷夫斯氏病、多发性硬化(MS )、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺 疾病、间质性肺疾病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、系统性硬化症、骨关节炎、特应性皮炎、 白癜风、移植物抗宿主病、Sjogrens综合征、自身免疫性肾炎、Goodpasture综合征、慢性炎 性脱髓鞘性多发性神经病、过敏症、哮喘和急性或慢性炎症导致的其它自身免疫性疾病。本 发明的PGLYRP1抗体和包含这些抗体的药物组合物可以用于心血管疾病、中风、缺血再灌 注损伤、肺炎、败血病和癌症的治疗。
[0160] 本发明的PGLYRP1抗体适合在患有炎性肠病的个体的治疗中使用。炎性肠病 (IBD)是可影响从口腔到肛门的胃肠道任何部分，引起多种症状的疾病。IBD主要引起腹 痛、腹泻(可能带血)、呕吐或体重下降，但也可能引起胃肠道外的并发症如皮疹、关节炎、目艮 的炎症、疲劳和注意力不集中。患有IBD的患者可以分成两大类，患有溃疡性结肠炎（UC)的 那些和患有克罗恩病（CD)的那些。虽然CD通常涉及回肠和结肠，其可以影响肠中的任何 区域，但往往是不连续的(疾病的集中区域散布到整个肠)，UC总是涉及直肠(结肠)，并且更 连续。在⑶中，炎症是透壁的，导致脓肿、瘘和狭窄，而在UC中，炎症通常局限于粘膜。对 于克罗恩病没有已知的药物或手术治疗，而一些患有UC的患者可以通过手术移除结肠治 愈。治疗选择限于控制症状、维持缓解和预防复发。炎性肠病在临床的效力可以测量为对 于CD的克罗恩病活动指数（CDAI)评分的降低，其是基于实验室测试和生活质量问卷的评 分量表。在动物模型中，效力主要通过体重增加，并且还通过疾病活动指数（DAI)的增加来 测量，所述疾病活动指数是大便稠度、体重和血便的组合。
[0161] 本发明的PGLYRP1抗体适合在患有类风湿关节炎的个体的治疗中使用。类风湿关 节炎（RA)是全身性疾病，其影响几乎身体的所有部分(如果不是全部)，并且是关节炎的最 常见形式之一。其特征在于关节的炎症应答，其导致疼痛、僵硬、发热、发红和肿胀。这种炎 症是炎症细胞侵入关节的结果，并且这些炎性细胞释放的酶可以消化骨和软骨。结果是，这 种炎症除其他生理效应之外还可以导致严重的骨和软骨损伤和关节退化和重度疼痛。所涉 及的关节可能会失去它的形状和取向，导致疼痛和运动丧失。
[0162] 本领域已知有几种动物模型用于类风湿性关节炎。例如，在胶原诱导的关节炎 (CIA)模型中，小鼠发生类似于人类风湿关节炎的炎性关节炎。由于CIA与RA共有类似的 免疫学和病理学特征，这使得其成为合适的模型用于筛选潜在的人抗炎化合物。此模型中 的效力通过关节肿胀降低来测量。RA在临床中的效力通过降低患者中症状的能力测量，其 作为关节肿胀、红细胞沉降率、C-反应蛋白水平和血清因子如抗瓜氨酸化蛋白抗体的水平 的组合进行测量。
[0163] 本发明的PGLYRP1抗体适合在患有银屑病的个体的治疗中使用。银屑病是可造成 相当大的不适感的T细胞介导的皮肤的炎性病症。它是这样的疾病，对于其目前还没有治 愈方法，并影响所有年龄的人。虽然患有轻度银屑病的个体往往可以用外用制剂控制他们 的疾病，但全世界一百多万患者需要紫外线照射治疗或全身性免疫抑制治疗。不幸的是，紫 外线辐射的不便和风险以及很多疗法的毒性限制了其长期使用。另外，患者通常具有银屑 病复发，并在某些情况下，停止免疫抑制治疗后不久就反弹。最近开发的基于CD4+ T细胞 转移的银屑病模型模拟人银屑病的很多方面，并且因此可以用于鉴定适合在银屑病的治疗 中使用的化合物（Davenport 等，Internat. Immunopharmacol 2: 653-672，2002)。此模 型的效力使用评分系统通过皮肤病理学的降低进行测量。同样，患者中的效力通过皮肤病 理学降低进行测量。
[0164] 本发明的PGLYRP1抗体适合在患有银屑病关节炎的个体的治疗中使用。银屑病关 节炎（PA)是一种发生在银屑病患者的亚群中的炎性关节炎。在这些患者中，皮肤病理学/ 症状伴有关节肿胀，类似于类风湿性关节炎中见到的那些。其特征在于具有起鳞（scaling) 的皮肤炎症的斑片状、隆起、红色区域。银屑病经常影响肘部和膝盖的顶端、头皮、肚脐和生 殖器区域周围或肛门。大约10%的患有银屑病的患者也发生他们的关节相关的炎症。
[0165] 如本文所用的术语"治疗"，指有需要的任何人或其它动物对象的医学治疗。所述 对象预计由医生或兽医医生进行体检，其已给予暂定的或明确的诊断，其将表明，使用所述 治疗有益于所述人或其它动物对象的健康。根据许多因素，如对象的健康的现状，所述治疗 的时机和目的可以从一个个体到另一个进行变化。因此，所述治疗可以是预防性的、姑息性 的、针对症状性的和/或治疗性的。
[0166] 在本发明中，预防性的、姑息性的、针对症状性的和/或治疗性的治疗可以代表本 发明的单独的方面。
[0167] 本发明的抗体可被胃肠外施用，如静脉内，如肌内，如皮下。可选地，本发明的抗体 可以通过非肠胃外途径施用，如口服或局部施用。本发明的抗体可被预防性施用。本发明 的抗体可以治疗性施用（按需)。
[0168] 示例性实施方案 1.细胞，其表达TREM-1、TREM-1的信号传导蛋白和被所述信号传导蛋白活化的报道 基因构建体。
[0169] 2.根据实施方案1的细胞，其中所述细胞是造血来源的。
[0170] 3.根据实施方案2的细胞，其中所述细胞是髓样细胞。
[0171] 4.根据实施方案2的细胞，其中所述细胞是T细胞。
[0172] 5.根据实施方案1-4任一项的细胞，其中所述信号传导蛋白是DAP10。
[0173] 6.根据实施方案1-4任一项的细胞，其中所述信号传导蛋白是DAP12。
[0174] 7.根据实施方案1-4任一项的细胞，其中所述信号传导蛋白是TCIU。
[0175] 8.根据实施方案1-4任一项的细胞，其中所述信号传导蛋白是Fc YRIII。
[0176] 9.根据实施方案1-4任一项的细胞，其中所述信号传导蛋白是Fc受体。
[0177] 10.根据实施方案1-9任一项的细胞，其中所述报道基因构建体包含转录因子和 报道基因。
[0178] 11.根据实施方案10的细胞，其中所述转录因子是NFAT。
[0179] 12.根据实施方案11的细胞，其中所述转录因子是NFkB。
[0180] 13.根据实施方案10-12任一项的细胞，其中所述报道基因编码β-半乳糖苷酶。
[0181] 14.根据实施方案10-12任一项的细胞，其中所述报道基因编码荧光素酶。
[0182] 15.根据实施方案10-12任一项的细胞，其中所述报道基因编码绿色荧光蛋白 (GFP)。
[0183] 16.根据实施方案10-12任一项的细胞，其中所述报道基因编码氯霉素转移酶。
[0184] 17.根据实施方案1_4、6、10-11和13任一项的细胞，其是BWZ. 36/ hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ Τ-细胞。
[0185] 18.刺激根据实施方案1-17任一项的细胞的方法，其包括使所述细胞与PGLYRP1 接触。
[0186] 19.刺激根据实施方案1-17任一项的细胞的方法，其包括使所述细胞与PGLYRP1 和PGN接触。
[0187] 20.根据实施方案18-19任一项的方法，其中所述PGLYRP1由细胞表达。
[0188] 21.根据实施方案20的方法，其中表达PGLYRP1的细胞是原核细胞。
[0189] 22.根据实施方案20的方法，其中表达PGLYRP1的细胞是真核细胞。
[0190] 23.根据实施方案22的方法，其中表达PGLYRP1的细胞是哺乳动物细胞。
[0191] 24.根据实施方案23的方法，其中表达PGLYRP1的细胞是活化的嗜中性粒细胞。
[0192] 25.根据实施方案23的方法，其中表达PGLYRP1的细胞是HEK细胞。
[0193] 26.鉴定TREM-1配体的方法，其包括：（a)培养根据实施方案1-18任一项的细 胞；（b)当它与细胞、流体例如生物流体或组织接触时(其触发TREM-1的活化)，对所述表达 TREM-1的细胞的活性进行检测，优选定量；（c)使（b)的培养物与TREM-1蛋白接触；（d)分 离结合TREM-1的组分以及（e)表征所分离的组分。
[0194] 27.鉴定特异性结合PGLYRP1并且修饰TREM-1介导的细胞活性的分子的方法，其 包括：（a)根据实施方案1-18中任一项培养细胞；（b)当它与PGLYRP1和任选地，多聚化试 剂如PGN接触时，对表达TREM-1的所述细胞的活性进行检测，优选定量；（c)将（b)的培养 物与特异性结合PGLYRP1的分子接触；和（d)检测，优选定量表达TREM-1的所述细胞的活 性小于或大于如（b)中测量的它的活性。
[0195] 28.鉴定修饰TREM-1介导的细胞活性的PGLYRP1抗体或其片段的方法，其包括： (a)根据实施方案1-18中任一项培养细胞；（b)当它与PGLYRP1和任选地，多聚化试剂如 PGN接触时，对表达TREM-1的所述细胞的活性进行检测，优选定量；（c)将（b)的培养物与 结合PGLYRP1的抗体接触；和（d)检测，优选定量表达TREM-1的所述细胞的活性小于或大 于如（b)中测量的它的活性。
[0196] 29.根据实施方案27的方法，其中所述PGLYRP1抗体或其片段降低TREM-1介导 的细胞活性，并且其中所述第一细胞在（d)中测量时的活性低于其在（b)中测量时的活性。
[0197] 30.根据实施方案27的方法，其中所述PGLYRP1抗体或其片段增加 TREM-1介导 的细胞活性，并且其中所述第一细胞在（d)中测量时的活性多于其在（b)中测量时的活性。
[0198] 31. PGLYRP1抗体或其片段，其通过根据实施方案28-30任一项的方法鉴定。
[0199] 32. PGLYRP1抗体或其片段，其能够特异性结合PGLYRP1并降低PGLYRP1介导的 TREM-1 活性。
[0200] 33.根据实施方案31-32任一项的抗体或其片段，其能够降低从表达TREM-1的细 胞中一种或多种细胞因子的释放。
[0201] 34.根据实施方案31-33任一项的抗体或其片段，其是单克隆抗体。
[0202] 35.根据实施方案31-34任一项的抗体或其片段，其是人源化抗体。
[0203] 36.根据实施方案31-34任一项的抗体或其片段，其是人抗体。
[0204] 37.根据实施方案31-34任一项的抗体或其片段，其是嵌合抗体。
[0205] 38.根据实施方案31-37任一项的抗体，其中所述抗体的同种型是IgG。
[0206] 39.根据实施方案38的抗体，其中所述同种型是IgGl、IgG2或IgG4。
[0207] 40.根据实施方案37的抗体，其中所述抗体的同种型是IgGl。
[0208] 41.根据实施方案37的抗体，其中所述抗体的同种型是IgG4。
[0209] 42.根据实施方案31-41任一项的抗体或其片段，其能够与抗体1F10竞争结合 PGLYRP1。
[0210] 43.根据实施方案31-41任一项的抗体或其片段，其能够与抗体lF36/mAb 0182 竞争结合PGLYRP1。
[0211] 44.根据实施方案31-41任一项的抗体或其片段，其能够与抗体1F95竞争结合 PGLYRP1。
[0212] 45.根据实施方案31-41任一项的抗体，其能够与抗体lF105/mAb 0184竞争结合 PGLYRP1。
[0213] 46.根据实施方案31-41任一项的抗体，其能够与抗体2F5竞争结合PGLYRP1。
[0214] 47.根据实施方案31-41任一项的抗体，其能够与抗体2F7竞争结合PGLYRP1。
[0215] 48.根据实施方案31-47任一项的抗体或其片段，其能够特异性结合SEQ ID N0: 37 (II 型 1.0 PGLYRP1)和 / 或 SEQ ID NO: 38 (II 型 2.0 PGLYRP1)。
[0216] 49.根据实施方案31-48任一项的抗体或其片段，当使用表面等离子共振测量 时，其对于其目标具有1 X 1(Γ6Μ或更低，1 X 10_7M或更低，1 X 10_8M或更低，或1 X 10_9 Μ或更低，或1 X Κ^Μ或更低，1 X 1(ΓηΜ或更低，1 X 1(Γ12Μ或更低或1 X 1(Γ13Μ或更 低的KD。
[0217] 50.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 15的氨基 酸残基31至35 (SYWMN)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 15的氨基酸50至66 (MIHPSDSETRLNQKFKD)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 15的氨基酸残基98至108 (DYSDYDGFAY])的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的一 个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0218] 51.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID N0: 19的氨基 酸残基31至35 (DYNMY)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 19的氨基酸50至66 (HDPYNGDTSYNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 19的氨基酸残基99至109 (⑶YGNPFYLDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的一 个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0219] 52.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID N0: 23的氨基 酸残基31至35 (DITIH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 23的氨基酸50至66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 23的氨基酸残基99至108 (SDNSDSWFAY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0220] 53.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID N0: 27的氨基 酸残基31至35 (DYNMH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 27的氨基酸50至66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 27的氨基酸残基99至106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的一个、两 个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0221] 54.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID N0: 31的氨基 酸残基31至35 (DYYMY)的⑶RH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 31的氨基酸50至66 (AISDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序 列，其中这些氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 31的氨基酸残基99至109 (GGYGNLYAMDY)的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一 个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0222] 55.根据实施方案31-49任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID N0: 35的氨基 酸残基31至35 (NYVMH)的⑶RH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残 基取代；和/或对应SEQ ID N0: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN)的CDRH2序 列，其中这些氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 35的氨基酸残基99至109 (SGFITTLIEDY)的CDRH3序列，其中这些氨基酸残基的一 个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
[0223] 56.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID N0: 16的氨基 酸残基24至34 (RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 16的氨基酸残基51至56 (ASQSIS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 16的氨基酸残基89至97 (QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸残基的一个或 两个可以被不同的氨基酸取代。
[0224] 57.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID N0: 20的氨基 酸残基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 20的氨基酸残基49至55 (DTSKLPS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 20的氨基酸残基88至96 (QQWTSNPPT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸残基的一个 或两个可以被不同的氨基酸取代。
[0225] 58.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID N0: 24的氨基 酸残基24至33 (SVSSSVNFMN)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 24的氨基酸残基49至55 (DTSKLAP)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 24的氨基酸残基88至96 (HQWSSYSLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸残基的一个 或两个可以被不同的氨基酸取代。
[0226] 59.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID N0: 28的氨基 酸残基24至33 (VASSSVTYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID N0: 28的氨基酸残基49至54 (THPLAS) 的CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应 SEQ ID N0: 28的氨基酸残基87至95 (PHWNTNPPT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸残基的 一个或两个可以被不同的氨基酸取代。
[0227] 60.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID N0: 32的氨基 酸残基24至35(TASSSVSSSYLH)的CDRL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 32的氨基酸残基51至57 (STSNLAS)的 CDRL2序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 32的氨基酸残基90至98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个 或两个可以被不同的氨基酸取代。
[0228] 61.根据实施方案50-55任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID NO: 36的氨基 酸残基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可 以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 36的氨基酸残基50至56 (GASNRYT)的 CDRL2序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以被不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID N0: 36的氨基酸残基89至96 (GQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个 或两个可以被不同的氨基酸取代。
[0229] 62.根据实施方案31-61任一项的抗体，其用作药物。
[0230] 63.根据实施方案31-62任一项的抗体，其用于治疗炎性疾病。
[0231] 64.抗体，其能够特异性结合PGLYRP1并降低PGLYRP1介导的TREM-1活性，所述 抗体用作药物。
[0232] 65.抗体，其能够特异性结合PGLYRP1并降低PGLYRP1介导的TREM-1活性，所述 抗体用于治疗炎性疾病。
[0233] 66.根据实施方案62-65任一项的用途，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。
[0234] 67.根据实施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿关节炎（RA)。
[0235] 68.根据实施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是炎性肠病（IBD)和/或 溃疡性结肠炎。
[0236] 69.根据实施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是银屑病关节炎（PA)。
[0237] 70.实施方案62或64在心血管疾病、中风、缺血再灌注损伤、败血症和/或癌症 治疗中的用途。
[0238] 本发明进一步通过下列实施例阐明，其不应理解为进一步的限制。本申请中引用 的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确地通过引用并入本文。 实施例
[0239] 实施例1 :BWZ. 36人TREM-1 :DAP12稳定细胞系的生成 BWZ. 36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ 细胞系（本文也称为 "BWZ/hTREM-Ι 报道基因细 胞"）衍生自BW5147 T细胞（小家鼠胸腺淋巴瘤细胞系，ATCC TIB-47, LGC Standards, Middelsex，UK)并包含由NFAT启动子元件的四个拷贝调控的LacZ报道基因 构建体（参见 Karttunen, J. & Shastri，N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 3972-3976 和Fiering，S·，Northrop, J. P·，Nolan, G. P·，Matilla，P·，Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4，1823-1834)。将使用 TREM-1 cDNA (Gene Bank 参考 ID: NM_018643. 2，Sino Biological Inc.，Beijing, China))作为模 板和寡聚物 TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SECHO MO: 51》_ 5' TM3TAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC(SEQ ID NO: 52)作为引物，克隆 入pIREShyg载体GenBank登录号U89672 (目录号 6061-1，Clontech Laboratories, CA, USA)的 TREM/DAP12/pMX-IRES 载体(从 Smal 位点至 BamHI 位点编码 786 bp 的 TREM-1 )，转 染入PLAT-E包装细胞系（由华盛顿大学的W. Yokoyama提供；或者目录号RV-101，Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finland)，其使用 Superfect 转染试剂（目录号 301305，Qiagen Nordic, Denmark)。包含 TREM/DAP12/pMX-IRES 病毒颗粒的 PLAT-E 上清 液用于如下感染BWZ. 36细胞：2xl05个BWZ. 36细胞在6孔板中培养，并且培养基用1. 5ml 包含病毒颗粒+ 8 mg/ml聚凝胺的上清液替换。6-8小时后，将1.5 ml正常培养基添加到 板中并且将细胞孵育额外24小时。稳定表达TREM-1的BWZ. 36细胞系用抗TREM-1单克隆 抗体（克隆 21C7; Bouchon 等，2000，J. Immunol vol. 164 第 4991-4995 页)染色，并通 过细胞分选分离。
[0240] 实施例2 :用于鉴定表达TREM-1的配体的细胞的生物测定的建立 如实施例1所述，通过用hTREM-Ι和DAP12转染NFAT-lacZ携带细胞系BWZ. 36 (Sanderson S, Int. Immun. 1994)生成 TREM-1 报道基因细胞系。此 BWZ. 36/ hTREM-1: DAP12: NFAT-LacZ细胞系(本文也称为BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞）对TREM-1 的抗体介导的交联是高度敏感的，当用1-10 μ g/ml板结合的可商购的抗TREM-1抗体刺 激时，相比同种型对照，给出NFAT-驱动的LacZ产生的约40倍的诱导。在报道基因细胞 中NFAT-驱动的LacZ产生可以使用基于发光的试剂盒Beta Glow? (Promega E4720， Madison，WI)进行测定。板用同种型对照或aTREM-1 MAB1278 (在PBS中浓度3 ug/ml，100 ul/孔）（R&D Systems, Minneapolis, USA)在 4°C包被 16 小时或在 37°C，5 % C02 包被 2 小时，并且通过添加 l〇ml维尔烯（VerseneK目录号#15040，Gibco, Carlsbad CA, USA) 使BWZ/hTREM-1报道基因细胞脱离，以400g离心5分钟，并在PBS和培养基（RPMI-1640 w/o 酚红；目录号11835，Gibco，Carlsbad CA，USA)中清洗，然后添加到包被的板中（1 x 106 细胞/ml，4xl04细胞/孔）到总体积100 ul并在37°C，5 % 0)2孵育过夜（16-20小时)。
[0241] 这些TREM-1反应性细胞用于鉴定表达TREM-1配体的细胞。一种这样的细胞被证 明是来自全血的嗜中性粒细胞。通过Ficoll和葡聚糖沉降纯化健康供体的嗜中性粒细胞， 并用 PGN(InVivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA, USA)刺激过夜。简而言之，以 1:3 的 报道基因细胞：嗜中性粒细胞的比例将BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞添加到活化的嗜中性粒 细胞培养物中。在聚-D-赖氨酸包被的Black细胞培养板（# 356640,来自BD Biosciences， San Jose, CA，USA)中运行此测定。TREM-1活化在培养24小时后使用BetaGlo试剂 (E4720,来自 Promega, Madison, WI, USA)读出并且使用来自 Perkin Elmer 的 TopCount 发光计数器测量发光。
[0242] 体外刺激的嗜中性粒细胞具有能够诱导TREM-1信号传导的配体，并且来自健康 供体的全血的嗜中性粒细胞通过葡聚糖沉降纯化，并用多种试剂刺激过夜。能刺激来自嗜 中性粒细胞的TREM-1应答信号的唯一试剂是PGN_SA(Invivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA，USA),其模拟细胞的细菌活化。这些活化的嗜中性粒细胞然后通过共培养细胞用来刺 激BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞系。简而言之，以1 :3的报道基因细胞：嗜中性粒细胞的比 例将BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞添加到活化的嗜中性粒细胞培养物中。在聚-D-赖氨酸包 被的黑细胞培养板（目录号356640 BD Biosciences，San Jose, CA，USA)中运行此测定。 TREM-1活化在培养24小时后使用BetaGlo试剂（目录号E4720, Promega, Madison, WI, USA)读出并且使用（来自Perkin Elmer, Waltham MA, USA)的TopCount发光计数器测量 发光。如图1所示，在与PGN刺激的嗜中性粒细胞共培养的BWZ/hTREM-Ι细胞中观察到报 道基因活性的显著诱导。此诱导高度依赖嗜中性粒细胞活化。对于静息嗜中性粒细胞没有 看到应答(柱2嗜中性粒细胞)。类似地，当在不存在嗜中性粒细胞的情况下用TLRL混合物 中PGN-SA刺激BWZ/hTREM-Ι报道基因细胞时(柱1-TLRL)没有看到应答，证明应答不仅仅 是PGN对BWZ/hTREM-Ι细胞的直接作用。用细胞因子混合物活化嗜中性粒细胞(柱3+4嗜 中性粒细胞+细胞因子）也不提供正确的TREM-1活化信号。
[0243] 实施例3 :可溶性TREM-1对PGN活化的嗜中性粒细胞的结合 PGN-刺激的嗜中性粒细胞能够诱导TREM-1活化，表明在PGN刺激的嗜中性粒细胞培 养物中存在TREM-1刺激因子。为了证实嗜中性粒细胞上TREM-1相互作用蛋白的存在，将 PGN-刺激的嗜中性粒细胞用重组TREM-1四聚体蛋白染色并通过流式细胞术分析。简而言 之，从获自Astarte Biologies (Redmond, WA, USA)的人全血中经由Ficoll-葡聚糖沉 降法分离粒细胞。在50ml管中用3份Ficoll和4份血液的比例，使血液在FicollPaque (17-0840-03，GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)梯度上分层，然后在 400xg在 22? 不间断（without brake)离心30分钟。中间的PBMC带轻轻吸去。吸取浓缩的RBC上分层 的粒细胞，并转移到50ml聚丙烯管。粒细胞和污染的RBC用lxPBS稀释到40ml并随后添加 10ml PBS溶液中的4% DEXTRAN 500 (Sigma, 31392，St Louis, M0, USA)。通过轻轻颠倒 混合后，管在22°C放置20-30分钟。然后将富含粒细胞的上清液转移到新管并在250xg在 22°C离心5分钟；吸取上清液并丢弃。用渗透压裂解去除污染的RBC，简而言之，将细胞沉 淀重悬在7. 5ml的0. 2% NaCl中；轻轻混合55-60秒，并且添加17. 5ml的1. 2% NaCl溶液。 然后用PBS使体积达到50ml，并在250xg离心5分钟，将沉淀重悬在7. 5ml的0. 2% NaCl中 以第二次重复裂解。最终的粒细胞沉淀重悬在RPMI/10% FBS中。
[0244] 分离的粒细胞以 3. 8 E6/ml 的密度在 RPMI/10%FBS + 10 μ g/ml PGN-SA (Invivogentlrl-pgnsa, San Diego, CA, USA)中培养7天。通过离心沉淀细胞并重悬 在PBS/2%FBS用于染色。然后在存在或不存在2 μ g/ml探针，具有或不具有100 μ g/ml (50X)的特异性的或不相关的竞争蛋白的情况下，以100, 000/孔的密度将重悬的粒细胞铺 板在96孔板（圆底）中。在50 μ 1/孔体积中将细胞在4°C与探针/竞争蛋白孵育1小时。 在孵育结束时，添加150 μ 1/孔PBS/2%FBS并沉淀细胞。沉淀的细胞重悬在50 μ 1/孔的 山羊抗 hFc F(ab，）2/ΡΕ 缀合物（Jackson ImmunoResearch 109-116-098, West Grove, PA，USA)中并在4°C孵育30分钟。添加150 μ?/孔PBS/2%FBS并沉淀细胞。沉淀的细胞 进一步在200 μ 1/孔PBS/2%FBS中洗涤并沉淀。然后将洗涤的细胞重悬在100 μ 1/孔固 定剂（1:1 PBS: Cytofix. 554655，BD Biosciences, San Jose, CA, USA)中并在室温孵 育5分钟。向固定的细胞添加100 μ 1/孔PBS/2%FBS，并然后沉淀细胞。染色/固定的细 胞然后重悬在100 μ 1/孔PBS/2%FBS用于在LSR II流式细胞仪上进行流式细胞术分析。 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)〇 ----/--: Fcmui 5.36 mgimi SEQ ID NO: 3 hTREM-1 tet/Fc mu! 1,〇?mg/m) SEQ ID NO: 2 hmElf-i tet Ft mtuM-i SOX DCIR COMP 0.3 mg/mt SEQ IO NO: 4 50X TRIM COMP 1,14 mg/mf SEQ ID NO: 5
[0245] 从流式细胞数据创建直方图。来自山羊抗hFc/ΡΕ缀合物的背景荧光在每个直方 图中显示为背景并指定为"PE"。在每个直方图上绘制相同的标志物以指定结合第二山羊抗 hFc/ΡΕ缀合抗体的细胞的百分比。阴性对照Fcmut蛋白显示2%阳性结合细胞，其与单独用 山羊抗hFc/PE缀合物看到的背景荧光相同（图2A)。当细胞用2 μ g/ml hTREM-1/四聚体 染色时，它们为39%阳性（图2B)。当在100 μ g/ml DCIR COMP蛋白的背景下完成TREM-1 四聚体结合时，细胞为41%阳性，证实DCIR COMP不竞争结合TREM-1四聚体（图2C)。当在 100 μ g/ml TREM-1 COMP蛋白存在的情况下完成TREM-1四聚体结合时，细胞为10%阳性， 显示TREM-1 COMP蛋白的确与TREM-1四聚体竞争结合细胞（图2D)。
[0246] 实施例4 :作为嗜中性粒细胞表达的TREM-1配体的PGLYRP1的鉴定 通过使用免疫沉淀偶联质谱（IP-MS)将PGLYRP1鉴定为TREM-1配体。可溶性TREM-1 四聚体用作亲和"诱饵"分子以鉴定配体。简而言之，TREM-1-四聚体-Fc (SEQ ID N0:2) 和分开的⑶83-Fc (SEQ ID NO:5)各自以100 μ g/ml的终浓度与270百万个通过如上述 的葡聚糖沉降纯化的人嗜中性粒细胞在1 mL PBS中在4°C一起孵育90分钟并温和摇动。 沉淀后，细胞重悬在lmL PBS缓冲液中，其包含交联剂3, 3'-二硫代双[磺酸琥珀酰亚氨 丙酸酯](DTSSP) (Thermo Scientific :21578, Rockford，IL，USA)，以 2 mM 的浓度并在室 温孵育30分钟。细胞用lmL PBS洗涤3X，随后在1 mL RIPA缓冲液（Thermo Scientific, 89901，Rockford, IL，USA)中裂解。裂解物以15, 000 Xg在4°C离心10分钟以去除不溶 的材料。使用蛋白 A Mag Sepharose? 珠 （GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56， Piscataway，NJ，USA)从上清液中将交联到偶联探针的Fc的嗜中性粒细胞蛋白免疫沉 淀。简而言之，50 yL珠首先用200 yLPBS洗涤，然后重悬在lmL细胞裂解物中，在4°C 孵育60分钟，磁力捕获并随后用200 μ L RIPA缓冲液洗涤2次，然后用200 μ L PBS洗涤 3次。从最终的磁力捕获物去除PBS后，使用200 yL包含8M尿素、100 mM Tris (ρΗ8·0) 和 15mM TCEP (Thermo Scientific, 77720，Rockford, IL, USA)的缓冲液从磁性珠上洗 脱蛋白，并在室温孵育30分钟，捕获珠并将上清液转移到Microcon Ultracel YM-30滤 器（Millipore, 42410，Billerica, MA, USA)。样品在 14，000 x g, 2(TC 离心 30-60 分钟，直至滤膜顶部上没有液体保留。然后用100 μ L 8M尿素中的50mM IAA (碘乙酰胺） 在室温下黑暗中将保留的蛋白烷基化30分钟。滤器用100 yL 50mM NH4HC03洗涤2次并 然后转移到新的收集管中。添加在60 yL 50 mM NH4HC03中的1 yg胰蛋白酶（目录号 ￥5111，？1'〇1^83，]\&1(^8〇1111，旧4)然后在371：孵育过夜。通过在 14,000 18离心30 分钟收集胰蛋白酶消化物，随后用50 yL 50 mM順4!10)3洗涤滤器。通过LC/MS/MS使用 LTQ-〇rbitrap-XL 质谱仪（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)分析 10 μ L 消化物。 针对 ΙΡΙ 人数据库（ν3· 81)使用 SEQUEST-Sorcerer 引擎（4· 0· 4 样式（build)) (SageN, Milpitas, CA, USA)搜索数据，并且然后用 Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, OR, USA)后处理以用1%的错误发现率过滤蛋白ID。阴性对照扣除后，发现PGLYRP1是与 hTREM-Ι四聚体特异性结合的高可信度蛋白。在嗜中性粒细胞中的免疫沉淀显示在148个 鉴定的蛋白中，72个蛋白通过对照构建体（CD83 )单独免疫沉淀，73个蛋白对于TREM-1和 CD83是相同的，而只有三个是TREM-1特异性的（图3)。该实验后来使用来自不同的供体的 嗜中性粒细胞进行了重复并且PGLYRP1再次被鉴定为特异性与hTREM-Ι相互作用。
[0247] 实施例5 :从HEK293 6E表达的人PGLYRP1的纯化 通过将人CD33信号肽序列（SEQ ID N0: 53)与人成熟PGLYRP1编码序列（SEQ ID NO: 1)融合构建重组蛋白序列。所获得的开放阅读框克隆入pcDNA3. l/Zeo(+)载体 (Life Technologies, Carlsbad CA, USA) CMV 启动子后。然后用 293fectinTM (Life Technologies, Carlsbad CA, USA)按照供货商的方案将所述 pcDNA3.1_hPGLYRPl 构建 体转染入HEK293 6E细胞。转染后5天，包含分泌的人PGLYRP1的培养上清液通过离心 (15,000 rpmX 20 min, 4 C)收获，并且然后通过用0.22 μπι硝酸纤维素膜过滤澄清。然 后将澄清的上清液首先稀释10倍到20mM柠檬酸钠 ρΗ5. 0中，并且然后应用到Hitrap SP HP 5 ml 柱（17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，然后用 5 倍柱体积的 20 mM 柠檬酸钠 PH5.0洗涤。然后用20 mM柠檬酸钠 pH 5.0、1 M NaCl的0-100%线性梯度以 30倍柱体积洗脱结合的人PGLYRP1。分开合并包含人PGLYRP1的二聚体和单体形式的级分 并通过Amicon ultra 15 离心单兀（UFC800324 3,000 kDa MWCO, Millipore, Hellerup， Denmark)浓缩到少于4ml。二聚体和单体合并物进一步精加工并且通过Hiload 26/60 Superdex 75 318ml 柱（17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)缓冲液交换到憐 酸盐缓冲盐水（PBS)。离心后，通过用NANODROP UV分光光度计测量280nm吸光度来确定最 终蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)评价蛋白纯度。
[0248] 实施例6 :大肠杆菌表达的人PGLYRP1的重折叠和纯化 人PGLYRP1作为包含体在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中表达。通过离心收获细菌，重 悬在 50mM Tris-HCl pH8.0,500 mM NaCl，5 mM EDTA，0.5% Triton X-100 中并通过离心 破碎。不溶沉淀用50 mM Tris，pH 8. 0，1% TritonX-100,2 M尿素洗涤三次并用50mM Tris pH8. 0洗涤一次，然后溶解在50 mM Tris-HC1，6M盐酸胍，pH7. 4，1 mM DTT中（终蛋 白浓度20mg/ml)。对于体外折叠，溶解的人PGLYRP1包涵体稀释在50 mM Tris，pH 8.0， 2mM EDTA，5 mM半胱胺，0.5 mM胱胺，0.4 Μ精氨酸中（终蛋白浓度lmg/ml)。在4°C过夜 后，通过离心/过滤使折叠混合物澄清，并且然后稀释12倍到10mM MES pH3.5中以降低 电导率和pH (最终pH约5. 8,电导率约6mS/cm)。然后将稀释的折叠混合物应用到Hitrap SP HP 5ml 柱（17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，然后用 5 倍柱体积的 50 mM MES pH5. 8洗涤。然后用50 mM MES pH 5. 8，1 M NaCl的0-60%线性梯度以20倍柱 体积洗脱结合的人PGLYRP1。合并包含重折叠的人PGLYRP1的级分并通过Amicon ultra 15 离心单兀（UFC800324 3,000 kDa MWCO, Millipore, Hellerup, Denmark)浓缩到少 于 4ml。然后使用 Hiload 26/60 Superdex 75 318ml 柱（（17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)精加工并将蛋白缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水（PBS)中。大部分重折叠 的人PGLYRP1蛋白以单体形式。离心后，通过用NAN0DR0P UV分光光度计测量280nm吸光 度来确定最终蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)评价蛋白 纯度。
[0249] 实施例7 :小鼠免疫和mAb的鉴定 使用纯化的人PGLYRP1免疫小鼠以产生抗体。简而言之，小鼠免疫3次，每次免疫用20 μ g重组PGLYRP1。第一次免疫使用完全福氏佐剂（目录号3018，Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)皮下进行。随后的两次免疫使用不完全福氏佐剂（目录号3016， Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)腹膜内进行。最后一次免疫后 10 天，脸 颊抽血并在直接ELISA中针对PGLYRP1测试血清。
[0250] 实施例8 :可溶性TREM-1与PGLYRP1的结合 验证新的蛋白-蛋白相互作用的一个常规方法是通过使用重组试剂重建相互作用。 为此，表达具有信号传导糖基磷脂酰肌醇（GPI)结构的翻译后添加的C末端表位的重组人 PGLYRP1。包含末端GPI结构的蛋白靶向在质膜上展示。此通常应用的技术允许其它可溶 性蛋白被展示并通过流式细胞技术测试结合。在图4a中，HEK-2936E细胞用p⑶NA 3. 1/ zeo(+) hPGLYRPl-GPI (SEQ IDNO: 7)转染，3 ygDNA 稀释入 100 μ? 的Optimem (目 录号 31985062，Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。将4μ1 的 293fectin (目录 号 51-0031, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)添加到 100 μ 1 的Optimem (目录 号 31985062, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)并在 22°C孵育 5 分钟。合并 DNA/ Optimem混合物和293fectin/0ptimem混合物并在室温下孵育额外20分钟。HEK-2936E细 胞在 Freestyle 培养基（目录号 12338, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中以 le6/ml 稀释到 3 ml 并铺板在 6 孔皿中（目录号 35-3046, Biosciences San Jose, CA, USA)并且然后将DNA/293fectin混合物逐滴添加到细胞。细胞在37°C摇动孵育48小时。 1 μ g/ml 的人 TREM-l-G4Sx3-TREM-l/Fc6mut (SEQ ID NO: 2)稀释到 PBS/2%FBS 中并且将 50μ1探针添加到圆底96孔板（目录号3799, Costar, Lowell, MA, USA)中的80, 000个 转染的HEK293-6E细胞中。细胞在4°C孵育1小时，随后用200 μ 1 PBS/2%FBS洗涤2次。 添加50 μ? 1 yg/ml PE 山羊抗人 Fc (目录号 109-116-098，Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA，USA)，并孵育额外1小时随后用PBS/2%FBS洗涤2次。细胞在1:1 PBS 稀释的BDCytofix (目录号 554655，BDBiosciences, San Jose, CA, USA)中固定5分钟， 并且孵育5分钟随后用200 μ 1 PBS/2%FBS洗涤。细胞重悬在100 μ 1 PBS/2%FBS中然后在 FACS LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA)上分析。此实验的结果显示在图4a中，其 中未染色的细胞通过黑实线显示（G03)。模拟转染细胞的TREM-l-G4Sx3-TREM-l/Fc6mut染 色显示为虚线，并且显示相对未染色的细胞无结合。最终，用人PGLYRP1-GPI转染的细胞强 力结合TREM-l-G4S X3-TREM-l/Fc6mut，其用点线显示。结合的定量表示为平均荧光强度， MFI。
[0251] 除了流式细胞术，通常还通过测量表面等离子共振（SPR)评价蛋白-蛋白相互作 用。使用 BiacoreT200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)设备分析人 TREM-1 和人 PGLYRP1之间并且还有人PGLYRP1和超声的可溶性大肠杆菌肽聚糖（目录号tlrl-ksspgn, Invivogen, SanDiego, CA, USA)之间的相互作用。所有测定以20-30 yL/分钟的流速 在 IX HBS-P 运行缓冲液（目录号 BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 中在25°C进行。
[0252] 在图4B中，按照制造商推荐的方法将4641. 1 RU的人TREM-1四聚体（SEQ ID NO: 2)胺偶联到 Biacore CM5 芯片（目录号 BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)。在存在或不存在10 yg/mL可溶性大肠杆菌肽聚糖（目录号 tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, USA)的情况下，将PGLYRP1 (目录号 2590-PG, R&D Systems, Minneapolis, USA)在 IX HBS-P 运行缓冲液（目录号 BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)中稀释到150 nM,并注射经过TREM-1表面。数据相 对活化的和封闭的(用乙醇胺）参考表面进行参考扣除。尽管在存在和不存在PGN的情况 下，PGLYRP1均结合TREM-1，但当PGLYRP1被PGN交联时，似乎存在显著的亲合力效应。
[0253] 在图 4C 中，将 274. 8 RU 的 PGLYRP1 二聚体（SEQ ID NO: 1)胺偶联到 Biacore CM5 芯片（目录号 BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ)。可溶性 大肠杆菌肽聚糖（目录号 tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, USA)在 IX HBS-P 运行缓冲液中（目录号 BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)稀释到 10 μ g/mL，并注射经过PGLYRP1表面。数据相对活化的和封闭的(用乙醇胺）参考表面进行参 考扣除。
[0254] 在图4D中，使用与图4C相同的芯片（274. 8 RU的PGLYRP1二聚体，（SEQ ID NO: 1)。将 TREM-1 二聚体（SEQ ID NO: 8)在 IX HBS-P 运行缓冲液中（BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)稀释到150nM,并且在重复注射肽聚糖（图4B中描述） 之前和之后注射。数据相对活化的和封闭的(用乙醇胺）参考表面进行参考扣除，并且也扣 除缓冲液空白注射的信号。TREM-1显示清楚地结合固定化的PGLYRP1。可溶性TREM-1二 聚体类似地结合单独的固定化的PGLYRP1或结合已加载PGN的PGLYRP1。表面固定化的 TREM-1受体被可溶性PGLYRP1和PGN的总体结合由对被来自高度交联的PGLYRP1的亲和力 效应增强的PGLYRP1:TREM-1复合物的适度亲和力组成。
[0255] 实施例9 :TREM-1_应答被重组PGLYRP1的活化 为了测试是否重组PGLYRP1可以活化TREM-1应答，将BWZ/ hTREM-Ι报道基因细胞系 接种到黑96孔板并在存在或不存在的l(^g/mlPGN的情况下用重组人PGLYRP1 (目录号 2590-PG-050, R&D Systems: Minneapolis, MN)刺激。TREM-1 活化在培养 24 小时后使 用 BetaGlo 试剂（目录号 E4720，Promega, Madison, WI, USA)读出并且使用来自 Perkin Elmer的TopCount发光计数器测量发光。如图5a所示，TREM-1报道基因细胞系用PGLYRP1 刺激在存在PGN的情况下诱导剂量依赖性的TREM-1的活化。测试了几种不同的PGN，包括 PGN-EC (来自大肠杆菌）、PGN_SA (来自金黄色葡萄球菌(51· atfreiAs))和PGN-BS (来自枯 草芽抱杆菌(汉 San Diego, CA, USA)，并且均能够促进PGLYRP1 诱导的TREM-1应答。
[0256] 重组PGLYRP1诱导的应答可以通过添加重组TREM-1-Fc-融合蛋白（SEQ ID N0: 2)抑制（图5b)，或通过添加多克隆抗PGLYRP1抗体（目录号AF-2590，R&DSystems: Minneapolis, MN, USA)抑制，证实PGLYRP1是TREM-1配体并且可溶性TREM-1和抗 PGLYRP1潜在地可用作TREM-1拮抗剂。
[0257] 实施例10 :来自PGLYRP1刺激的Ml巨噬细胞的TNF- α释放 单核细胞分化成Ml巨噬细胞并用PGLYRP1复合物刺激，导致在两个不同的供体中的 TNF-α释放。
[0258] 本领域技术人员将认识到建立冷冻库收集来自多个供体的原代细胞从而提供方 便的实验重复的价值。如下从外周血单核细胞产生体外衍生的巨噬细胞。使用Rosette Sep 试剂盒（目录号 15068 Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada)按照制造商的 指导从获自 Research Blood Components (Brighton, MA, USA)的外周血 "leukopak" 分 离负富集的单核细胞。分离的单核细胞悬浮在50e6细胞/ml的10% DMS0/FBS等分试样中 并逐渐冷却到_80°C。为了产生巨噬细胞，在37°C水浴中快速融化一瓶或多瓶冻存小瓶的 单核细胞，用具有 10% FBS(目录号 03-600-511，Themo Fisher, Waltham MA, USA)的生 长培养基 RPMI 1640 (目录号 72400-047, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)稀 释到10ml并在250g离心5分钟。细胞在补充50 ng/ml人MCSF (目录号PHC9501, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)的生长培养基中悬浮至2e6个细胞/ml,置入组织培养 物处理的佩特里式（petri style)组织培养板并放入加湿的培养箱，设置维持5% C02,2%02 的"低氧"气氛。在培养的第三天，将细胞饲喂添加等体积的补充有50 ng/ml人MCSF生长 培养基。培养6天后，所述单核细胞已分化成M0巨噬细胞。通过将培养基换成补充有50 ng/ml 人 IFNg (目录号，PHC4031, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)(对于 Ml 巨噬细胞）或 40 ng/ml 人 IL-4 (目录号 PHC0045, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)(对于M2巨噬细胞)的生长培养基并放回培养箱额外22小时，使MO细胞进一步分化。 在第7天，巨噬细胞合适地分化用于生物测定中。简而言之，通过用lx PBS随后是PBS中 的5mM EDTA洗涤，将巨噬细胞从培养板回收。然后将板放回37°C 30分钟，并且将细胞使用 l〇ml注射器和22G针头从板上"强力洗下（power washed)"。然后将细胞稀释到生长培养 基中，在250g离心5分钟，之后将细胞沉淀悬浮到le6/ml的终浓度。
[0259] 如上制备的巨噬细胞用在生物测定中，其中通过ELISA在条件培养基中测量应答 于用TREM-1配体刺激细胞产生的细胞因子例如TNF-α。进一步利用这样的生物测定来测 量通过TREM-1特异性抗体的TREM-1配体刺激的阻断。在生长培养基中以4X浓度制备TREM 配体或阴性对照，并且将50微升/孔添加到96孔微量滴定板中。TREM-1配体的终浓度由 7.5ng/ml重组人PGLYRP1(如实施例5所述生成)和3Pg/ml PGN-BS (目录号，tlrl-pgnbs, Invivogen, SanDiego CA, USA)组成。如上述在加湿低氧条件下培养细胞22小时，之后 收集条件培养基并且按照制造商的指导（目录号DY210, R&D Systems, Minneapolis MN, USA)通过ELISA测量TNF-α水平。
【权利要求】
1. 抗体或其片段，其能够特异性结合PGLYRP1并降低PGLYRP1介导的TREM-1活性。
2. 根据权利要求1的抗体或其片段，其能够特异性结合SEQ ID NO: 37 (l_ 1.0PGLYRP1)和 / 或 SEQ IDNO: 38< IlM 1.0PGLYRP1}。
3. 根据权利要求1-2中任一项的抗体，其能够与抗体1F10、抗体1F36 (mAb 0182)、抗 体1F95、抗体1F105 (mAb 0184)、抗体2F5和/或抗体2F7竞争结合PGLYRP1。
4. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 15的氨基酸残 基31至35 (SVWMN}的CDRH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基 取代；和/或对应SEQ ID NO: 15的氨基酸50至66 _HPSDSETRLNQKFKD)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 15的氨基酸残基98至108 (DYSDYDGFAY]}的CDRH3序列，其中所述氨基酸残基的一 个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
5. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 19的氨基酸残基 31至35 (DYNMY)的CDRH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代； 和/或对应SEQ ID NO: 19的氨基酸50至66《YIDPYNGDTSYNQKFKG)的CDRH2序列，其 中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 19的氨基酸残基99至109 (GDYGNPFYLDY)的CDRH3序列，其中所述氨基酸残基的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
6. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 23的氨基酸残基 31至35《DTYIH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代； 和 / 或 SEQ ID NO: 23 的氨基酸 50 至 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的 CDRH2 序列，其中所 述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或SEQ ID NO: 23的氨基 酸残基99至108 (SDNSDSWFAY)的CDRH3序列,其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个 可以被不同的氨基酸取代。
7. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 27的氨基酸残 基31至35 (DYNMH)的CDRH1序列，其中所述氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取 代；和/或对应SEQ ID NO: 27的氨基酸50至66《YVDPYDGGTSSNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 27的氨基酸残基99至106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸残基的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
8. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 31的氨基酸残基 31至35 (DYYMY)的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代； 和/或对应SEQ ID NO: 31的氨基酸50至66《AfSDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序列，其 中这些氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 31的氨基酸残基99至109 (GGYGNLYAMDY)的CDRH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、 两个或三个可以被不同的氨基酸取代。
9. 根据权利要求1-3中任一项的抗体，其重链包含：对应SEQ ID NO: 35的氨基酸残基 31至35 (NYVMH)的CDRH1序列，其中这些氨基酸残基之一可以被不同的氨基酸残基取代； 和/或对应SEQ ID NO: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN》的CDRH2序列，其 中这些氨基酸的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸残基取代；和/或对应SEQ ID NO: 35的氨基酸残基99至109 (SGFITTL1ED+Y丨的⑶RH3序列，其中这些氨基酸残基的一个、两 个或三个可以被不同的氨基酸取代。
10. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID NO: 16的氨基酸 残基24至34 {RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 16的氨基酸残基51至56 <ASQS丨S丨的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 16的氨基酸残基89至97《QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸残基的一 个或两个可以用不同的氨基酸取代。
11. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID NO: 20的氨基酸 残基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 20的氨基酸残基49至55 {DTSKLPS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 20的氨基酸残基88至96 (QQWTSNPPT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸残基的一 个或两个可以用不同的氨基酸取代。
12. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其轻链包含：对应SEQ ID NO: 24的氨基酸 残基24至33《SVSSSVNFMN)的CDRL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 24的氨基酸残基49至55 (DTSKLAP)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 24的氨基酸残基88至96 (HQWSSYSLT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸残基的一 个或两个可以用不同的氨基酸取代。
13. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其进一步包含：对应SEQ ID NO: 28的氨基酸 残基24至33 (VASSSVTYMY丨的⑶RL1序列，其中所述氨基酸残基的一个、两个或三个可 以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 28的氨基酸残基49至54 {TOPLAS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 28的氨基酸残基87至95 (PHWNTNPPT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸残基的一 个或两个可以用不同的氨基酸取代。
14. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其进一步包含：对应SEQ ID NO: 32的氨基酸 残基24至35 (TASSSVSSSYLH)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个 可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 32的氨基酸残基51-57 (STSNLAS)的 CDRL2序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 32的氨基酸残基90-98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一个 或两个可以用不同的氨基酸取代。
15. 根据权利要求4-9中任一项的抗体，其进一步包含：对应SEQ ID NO: 36的氨基酸 残基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个或三个可 以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 36的氨基酸残基50至56 (GASNRYT)的 CDRL2序列，其中这些氨基酸残基的一个或两个可以用不同的氨基酸取代；和/或对应SEQ ID NO: 36的氨基酸残基89至96 iGQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中这些氨基酸残基的一 个或两个可以用不同的氨基酸取代。
16.根据权利要求1-15中任一项的抗体，其用作药物。
【文档编号】A61K39/395GK104203977SQ201280069905
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年2月15日
【发明者】V.W.斯坦尼科, C.B.里德, J.奎珀, X.唐, M.海佩, S.A.乔斯 申请人:诺和诺德A/S（股份有限公司）