新型寡核苷酸缀合物及其应用的制作方法

新型寡核苷酸缀合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于治疗疾病(特别是癌症)的双链RNA结构体及其制备方法，一种利用所述RNA结构体以靶向特异性方式递送双螺旋寡RNA的技术，所述双链RNA结构包括共价结合到双螺旋寡RNA以提高双螺旋寡RNA的递送的聚合物化合物，并且进一步包括结合的靶向特异性配体。由结合有配体的双螺旋寡RNA组成的纳米颗粒能够将双螺旋寡RNA有效递送至靶标，从而即使以相对较低的浓度施用双螺旋寡RNA时，也可显示双螺旋寡RNA的活性。此外，可防止双螺旋寡RNA被非特异性递送到其他器官和细胞中。因此，结合有配体的双链RNA结构体可用于治疗多种疾病，特别是癌症，并且还可被有效地用于新型的双螺旋寡RNA递送体系。特别地，结合有配体的双链RNA结构体可被有效地用于治疗包括癌症和感染性疾病的疾病。此外，本发明涉及一种杂化缀合物，一种制备所述杂化缀合物和由所述缀合物组成的纳米颗粒的方法，所述杂化缀合物包括通过简单的共价键与反义寡核苷酸(ASO)的两端结合以提高ASO的体内稳定性的亲水性材料和疏水性材料。根据本发明的ASO-聚合物缀合物可提高ASO的体内稳定性，能够有效递送治疗性ASO进入细胞。此外，即使以相对较低的浓度施用ASO-聚合物缀合物时，也可显示ASO的活性。
【专利说明】新型寡核苷酸缀合物及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于治疗癌症和感染性疾病的新型寡核苷酸结构体，该结构体中 结合有提高单链寡核苷酸或双链寡核苷酸递送的亲水性材料和疏水性材料，本发明还涉及 该新型寡核苷酸结构体的应用。
[0002] 本发明的第一方面涉及一种包括与包含在该结构体中的亲水性材料结合的靶特 异性配体的双螺旋寡RNA结构体，一种由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体组成的纳米颗 粒，一种包括所述RNA结构体的药物组合物，一种包括由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体 组成的纳米颗粒的药物组合物，一种制备所述结构体的方法，一种制备由所述RNA结构体 组成的纳米颗粒的方法和一种递送结合有配体的双螺旋寡RNA结构体的技术。
[0003] 本发明的第二方面涉及一种反义寡核苷酸（以下简称"AS0"）缀合物，所述ASO缀 合物包括通过简单的共价键或连接分子介导的共价键结合到ASO的两端以提高ASO的细胞 内递送效率的亲水性材料和疏水性材料，一种制备所述缀合物的方法以及一种递送由ASO 缀合物组成的纳米颗粒的技术。

【背景技术】
[0004] 自从发现了 RNA千扰（以下简称"RNAi"）的作用，人们发现RNAi在多种哺乳动 物细胞上序列特异性地作用于 mRNA(Silence of the transcripts:RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83:764 - 773)。当长的双链RNA被递送到细胞中时，所递 送的RNA被核酸内切酶dicer加工为21-23个碱基对（bp)的小分子干扰RNA(以下简称 " SiRNA")。siRNA结合RISC (RNA诱导的沉默复合体）并通过反义链识别和降解靶mRNA的过 程以序列特异的方式抑制靶基因的表达（NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS:BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery.2002.I,503-514)"
[0005] Bertrand等人报道了与针对相同靶基因的反义寡核苷酸（ASO)相比，siRNA对 mRNA的体内和体外表达具有优异的抑制作用，并且效果持久（Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296:1000-1004)。此外，由于siRNA与靶mRNA互补地结合从而以序列特异性 的方式来调控靶基因的表达，因此与传统的基于抗体的药物或化学物质（小分子药物）相 I：匕，siRNA可有利地用在广泛的应用范围中（Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. Molecular Therapy. 200613(4):664-670)。
[0006] SiRNA具有优异的效果并且可有利地用在广泛的应用范围中，但为了将SiRNA开 发为细胞治疗剂，需要提高siRNA的稳定性和细胞内递送效率，以便将siRNA有效地递送到 革巴细胞中（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov. Today. 2006Jan ；11 (1-2) :67-73) 〇
[0007] 为了满足这些要求，已使用了抗核酸酶类似物或诸如病毒载体、脂质体或纳米颗 粒这样的载体。
[0008] 诸如腺病毒或逆转录病毒的病毒载体具有高转染效率，但是伴随有免疫原性和致 癌性的风险。然而，与病毒载体相比，包括纳米颗粒的非病毒载体被评价为具有较低的细 胞内递送效率，但具有以下优点，包括：体内安全性高、靶特异性递送、RNAi寡核苷酸高效 摄入并内化进入细胞或组织、低细胞毒性和免疫刺激。因此，这些非病毒载体被认为是有 效抑制祀基因表达的最有前景的递送方法（Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo.J. Clin Invest. 2007December3 ；117(12):3623 - 3632)0
[0009] 已开发了具有各种纳米颗粒的递送体系用于肿瘤特异性递送。这种纳米颗粒体系 通常被设计为表面包被有亲水性材料以增加血液中的循环时间，并带有正电荷以增加内吞 作用（Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews60(2008) 1615 - 1626)。同时，与正常组织不同，肿瘤组 织非常坚硬且具有扩散限制，由于该扩散限制对肿瘤所需的营养物以及诸如氧气和二氧化 碳之类的废物的迁移具有不利影响，因而通过血管新生在周围区域形成血管来克服该扩散 限制。通过血管新生在肿瘤组织中形成的血管具有渗漏的且有缺陷的血管，根据肿瘤的类 型不同，该血管包括尺寸从约IOOntn至2um范围内的间隙。
[0010] 因此，与正常组织的结构化的毛细血管相比，纳米颗粒更容易穿过具有渗漏的且 有缺陷的血管的肿瘤组织的毛细血管内皮细胞，这样纳米颗粒在血液中循环时很容易地 被递送。此外，肿瘤组织无淋巴引流，因而药物在其中积累。这种机制被称为增强的渗透 和滞留（EPR)效应。由于这种效应，纳米颗粒易于特异性地被递送到肿瘤组织中，而这种 机制被称为被动革巴向（Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol Oncol. 2008Jan-Feb ;26(I) :57-64)。
[0011] 为了克服体内分布、靶向的非特异性以及包括抗癌药物的治疗药物的水溶性缺 乏，已进行了各种研究来优化载有治疗药物的纳米颗粒的尺寸或对表面进行修饰以增加它 们在血液中的循环时间。特别地，针对包括聚合物-药物缀合物的聚合物纳米颗粒，已进行 了各种研究来通过将抗癌药物与水溶性的、可生物降解的材料（诸如白蛋白、聚-L-谷氨 酸（PGA)或N-(2-羟丙基）_甲基丙烯酰胺共聚物）连接而提高抗癌药物的肿瘤特异性递 送（Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res2008 ； 14:1310-1316)。此外，已进行了各种研究来将两亲性材料与抗癌药物连接，以形成由抗癌 药物的疏水性核和亲水性壳组成的聚合物胶束（Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. J Control Release2001;74:295-302)〇
[0012] 因此，当疏水性材料被额外地结合到诸如抗癌药物的治疗药物以增加核的内聚力 时，即使在低浓度下也可以形成胶束，并且由于壳的亲水性材料而可以形成稳定性增加的 聚合物胶束。通过可生物降解的键在两端结合有疏水性材料和亲水性材料的治疗药物可形 成改良的聚合物胶束，从而能够将治疗药物稳定地递送到目标癌组织中。
[0013] 近来，作为递送双链寡RNA结构体的技术，开发了基于结合到核酸末端的材料特 性而形成的自组装纳米颗粒SAMiRNA技术（韩国专利公开No. 2009-0042297)。SAMiRNA是 由双链寡RNA结构体组成的自组装纳米颗粒，所述双链寡RNA结构体结合有提高双链寡RNA 的递送的亲水性材料和疏水性材料，用于形成SAMiRNA的技术可以是用于提高双链寡RNA 的细胞内递送的技术。
[0014] 研究发现，当将标记有荧光标签的SAMiRNA施用到肿瘤异种移植小鼠模型的尾部 静脉时，纳米颗粒通过上述被动靶向被特异性地递送到肿瘤中（参见图2)。
[0015] 同时，主动靶向利用其中结合有靶向部分的纳米颗粒。据报道，靶向部分导致纳 米颗粒在祀组织中优先积累或提高纳米颗粒内化进入祀细胞（Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 20080ct ; 26 (10):552-8. Epub2008Aug21)。
[0016] 主动靶向是指采用诸如抗体或配体的靶向部分与纳米颗粒结合来提高纳米颗粒 向靶细胞的递送。近年来，已进行了各种研究以采用与SiRNA结合的各种靶向部分将siRNA 定位到所需组织。
[0017] 例如，研究发现，结合有a-生育酚的siRNA在体内被有效地、稳定地递送并通过 RNA 干扰来抑制耙基因的表达（Kazutaka Nishina et al., The American Society of Gene therapy，2008, 16(4) : 734-740)。此外，研究表明，与主要用于递送siRNA的细胞穿透肽 (CCP)相比，结合有胆固醇的siRNA被更有效地递送到肝组织中（US-20060014289 ;Moschos S. A. et al., Bioconjug. Chem. 18:1450-1459)。据报道，引起递送效果的原因不仅是肿瘤组 织的特异性，还有被所结合的靶向部分定向的细胞的特异性。
[0018] 主动靶向利用能够结合对靶细胞表面特异性的或在靶细胞表面上过表达的碳水 化合物、受体或抗原的材料（Nanotechnology in cancer therapeutics:bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther2006;5(8) :1909-1917)。因此，结 合有主动靶向部分的纳米颗粒在血液中循环时通过被动靶向在肿瘤组织中积累，并且通过 靶向部分促进纳米颗粒向靶细胞的递送，从而提高了被递送到细胞中的药物的治疗效果。 作为靶向部分，主要采用配体或抗体。靶向部分与它在细胞表面上的受体以高亲和力和特 异性结合并通过受体介导的内吞作用（RME)促进纳米颗粒的内化（Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis(RME) of proteins and peptides ruse of RME as a drug delivery system. J Control Releasel996;39:191-200)。
[0019] 由该配体或抗体靶向的细胞表面受体或抗原的特征在于它对靶细胞是特异性的 或在靶细胞中过表达，以便于靶向配体的进入，从而提高内吞作用率。此外，受体或抗原 将其中结合有配体的纳米颗粒递送到细胞中，并循环回到细胞表面（Receptor-mediated endocytosis:An overview of a dynamic process. J. Biosci. , Oct. 1984, 6 (4), pp.535-54 2.)。肿瘤靶向部分是这样的材料，其特异性地结合在靶细胞系中特异性地表达的受体（如 表皮生长因子或低密度脂蛋白受体），或结合已知在各种肿瘤细胞的表面上过表达的肿瘤 特异性受体（如叶酸受体）（Nanotechnology in cancer therapeutics:bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther2006,5 (8):1909-1917)〇
[0020] 如果靶向部分（特别是通过受体介导的内吞作用（RME)来提高内化的受体特异性 配体）与SAMiRNA结合，则可有效地促进SAMiRNA递送到靶细胞（特别是肿瘤细胞）中，因 此SAMiRNA即使在相对低的浓度和剂量下也可被递送到靶细胞中，这样双链寡RNA可显示 出较高的活性，并且可抑制双链寡RNA向其他器官和细胞非特异性递送。
[0021] 此外，SAMiRNA形成技术不仅可应用于双链寡RNA,而且也可应用于单链寡核苷 酸，特别是用于治疗目的的单链反义寡核苷酸（ASO)。
[0022] ASO技术是通过采用单链RNA或DNA改变mRNA的代谢来控制信息从基因到蛋白质 的传递的技术。换句话说，ASO技术是采用选定的与蛋白质互补地并特异性地杂交的核苷酸 序列来优先抑制目的蛋白质表达的技术。由于ASO以序列特异性的方式与靶基因结合，因 而不会影响除了靶基因之外的基因的表达。因此，ASO技术可作为有用的工具来分析特异性 蛋白质的体内作用，并且还可用于针对特定疾病的基因治疗（FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995)。
[0023] 近年来，开发了一种新型的单链反义寡核苷酸--antagomir，并已将其用于抑 制细胞中niicroRNA的功能。已知antagomir或microRNA抑制剂（miRNA抑制剂）是互补 地结合耙microRNA以抑制microRNA功能的化学合成的短RNA。antagomir优选地具有诸 如2'甲氧基或硫代磷酸酯这样的修饰的化学结构，以防止antagomir的降解。目前，抑 制与包括癌症、心脏和肺纤维化在内的多种疾病相关的miRNA功能的antagomir是已知 的（"Silencing of microRNAs in vivo with'antagomirs'"Nature，Dec. 2005,438(706 8):685-689 ;〃MicroRNAs as Therapeutic Targets"New England J. Medicine, 2006,354 (11) :1194-1195 ;Meister G.et al.，"Sequence-specific inhibition of microRNA-and siRNA-induced RNA silencing"RNA, Mar. 2004, 10(3):544-550)。
[0024] 反义DNA与靶mRNA结合以形成RNA/DNA双链，所述RNA/DNA双链在体内被RNase H(-种特异性地降解其中形成有RNA/DNA杂化双链的mRNA的核糖核酸酶）降解。反义RNA 形成RNA/RNA双链，并且靶mRNA的降解是由RNase L诱导的。RNase L是优先降解双链RNA 周围的单链 RNA 的核糖核酸酶（Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376, 1992)。
[0025] 然而，包括miRNA抑制剂antagomir的ASO应被有效地递送到祀细胞中以达到所 需效果，并且ASO在血液中可被核糖核酸酶降解。因此，为了将ASO用于治疗目的，ASO缀 合物应被有效地递送通过细胞膜，并应确保ASO在体内的稳定性（Shigeru Kawakami and Mitsuru HashidajDrug Metab. Pharmacokinet. 22(3):142-151, 2007)〇
[0026] 因此，为了体内稳定性，大多数ASO呈通过提供核酸酶抗性的各种修饰而获得的 寡聚脱氧核苷酸（ODN)的形式。所述修饰可以是在一个或多个核苷酸的糖部分的2'碳位置 的-OH基被-CH 3 (甲基）、-〇CH3、-NH2、-F(氟）、-0-2-甲氧乙基、-0-丙基、-0-2-甲硫基乙 基、-0-3-氨基丙基、-0-3-二甲基氨基丙基、-0-N-甲基乙酰氨基或-0-二甲基羟氨基乙基 取代；核苷酸的糖部分的氧被硫取代；将核苷酸之间的键修饰为硫代磷酸酯键、磷酸硼键 或甲基膦酸酯键；或以上一种或多种修饰的组合；或修饰为PNA(肽核酸）或LNA(锁核酸） 的形式（参见 Crooke et al_，Ann. Rev. Med.Vol. 55: pp61-652004，US5, 660, 985, US5, 958， 691, US6, 531, 584, US5, 808, 023, US6, 326, 358, US6, 175, OOlBraasch D. A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003 ；Chiu Y. L. et al. , RNA, 9 : 1034-1048, 2003 ； Amarzguioui M. et al. , Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003) 〇
[0027]为了将ASO递送到靶细胞中，发展了利用诸如腺病毒或逆转录病毒之类的病毒的 基因递送技术和利用诸如脂质体、阳离子型脂质或阳离子型聚合物之类的非病毒载体的基 因递送技术。然而，病毒载体在安全性方面存在问题，这是因为不能确保这些载体在整合到 宿主染色体之后不会造成宿主基因的正常功能的异常，或不会激活癌基因。此外，如果病 毒基因即使以低水平持续表达而导致自身免疫性疾病或如果病毒载体引起改性病毒感染， ASO也不能被有效地递送。
[0028]为克服这些问题，已研究了将基因融合到非病毒载体脂质体的方法或采用阳离子 型脂质或阳离子型聚合物的方法来克服上述缺点。虽然这些非病毒载体不及病毒载体有 效，但是它们具有以下优点：它们在体内安全、副作用较少并且可以以低成本生产（Lehrman S_ Nature. 401(6753):517-518, 1999)。
[0029]为了有效地实现采用非病毒载体稳定递送包括ASO的ODN分子，需要一种有效的 防止酶促降解或非酶促降解的方法。因此，提出了通过化学修饰ASO来使得ASO对核酸 酶稳定并增加ASO的细胞内吸收的方法（Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3):142-151，2007)。
[0030] 同时，包括TOG(聚乙二醇）的聚合物通过它们之间的相互作用自发形成具有胶束 结构的复合物，这些复合物被称为聚合物复合胶束（Kataoka K.et al. Macromolecules，29 :8556-8557, 1996)。这些聚合物复合胶束的优点在于相比于诸如微球体或纳米颗粒的其他 药物递送体系，它们具有非常小的尺寸同时其分布非常均勻，并且它们是自发形成的，使得 容易控制制剂的质量并确保再现性。
[0031] 近年来，为了增加ASO的细胞内递送效率，发展了通过简单的共价键或连接分子 介导的共价键将亲水性材料（如生物相容性聚合物PEG)与ASO结合来确保ASO的稳定性 并使ASO有效渗透通过细胞膜的技术（韩国专利登记No. 0466254)。然而，仅通过化学修饰 和聚乙二醇化难以实现提高ASO的体内稳定性并确保ASO有效递送到靶组织中。
[0032] 如上所述，发展了通过将疏水性材料和亲水性材料引入SiRNA而获得的纳米颗粒 来提高siRNA的细胞内递送的SAMiRNA技术，但是尚未报道将该技术应用到ASO的递送。因 此，需要开发一种ASO递送体系及其制备方法，通过将各种化学修饰引入ASO并将各种聚合 物与ASO缀合以保护ASO不受酶的影响，从而使ASO的稳定性增加并有效渗透通过细胞膜。


【发明内容】

[0033] 根据本发明的第一方面：
[0034] 本发明的一个目的在于提供一种治疗药物结构体、一种由所述治疗药物结构体组 成的纳米颗粒及其制备方法，所述治疗药物结构体包括亲水性材料和疏水性材料，所述亲 水性材料和疏水性材料是通过简单的共价键或连接分子介导的共价键结合治疗药物的两 末端以提高治疗药物的细胞内递送效率的生物相容性的聚合物化合物，所述治疗药物结构 体进一步包括与亲水性材料结合的配体。
[0035] 本发明的另一个目的在于提供一种双螺旋寡RNA结构体，其包括通过简单的键或 连接分子介导的共价键结合双螺旋寡RNA的两末端以提高双螺旋寡RNA的细胞内递送效率 的生物相容性的亲水性聚合物材料和疏水性聚合物材料，所述双螺旋寡RNA结构体进一步 包括与亲水性材料结合的受体特异性配体，所述受体特异性配体具有通过受体介导的内吞 作用（ME)来提高靶细胞（特别是肿瘤细胞）的内化的特性；一种由结合有配体的双螺旋 寡RNA结构体组成的纳米颗粒；和一种药物组合物，所述药物组合物包括结合有配体的双 螺旋寡RNA结构体或者包括由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体组成的纳米颗粒。
[0036] 本发明的再另一目的是提供一种制备结合有配体的双螺旋寡RNA结构体的方法 和制备包括由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体组成的纳米颗粒的方法，和一种采用结合 有配体的双螺旋寡RNA结构体来递送双螺旋寡RNA的技术。
[0037] 当靶特异性配体与双螺旋寡RNA结构体结合时，由结合有配体的双螺旋寡RNA结 构体组成的纳米颗粒可被有效地递送到靶细胞中。因此，即使当以相对较低的浓度施用结 合有配体的双螺旋寡RNA结构体时，也可在靶细胞中展现双螺旋寡RNA的活性。此外，由于 结合的配体可防止双螺旋寡RNA被非特异性地递送到其他器官和细胞中，因而结合有配体 的双螺旋寡RNA结构体可用于治疗多种疾病且还可被有效地用于新型的双螺旋寡RNA递送 体系。特别地，结合有配体的双螺旋寡RNA结构体可被有效地用于治疗包括癌症和感染性 疾病的疾病。
[0038] 根据本发明的第二方面： 、、
[0039] 本发明的一个目的在于提供一种ASO-聚合物缀合物及其制备方法，所述AS0一聚 合物缀合物包括通过简单的共价键或连接分子介导的共价键结合… 0的两端以提高AS0的 细胞内递送效率的生物相容性的亲水性聚合物材料和疏水性聚合物材料。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种利用由ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒来 递送ASO的技术和一种药物组合物，所述药物组合物包括ASO-聚合物缀合物或者包括由 ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒。
[0041] 根据本发明的ASO-聚合物缀合物和由AS0-聚合物缀合物组成的纳米颗粒可提 高ASO的体内稳定性，使得能够有效地将治疗药物ASO递送到细胞中。此外，即使在没有转 染剂的情况下，相比于末端未修饰的AS0,它们也可在相对低的浓度下展现ASO的活性。因 此，ASO-聚合物缀合物和由ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒可用于治疗包括癌症和感 染性疾病的多种疾病，并且还可在基础生物工程研究和医药工业中被非常有效地用于新型 的ASO递送体系。

【专利附图】

【附图说明】
[0042] 图1是由结合有配体的双螺旋寡RNA结构组成的纳米颗粒（SAMiRNA)的示意图。
[0043] 图2示出了 SAMiRNA的肿瘤特异性递送。图2 (A)是示出在将Cy5_ 5标记的SAMiRNA 以5mg/kg体重的剂量施用到肿瘤移植的小鼠的尾部静脉一次之后，SAMiRNA随时间的生物 分布的照片（由红色虚线标示的部分是肿瘤移植部分）。图2(B)是在施用SAMiRNA之后 48小时收集的各组织的活体外（ ex vivo)照片。
[0044] 图3示出了 1，3, 4, 6-四乙酰基-NAG(化合物A)的NMR分析结果。 1H 匪R(3QQMHz，DMS0-D6) ;S7.89ppm(lH，d，J = 9.3Hz)，5.64ppm(lH，d，J = 8. 7Hz), 5. 27ppm (1H, d, J = 3. 3Hz), 5. 07ppm (1H, dd, J = 11.7,3. 6Hz), 4. 22ppm (1H, t, J = 6. 3Hz), 4. 14-3. 96ppm(2H, m), 2. 12ppm(3H, s), 2. 04ppm(3H, s), I. 99ppm(3H, s), I. 91 (3H, s ),I. 78ppm (3H, s)。
[0045] 图4示出了 3, 4, 6-三乙酰基-I-六（乙二醇）-N-乙酰半乳糖胺（NAG)(化合物B) 的NMR分析结果。1H NMR(300MHz, DMSO-D6) ; S 7. 71ppm(lH, d, J = 9. 3Hz), 5_ 21ppm(lH, d, J =3. 0Hz), 4. 97ppm(lH, dd, J = 11. I, 3. 0Hz), 4. 56ppm(lH, d, J = 8. 7Hz), 3. 88ppm(lH, q, J =8. 7Hz), 3. 83-3. 74ppm(lH, m), 3. 62-3. 39ppm(25H, m), 2. IOppm (3H, s), 2. Olppm(3H, s), I .89ppm(3H, s), I. 77ppm(3H, s) 〇
[0046] 图5示出了 I-六（乙二醇）-NAG-亚磷酰胺（化合物C)的NMR分析结 果。（A)1H NMR(300MHz，DMS0-D6) ;S7. 78ppm(lH, d, J = 9_3Hz)，5. 21ppm(lH，d，J = 3. 0Hz), 4. 97ppm(lH, dd, J = 11. I, 3. 6Hz), 4. 56ppm(lH, d, J = 8. 1Hz), 3. 88ppm(lH, d, J =9. 0Hz), 3. 81-3. 41ppm(30H, m), 2. 89ppm(2H, t, J = 5. 7Hz), 2. IIppm(3H, s), 2. 00 ppm(3H, s), 1_ 89ppm(3H, s), I. 77ppm(3H, s), I. 20-1. 12ppm(12H，m)，（B)31P NMR 数据 (121MHz，DMSO-D6) ; S 147. 32ppm。
[0047] 图6示出了制备单链RNA的过程。
[0048]图7示出了制备包括结合到双螺旋寡RNA的5'端的PEG的双螺旋寡RNA结构体 的过程和所述RNA结构体的分析结果。图7 (A)示出了利用PEG-亚磷酰胺将PEG结合到双 螺旋寡RNA的过程，图7(B)示出了 5'端未修饰的单链RNA(21聚体）的MALDI-TOF MS分 析结果（8￡0 10购:1;1^6662.1)，图7(〇示出了在5，端结合有？￡0的单链1?嫩(21聚体） 的 MALDI-TOF MS 分析结果（SEQ ID NO: I ;MW6662. 1)。
[0049] 图8示出了制备单-NAG-PEG-RNA结构体的过程和该结构体的分析结果。图8 (A) 示出了利用N-乙酰半乳糖胺-亚磷酰胺将N-乙酰半乳糖胺（NAG)结合到PEG-RNA的过程， 图8 (B)示出了 NAG-PEG-RNA结构体（蓝色，MW9171. 2)的MALDI-TOF MS分析结果，该结构 体包括与PER-RNA(绿色，MW8624. 1)结合的N-乙酰半乳糖胺，并示出了中央峰移动了 N-乙 酰半乳糖胺的分子量（MW547)。
[0050] 图9示出了制备三-NAG-PEG-RNA结构体的过程和该结构体的分析结果。图9 (A) 示出了采用树枝状聚合物亚磷酰胺和NAG-亚磷酰胺将N-乙酰半乳糖胺结合到PEG-RNA的 过程，图9(B)示出了 PEG-RNA结构体（绿色，MW8624. 1)的MALDI-TOF MS分析结果，以及 包括结合有N-乙酰半乳糖胺的单-NAG-PEG结构体（蓝色，MW9171. 2)和三-NAG-PEG-RNA 结构体（红色，Mff 10630)的MALDI-TOF MS分析结果。
[0051] 图1〇示出了制备5'叶酸-PEG-RNA结构体的过程和该结构体的分析结果。图 10(A)示出了通过NHS-叶酸将叶酸结合到PEG-RNA的过程，图10(B)示出了 PEG-RNA(绿 色，MW8624. 1)和叶酸-PEG-RNA结构体（蓝色，MW9277.8)的MALDI-TOF MS分析结果，并示 出了中央峰移动了叶酸的分子量（MW615)。
[0052] 图11示出了 5' C24-RNA结构体的分析结果。图Il(A)示出了与SEQ ID NO: 1互 补的单链RNA(MW7349. 5)的MALDI-TOF MS分析结果，图Il(B)示出了与SEQ ID NO: 1互补 的 5' C24-RNA 结构体（MW7830. 2)的 MALDI-TOF MS 分析结果。
[0053] 图12示出了通过胺基-CPG制备3' CPG-胺基-PEG-RNA结构体的过程。
[0054] 图13示出了通过胺基-CPG制备3' CPG-胺基-PEG-RNA-C24结构体的过程。
[0055] 图14示出了制备3'叶酸-PEG-RNA结构体的过程和该结构体的分析结果。图 14⑷示出了通过NHS-叶酸将叶酸结合到3'胺基-PEG-RNA结构体的过程；图14⑶示出 了 3' 叶酸-PEG-RNA 结构体（SEQ ID NO: I ;MW9277. 7)的 MALDI-TOF MS 分析结果。
[0056] 图15示出了由5'叶酸-RNA-聚合物结构体组成的纳米颗粒（叶酸-SAMiRNA)的 物理性质的分析结果。图15(A)是示出叶酸-SAMiRNA的尺寸和多分散指数（PDI)的图表， 图15(B)是示出叶酸-SAMiRNA的临界胶束浓度的图表。
[0057] 图16示出了叶酸-SAMiRNA对过表达叶酸受体的细胞系中的靶基因的表达的抑制 效果。在用叶酸-SAMiRNA和SAMiRNA处理之后48小时通过qPCR测量过表达叶酸受体的 肿瘤细胞系KB中的靶基因mRNA的水平。在图16中，培养基中不含叶酸：无叶酸的条件； 培养基中含叶酸：包含过量（ImM)叶酸的条件；Con:用由包括序列SEQ ID N0:2(对照序 列）的双螺旋寡RNA-聚合物结构体组成的纳米颗粒SAMiRNA-Con处理的试验组；SAM :用 由包括序列SEQ ID NO: 1 (存活蛋白序列）的双螺旋寡RNA-聚合物结构体组成的纳米颗粒 SAMiRNA-Sur处理的试验组；叶酸-SAM :用由包括序列SEQ ID NO: 1 (存活蛋白序列）并结 合有叶酸配体的叶酸-双链寡RNA结构体组成的纳米颗粒叶酸-SAMiRNA-Sur处理的试验 组。
[0058] 图17示出了叶酸-SAMiRNA对肿瘤组织中的靶基因表达的抑制效果。在将SAMiRNA 和叶酸-SAMiRNA各以5mg/kg体重的剂量施用到具有由过表达叶酸受体的KB肿瘤细胞系 组成的肿瘤的小鼠尾部静脉一次之后48小时或72小时，通过qPCR测量肿瘤组织中的靶基 因（存活蛋白）的mRNA水平。在图17中，PBS :阴性对照；SAMiRNA :施用由包括序列SEQ ID NO: 1 (存活蛋白序列）并且未结合叶酸配体的双螺旋寡RNA-聚合物结构体组成的纳米 颗粒SAMiRNA-Sur的组；叶酸-SAMiRNA:施用结合有叶酸配体的SEQ ID NO: 1(存活蛋白序 列）的纳米颗粒叶酸-SAMiRNA-Sur的组。
[0059] 图18是包括ASO-聚合物缀合物的纳米颗粒的示意图。
[0060] 图19示出了根据本发明的ASO和ASO-聚合物缀合物各自的MALDI-TOF MS谱。四 种核苷酸在两末端（5'端和3'端）处用2-0CH3(甲氧基）修饰，"m"表示OCH 3C甲氧基） 基团。图19(A)示出了 ASO(M.W. 5967. 9Da)的MALDI-TOF数据，图19⑶示出了 ASO-聚合 物缀合物（M. W. 8448Da)的 MALDI-T0F 数据。
[0061] 图20示出了由ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒的物理性质的分析结果。图 20(A)是示出由ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒的尺寸和多分散指数（PDI)的图表；图 20(B)是示出由ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒的临界胶束浓度的图表。
[0062] 图21示出了在不同处理浓度（10nM、50nM和IOOnM)下，mRNA表达水平的分析结 果，以检验ASO和AS0-聚合物缀合物对肿瘤细胞中的靶基因表达的抑制效果。加扰：序列 SEQ ID NO: 4 (对照序列）的ASO ;存活蛋白：序列SEQ ID NO: 3 (存活蛋白序列）的ASO ; ASO :未结合材料的ASO ;AS0-聚合物缀合物：呈3' PEG-AS0-5'脂质形式的ASO-聚合物缀 合物。
[0063] 用于实施本发明的最佳实施方式
[0064] 1?本发明的第一方面
[0065] 在本发明的第一方面中，术语"反义链"是指在RISC (RNA诱导的沉默复合体）中 表现出RNAi活性以结合并降解靶mRNA的链，术语"有义链"是指具有与反义链互补的序列 的链。
[0066] 如在此使用的，术语"互补的"或"互补结合"是指两序列彼此结合以形成双链结 构。不仅包括两序列之间的完全匹配，还包括两序列之间的错配。
[0067] 本发明提供一种具有下式1的结构并且结合有配体的治疗药物_聚合物结构体：
[0068] A 1
[0069] L-A-X-R-Y-B
[0070] 其中A是亲水性材料；B是疏水性材料；X和Y各自独立地为简单的共价键或连接 分子介导的共价键；R是治疗药物；L是具有通过受体介导的内吞作用（RME)来提高靶细胞 的内化特性的受体特异性配体。
[0071] 在这里，治疗药物可选自抗癌药物、双螺旋寡RNA、抗病毒药物、留体类抗炎药 (SAID)、非留体类抗炎药（NSAID)、抗生素、抗真菌剂、维生素、激素、视黄酸、前列腺素、前列 腺环素、抗代谢剂、微生物（micotics)、胆碱激动剂、肾上腺素拮抗剂、抗惊厥药、抗焦虑药、 镇静剂、抗抑郁药、麻醉剂、镇痛剂、合成代谢类固醇、雌激素、黄体酮、粘多糖、多核苷酸、免 疫抑制剂和免疫刺激剂。
[0072]在本发明中，治疗药物优选为双螺旋寡RNA或抗癌药物。如果治疗药物是双螺旋 寡RNA，则亲水性材料可结合到双螺旋寡RNA的3'端或5'端。 -
[0073]在本发明的结合有配体的治疗药物-聚合物结构体中，配体可额外地结合到与双 螺旋寡RNA或抗癌药物结合的亲水性材料的特定位置（特别是末端）。配体可选自祀受体特 异性抗体、能够以高亲和力和特异性结合到靶分子的单链核酸（DNA、RNA或修饰的核酸）、 肽或化学物质，所述化学物质包括叶酸（在此使用的术语"叶酸"是指在自然界或人体中有 活性的叶酸）、N-乙酰半乳糖胺（NAG)和甘露糖，配体具有通过RME与受体彳寺异^地结合以 提高靶细胞的内化的特性。在这里，配体是以靶受体特异性方式执行递送的物质,且并不仅 仅限于上述抗体、适体、肽和化学物质。
[0074] 双螺旋寡RNA优选由19-31个核苷酸组成。本发明中使用的双螺旋寡m可以是 针对任何用于或可用于基因治疗或基因研究的基因的任何双螺旋寡_。
[0075] 疏水性材料通过疏水相互作用形成由双螺旋寡RNA结构体组成的纳米颗粒。在 疏水性材料中，碳链或胆固醇非常适合用于制备本发明的结构体，因为在合成双螺旋寡RNA 的步骤中，碳链或胆固醇可以很容易地结合。
[0076] 疏水性材料优选具有250-1，OOO的分子量。特别地，本发明中使用的疏水性材料 可以是类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C5tl不饱和烃或饱和烃、二酰基 磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺或类似材料，但并不限于此，对本领域技术人员显而易见 的是，可以使用适于本发明的目的的任何疏水性材料。
[0077]特别地，类固醇衍生物可选自由胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆留烯基甲酸酯、胆甾烷 基甲酸酯和胆留烷基胺构成的组，甘油酯衍生物可选自甘油单酯、甘油二脂和甘油三酯，其 中甘油酯的脂肪酸可以是C12-C5。不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸。
[0078] 此外，亲水性材料优选地为具有200-10, 000的分子量的阳离子聚合物或非离子 型聚合物，更优选地为具有1，000-2, 000的分子量的非离子型聚合物。例如，本发明中使用 的亲水性材料优选为诸如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚恶唑啉的非离子型亲水性聚合物 化合物，但不限于此。
[0079] 必要时，可对亲水性材料进行修饰以具有结合到配体所需的官能团。在亲水性材 料中，特别是聚乙二醇（PEG)可具有多种分子量和官能团，具有良好的生物相容性，不诱导 免疫反应，提高双螺旋寡RNA的体内稳定性，并提高RNA的递送效率，因此非常适于制备本 发明的双螺旋寡RNA结构体。
[OOSO] 对介导共价键的连接分子没有特别限制，只要在亲水性材料（或疏水性材料）与 双螺旋寡RNA的末端之间形成共价键，并提供在必要时可在特定环境中被降解的键。因此， 连接分子可包括在制备所述结构的过程中将亲水性材料（或疏水性材料）结合到双螺旋寡 RNA的任何化合物。
[0081] 此外，共价键可以是不可降解的键或可降解的键。在这里，不可降解的键包括但不 限于酰胺键或磷酸键，可降解的键包括但不限于二硫键、可酸降解的键、酯键、酐键、可生物 降解的键或酶促降解的键。
[0082] 本发明提供一种由下式2表示的缀合有配体的双螺旋寡RNA结构体，所述结构体 包括结合到双螺旋寡RNA的有义链的3'端的亲水性材料、结合到亲水性材料的配体和结合 到有义链的5'端的疏水性材料：
[0083] 式 2
[0084] B-X-5, S 3，- Y-A-L
[0085] AS
[0086] 其中A是亲水性材料;B是疏水性材料；X和Y各自独立地为简单的共价键或连接 分子介导的共价键；S是双螺旋寡RNA的有义链;AS是双螺旋寡RNA的反义链；L是具有通 过受体介导的内吞作用（RME)来提高靶细胞的内化特性的受体特异性配体。
[0087] 一种制备由式2表示的缀合有配体的双螺旋寡RNA结构体的方法包括以下步骤：
[0088] (1)在结合有官能团-亲水性材料的固相支持物上合成单链RNA ;
[0089] (2)将疏水性材料共价结合到结合有官能团-亲水性材料的单链RNA的5'端；
[0090] (4)将官能团-RNA-聚合物结构体和单独合成的互补的单链RNA与固相支持物分 离；
[0091] (5)通过官能团将配体结合到亲水性材料的末端；以及
[0092] (6)将结合有配体的RNA-聚合物结构体与互补的单链RNA退火以形成双链RNA结 构。
[0093] 在本发明的更优选的实施方式中，所述方法可包括以下步骤：（1)将亲水性材料 结合到结合有官能团的固相支持物（CPG)上；(2)在结合有官能团-亲水性材料的固相支 持物（CPG)上合成单链RNA ; (3)将疏水性材料共价结合到单链RNA的5'端；(4)将官能 团-RNA-聚合物结构体和单独合成的互补单链RNA与固相支持物（CPG)分离；(5)通过官能 团将配体结合到亲水性材料的末端以制备结合有配体的RNA-聚合物结构体；以及（6)将结 合有配体的RNA-聚合物结构体与互补的单链RNA退火，以形成结合有配体的双螺旋寡RNA 结构体。在步骤（6)之后，可通过高效液相色谱法（HPLC)将RNA-聚合物结构体和互补的 单链RNA从反应物中分离并纯化,然后通过MALDI-T0F质谱仪测量分子量以确定是否制备 了所需的RNA-聚合物结构体和_。在上述制备方法中，合成与在步骤⑶中合成的单链 RNA互补的单链RNA的步骤可在步骤（D之前执行或在步骤 （1)至（6)的任何一个步骤中 执行。
[0094]在另一个实施方式中，本发明提供了一种下式3表示的结合有配体的双螺旋寡 RNA结构体，所述结构体包括结合到双螺旋寡RM的有义链的5,端的亲水性材料、结合到亲 水性材料的配体和结合到有义链的3'端的疏水性材料：
[0095] 式 3
[0096] L-A-X-5, S 3，- Y-B
[0097] 3, AS 5，
[0098] -种制备由式3表示的结合有配体的双螺旋寡RNA结构体的方法包括以下步骤：
[00"] ⑴在结合有官能团的固相支持物上合成单链RNA ;
[0100] ⑵将亲水性材料共价结合到步骤⑴中所获得的材料；
[0101] (3)将配体共价结合到步骤⑵中所获得的材料；
[0102] (4)将步骤（3)中所获得的材料与固相支持物分离；
[0103] (5)通过结合到3'端的官能团将疏水性材料共价结合到从步骤（4)所得的材料. 以及 ^
[0104] (6)将从步骤（5)所得的材料与互补的单链RNA退火，以形成双链RNA结构体。
[0105]在更优选的实施方式中，所述制备方法可包括以下步骤：（1)在结合有官能团的 固相支持物（CPG)上合成单链RNA ; (2)将亲水性材料共价结合到单链RNA的5,端；(3)将 配体结合到与单链RNA结合的亲水性材料上以合成官能团-RNA-亲水性材料聚合物结构 体；(4)将官能团-RNA-亲水性材料聚合物结构体与固相支持物（CPG)分离；(5)经由官能 团将疏水性材料结合到RNA上以合成结合有配体的RNA-聚合物结构体；以及（6)将所制备 的RNA-聚合物结构体与互补的单链RNA退火，以制备双螺旋寡RNA-聚合物结构体。
[0106] 在步骤（5)之后，可通过高效液相色谱法（HPLC)将RNA从反应物中分离并纯化， 然后通过MALDI-TOF质谱仪测量分子量以确定是否制备了所需的RNA-聚合物结构体和 RNA。在上述制备方法中，合成与步骤（D中合成的单链RNA互补的单链RNA的步骤可在步 骤（1)之前执行或在步骤（1)至（6)的任何一个步骤中执行。
[0107] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种下式4表示的结合有配体的双螺旋寡 RNA结构体，所述结构体包括结合到双螺旋RNA的有义链和反义链的5'端的亲水性材料或 疏水性材料：
[0108] ^4
[0109] L-A-X-5，S 3，
[0110] 3, AS 5' -Y-B 其中A是亲水性材料；B是疏水性材料；X和Y各自独立地为简单的共价键或连接 分子介导的共价键；S是双螺旋寡RNA的有义链;AS是双螺旋寡RNA的反义链；L是具有通 过受体介导的内吞作用（RME)来提高靶细胞的内化特性的受体特异性配体。
[0112] -种制备由式4表示的双螺旋寡RNA结构体的方法包括以下步骤：
[0113] (1)在固相支持物上合成单链RNA ;
[0114] (2)将亲水性材料共价结合到单链RNA的5'端；
[0115] (3)将配体结合到与单链RNA结合的亲水性材料；
[0116] (4)将结合有配体的RNA-亲水性聚合物结构体和单独合成的互补的RNA-疏水性 聚合物结构体与固相支持物分离；以及
[0117] (5)将结合有配体的RNA-亲水性聚合物结构体与互补的RNA-疏水性聚合物结构 体退火，以形成双链结构。
[0118] 在步骤（1)至（4)之间，所述制备方法包括合成与步骤（1)的单链RNA互补的单 链RNA，然后将疏水性材料结合到合成的单链RNA，以合成单链RNA-疏水性聚合物结构体的 步骤。
[0119] 本发明还提供一种包括结合有配体的双螺旋寡RNA结构体的纳米颗粒和一种包 括结合有配体的治疗药物-聚合物结构体的纳米颗粒。
[0120] 纳米颗粒是通过本发明的结合有配体的双螺旋寡RNA结构体之间的相互作用而 形成的。具体地，纳米颗粒形成为具有以下结构：疏水性材料位于纳米颗粒的中心，双螺旋 寡RNA被外部的亲水性材料保护，配体位于纳米颗粒的表面上（参见图1)。纳米颗粒通过 配体将双螺旋寡RNA递送进入细胞，从而以提高的效率将RNA递送到细胞中。这种纳米颗 粒可用于治疗疾病。包括所述结构的纳米颗粒的结构合成和特征、细胞内递送效率和效果 将在以下实施例中进一步详细描述。
[0121] 本发明还提供一种利用由结合有配体的双螺旋寡RM结构体或结合有配体的治 疗药物-聚合物结构体组成的纳米颗粒的基因治疗方法。
[0122] 具体地，本发明提供一种治疗方法，包括以下步骤：制备由结合有配体的双螺旋寡 RNA结构体组成的纳米颗粒，并将纳米颗粒导入动物体内。
[0123] 本发明还提供一种包括药学上有效量的由结合有配体的双螺旋寡RNA结构体组 成的纳米颗粒的药物组合物。
[0124] 对于给药，除了上述活性成分，本发明的组合物可包括至少一种药学上可接受的 载体。本发明中可使用的药学上可接受的载体应当是与本发明的活性成分相容的，可以是 生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或以上两种 或更多种的混合物。此外，必要时,本发明的组合物可包括其他常规的添加剂，包括抗氧化 剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，本发明的组合物可借助于稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂 和润滑剂而被配制成诸如水溶液、悬浮液或乳液这样的可注射的形式。特别地，本发明的组 合物优选提供为冻干制剂。为了制备冻干制剂，可采用本领域已知的任何传统方法，还可添 加用于冷冻干燥的稳定剂。
[0125] 此外，本发明的组合物可根据疾病的种类或按照本领域已知方法或Remington' s pharmaceutical Science (Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州）中公开的方法的组分而 被配制成合适的剂型。
[0126] 本发明的药物组合物的剂量可由本领域的技术人员根据患者的病情和疾病的严 重程度来确定。此外，本发明的组合物可被配制成以下形式：粉剂、片剂、胶囊、液体、注射 液、软膏剂和糖浆剂，并且可以单位剂型或多剂型提供，例如密封的安瓿或药瓶。
[0127] 本发明的药物组合物可口服或非肠道给药。根据本发明的药物组合物可通过各种 途径给药，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、动脉注射、髓内给药、硬膜内给药、心内 注射、经皮给药、皮下注射、腹膜内给药、胃肠道给药、舌下给药和局部途径。
[0128] 针对这种临床给药，可采用本领域已知的技术将本发明的药物组合物配制成合适 的形式。本发明的组合物的剂量可随各种因素而变化，诸如患者的体重、年龄、性别、健康状 况和饮食、给药时间和给药方法、排泄率和疾病的严重程度，并且可由本领域的普通技术人 员很容易地确定。
[0129] 2.本发明的第二方面
[0130] 在第二方面中，本发明提供一种由下式5表示的AS0-聚合物缀合物：
[0131] ^5
[0132] A-X-R-Y-B
[0133] 其中A和B之一是亲水性材料，另一个是疏水性材料，X和Y各自独立地为简单的 共价键或连接分子介导的共价键，R是AS0。
[0134] 如在此使用的，术语"AS0"是指不仅包括传统的用于抑制mRNA表达的反义寡核苷 酸，而且包括抑制microRNA功能的antagomir。
[0135] 式5中的亲水性材料可连接有靶特异性配体。靶特异性配体具有通过受体介导的 内吞作用（RME)提高靶特异性内化的特性，靶特异性配体可选自靶特异性抗体或适体、肽 (如受体特异性配体）和化学物质（如叶酸、N-乙酰半乳糖胺（NAG)和甘露糖）。在这里，靶 向部分是以靶特异性方式执行递送的材料，并不仅仅限于上述抗体、适体、肽和化学物质。
[0136] 在本发明的缀合物中，ASO优选地包括10-5〇个寡核苷酸，更优选地包括丨 3-25个 寡核苷酸。
[0137]为了提髙体内稳定性，ASO包括通过提供核酸酶抗性的各种修饰获得的寡聚脱氧 核苷酸（ODN)。修饰可以选自以下一种取代或者两种或更多种取代的组合：在一个或更多 个核苷酸的糖部分的2'碳位置的-OH基被-CH 3 (甲基）、-〇CH3、-NH2、-F (氟）、-0-2-甲氧 乙基、-0-丙基、-0-2-甲硫基乙基、-〇_3_氨基丙基、-0-3-二甲基氨基丙基、-〇-N-甲基乙 酰氨基或-0-二甲基羟氨基乙基取代；核苷酸的糖部分的氧被硫取代；将核苷酸之间的键 修饰为硫代磷酸酯键、磷酸硼键或甲基膦酸酯键。或者，可修饰为 PNA (肽核酸）或LNA(锁 核酸）的形式。
[0138]可用在本发明中的ASO没有特别限制，可以是针对用于或可用于基因治疗或基因 研究的任何基因的AS0。
[0139]对本领域技术人员显而易见的是，本发明中使用的ASO不仅包括与耙mRNA完全匹 配的AS0,而且包括与靶mRNA错配的AS0,抑制mRNA的翻译。
[0140]亲水性材料优选具有2〇〇-10, 000的分子量，更优选具有丨，000-2, 〇〇〇的分子量。 此外，亲水性材料优选为阳离子型聚合物化合物或非离子型聚合物化合物。
[0141]例如，本发明中使用的亲水性聚合物化合物优选地为诸如PEG(聚乙二醇）、聚乙 烯吡咯烷酮或聚恶唑啉的非离子型亲水性聚合物化合物，但不限于此。
[0142]必要时，可对亲水性材料进行修饰以具有结合到其他材料所需的官能团。在亲水 性材料中，特别是聚乙二醇（PEG)可具有多种分子量和官能团，具有良好的生物相容性，不 诱导免疫反应，提高ASO的体内稳定性，并提高ASO的递送效率，因此非常适于制备本发明 的缀合物。
[0143] 此外，疏水性材料优选具有25〇_1，000的分子量。特别地，本发明中使用的疏水性 材料可优选为类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C5q不饱和烃或饱和烃、 二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺或类似材料，但并不限于此，对本领域技术人员显 而易见的是，可以使用适于本发明的目的的任何疏水性材料。
[0144] 特别地，类固醇衍生物可选自由胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾烯基甲酸酯、胆甾烷 基甲酸酯和胆留烷基胺构成的组，甘油酯衍生物可选自甘油单酯、甘油二脂和甘油三酯，其 中甘油酯的脂肪酸可以是C12-C 5tl不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸。
[0145] 疏水性材料通过疏水作用形成纳米颗粒。在疏水性材料中，特别地，碳链或胆固醇 非常适合用于制备本发明的缀合物，因为在制备ASO的步骤中碳链或胆固醇可以很容易地 结合。
[0146] 此外，式1中由X或Y表示的共价键可以是不可降解的键或可降解的键。在这里， 不可降解的键包括但不限于酰胺键或磷酸键，可降解的键包括但不限于二硫键、可酸降解 的键、酯键、酐键、可生物降解的键或酶促降解的键。
[0147] 根据本发明的ASO-聚合物缀合物可具有这样的结构：亲水性材料与ASO的5,端 和3'端之一结合，疏水性材料与另一端结合。
[0148] 一种制备在ASO的3'端结合有亲水性材料的ASO-聚合物缀合物的方法，
[0149] 其特征在于，可包括以下步骤：
[0150] (a)将亲水性材料共价结合到固相支持物上；
[0151] (b)在包括亲水性材料的固相支持物上合成ASO ;
[0152] (c)将疏水性材料共价结合到固相支持物上的ASO的5'端；以及
[0153] (d)从固相支持物分离并纯化所得的ASO-聚合物缀合物。 ^
[0154]在更优选的实施方式中，制备AS0-聚合物缀合物的方法包括以下步骤：将亲水性 材料共价结合到固相支持物（可控孔度玻璃（CPG))上；通过解封、偶联、封端和氧化在共价 结合有亲水性材料的固相支持物（CPG)上合成ASO ;以及将疏水性材料共价结合到固相支 持物上的ASO的5，端。在完成ASO-聚合物缀合物的制备之后，通过在6〇°C的水浴中用28% (v/v)氨处理ASO-聚合物缀合物，使ASO-聚合物缀合物与固相支持物（CPG)分离，可通过 高效液相色谱法（HPLC)将ASO-聚合物缀合物从反应物中分离并纯化，然后通过 malD1-Tof 质谱仪测量分子量以确定是否制备了所需的AS0-聚合物缀合物。
[0155]在另一方面，一种制备在ASO的5,端结合有亲水性材料的ASO-聚合物缀合物的 方法，
[0156] 其特征在于，包括以下步骤：
[0157] (a)在结合有官能团的固相支持物上合成ASO ;
[0158] (b)将亲水性材料共价结合到ASO的5'端；
[0159] (c)将结合亲水性材料的ASO缀合物与固相支持物分离；以及
[0160] (d)将疏水性材料共价结合到从固相支持物分离的ASO的3'端。
[0161] 在更优选的实施方式中，制备方法包括以下步骤：在结合有官能团的固相支持物 (CPG)上合成ASO ;将亲水性材料共价结合到ASO的5'端；在60°C的水浴中用28% (v/v) 氨处理所得的固相支持物，以将连接官能团的ASO-亲水性聚合物与固相支持物（CPG)分 离；以及将疏水性材料经由官能团连接到AS0,以形成在ASO的两端连接有亲水性材料和疏 水性材料的ASO-聚合物缀合物。当完成了 ASO-聚合物缀合物的制备时，可通过高效液相 色谱法（HPLC)将ASO-聚合物缀合物从反应物中分离并纯化，然后通过MLDI-TOF质谱仪 测量分子量以确定是否制备了所需的AS0-聚合物缀合物。
[0162] 同时，ASO-聚合物缀合物可进一步包括结合到亲水性材料的配体。
[0163] 将配体结合到亲水性材料的方法是根据与配体连接的官能团的种类来确定的。例 如，以亚磷酰胺作为官能团的配体-亚磷酰胺可以按照与ASO合成过程相同的方式结合到 亲水性材料，连接有N-羟基丁二酰亚胺（NHS)的配体可通过N-羟基丁二酰亚胺（NHS)酯 键结合到亲水性材料。
[0164] 一种制备ASO-聚合物缀合物，所述ASO-聚合物缀合物包括与其连接的配体，并且 在ASO的3'端结合有亲水性材料，
[0165] 其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0166] (a)将亲水性材料结合到连接有官能团的固相支持物上；
[0167] (b)在结合有官能团-亲水性材料的固相支持物上合成ASO ;
[0168] (c)将疏水性材料共价结合到ASO的5'端；
[0169] (d)将步骤（C)中获得的ASO-聚合物缀合物与固相支持物分离；以及
[0170] (e)将配体结合到从固相支持物分离的ASO-聚合物缀合物的亲水性材料。
[0171]在更优选的实施方式中，制备方法包括以下步骤：将亲水性聚合物结合到连接有 官能团的固相支持物上；在结合有官能团-亲水性材料的固相支持物（CPG)上合成ASO ; 将疏水性材料共价结合到ASO的端基;将所得的官能团-ASO-聚合物缀合物与固相支持物 (CPG)分离；以及通过官能团将配体连接到亲水性聚合物的末端，从而制备结合1配体的 ASO-聚合物缀合物。当完成了结合有配体的ASO-聚合物缀合物的制备时，可通过高效液相 色谱法（HPLC)将ASO-聚合物缀合物从反应物中分离并纯化，然后通过 maldU0f质谱仪 测量分子量以确定是否制备了所需的结合有配体的AS0-聚合物缀合物。
[0172] 在另一方面，一种制备AS0-聚合物缀合物，所述ASO-聚合物缀合物连接有配体， 并且在ASO的5'端结合有亲水性材料，
[0173] 其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0174] (a)在连接有官能团的固相支持物上合成ASO ;
[0175] (b)将亲水性材料共价结合到ASO的末端；
[0176] (c)将配体共价结合到AS0-亲水性材料缀合物；
[0177] (d)将连接有官能团的ASO-亲水性材料-配体缀合物与固相支持物分离；以及
[0178] (e)将疏水性材料共价结合到从固相支持物分离的缀合物的ASO的3'端。
[0179] 在更优选的实施方式中，制备方法包括以下步骤：在连接有官能团的固相支持物 (CPG)上合成ASO ;将亲水性材料共价结合到ASO的末端；将配体共价结合到AS0-亲水性聚 合物；将连接官能团的ASO-亲水性聚合物-配体缀合物与固相支持物（CPG);以及通过官 能团将疏水性材料连接到分离的缀合物，从而合成了在亲水性聚合物的相对端连接有疏水 性材料的结合有配体的AS0-聚合物缀合物。当完成了结合有配体的ASO-聚合物缀合物的 制备时，可通过高效液相色谱法（HPLC)将ASO-聚合物缀合物从反应物中分离并纯化，然后 通过MALDI-T0F质谱仪测量分子量以确定是否制备了所需的结合有配体的ASO-聚合物缀 合物。
[0180] 因此，本发明中合成的ASO-聚合物缀合物包括疏水性材料和亲水性材料，因而本 质上是两亲的。亲水性部分在体内通过与水分子相互作用（如氢键）而倾向于向外，疏水 性材料通过疏水性相互作用而倾向于向内，从而形成了热力学稳定的纳米颗粒。换句话说， 纳米颗粒形成为疏水性材料位于纳米颗粒的中心，而亲水性材料位于ASO的外侧以保护 AS0(参见图18)。如上所述形成的纳米颗粒提高了 ASO的细胞内递送并且可用于治疗疾病。 所述缀合物的合成及其特征、细胞内递送效率和效果将在以下实施例中进一步详细描述。
[0181] 此外，本发明提供一种基因治疗方法，包括以下步骤：制备由ASO-聚合物缀合物 组成的纳米颗粒；通过纳米颗粒在体外递送AS0。所述基因治疗方法并不仅仅限于体外应 用。
[0182] 本发明还提供一种包括药学上有效量的ASO-聚合物缀合物或由结合有配体的 ASO-聚合物缀合物组成的纳米颗粒的药物组合物。
[0183] 对于给药，除了上述活性成分，本发明的组合物可包括至少一种药学上可接受的 载体。本发明中可使用的药学上可接受的载体应当是与本发明的活性成分相容的，可以是 生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或以上两种 或更多种的混合物。此外，必要时，本发明的组合物可包括其他常规的添加剂，包括抗氧化 剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，本发明的组合物可借助于稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂 和润滑剂而被配制成诸如水溶液、悬浮液或乳液这样的可注射的形式。特别地，本发明的组 合物优选提供为冻干制剂。为了制备冻干制剂，可采用本领域已知的任何传统方法，还可添 加用于冷冻干燥的稳定剂。
[0184]此外，本发明的组合物可根据疾病的种类或按照本领域已知方法或Remington, s pharmaceutical Science (Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州）中公开的方法的组分而 被配制成合适的剂型。 z
[0185]本发明的药物组合物的剂量可由本领域的技术人员根据患者的病情和疾病的严 重程度来确定。此外，本发明的组合物可被配制成以下形式：粉剂、片剂、胶囊、液体、注射 液、软膏剂和糖浆剂,并且可以单位剂型或多剂型提供，例如密封的安瓿或药瓶'。为+进行 如上所述的临床给药，本发明的药物组合物可利用公知技术制备为适合的剂型。
[0186] 本发明的药物组合物可口服或非肠道给药。根据本发明的药物组合物可通过各种 途径给药，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、动脉注射、髓内给药、硬膜内给药、心内 注射、经皮给药、皮下注射、腹膜内给药、胃肠道给药、舌下给药和局部途径。本发明的组合 物的剂量可随各种因素而变化，诸如患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、给药时间和 给药方法、排泄率和疾病的严重程度，并且可由本领域的普通技术人员很容易地确定。 实施例
[0187] 以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员将显而易 见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明的范围。
[0188] 实施例1 :可神结合的配体材料的制备
[0189]为了制备结合有配体的双螺旋寡RNA结构体，制备可被结合到双螺旋寡Rna结构 体的配体材料。
[0190] 实施你h-h1-六（乙二醇）-N-乙酰半乳糖胺-亚磷酰胺试剂（仆.会物a. R fn C)的制备
[0191] 为了将N-乙酰半乳糖胺（NAG)结合到双螺旋寡RNA结构体，按以下反应流程1所 示制备1-六（乙二醇）-NAG-亚磷酰胺。
[0192] 反应流稆1
[0193]

【权利要求】
1. 一种治疗药物-聚合物结构体，所述治疗药物-聚合物结构体具有下式1的结构并 包括与之结合的配体： 式1 L-A-X-R-Y-B 其中A是亲水性材料；B是疏水性材料；X和Y各自彼此独立地为简单的共价键或连接 分子介导的共价键；R是治疗药物；以及L是具有通过受体介导的内吞作用（RME)来提高靶 细胞的内化的特性的受体特异性配体。
2. 如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述治疗药物是双螺旋寡RNA 或抗癌药物。
3. 如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述配体选自靶特异性抗体、 适体、肽和受体特异性化学物质，所述配体特异性结合靶标并执行受体介导的内吞作用 _)。
4. 如权利要求3所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述受体特异性化学物质选自 叶酸、N-乙酰半乳糖胺（NAG)和甘露糖。
5. 如权利要求2所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述双螺旋寡RNA由19-31个 核苷酸组成。
6. 如权利要求2所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述双螺旋寡RNA包括修 饰，所述修饰包括在一个或更多个核苷酸的糖部分的2'碳位置的-0H基被-CH 3(甲 基）、-OCH3、-NH2、 -F (氣）、甲氧乙基、丙基、甲硫基乙基、氛基丙 基、-0-3-二甲基氨基丙基、-0-N-甲基乙酰氨基或-0-二甲基羟氨基乙基取代；核苷酸的 糖部分的氧被硫取代；将核苷酸之间的键修饰为选自由硫代磷酸酯键、磷酸硼键和甲基膦 酸酯键之一或两种或更多种的组合；或修饰为PNA (肽核酸）或LNA (锁核酸）的形式。
7. 如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述疏水性材料具有 250-1,000的分子量。
8. 如权利要求7所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述疏水性材料选自由类固醇 衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C 12-C5(l不饱和烃或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、 脂肪酸、磷脂和脂多胺构成的组。
9. 如权利要求8所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述类固醇衍生物选自由胆固 醇、胆留烷醇、胆酸、胆留烯基甲酸酯、胆留烷基甲酸酯和胆留烷基胺构成的组。
10. 如权利要求8所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述甘油酯衍生物选自甘油单 酯、甘油二脂和甘油三酯。
11. 如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述亲水性材料具有 200-10,000的分子量。
12. 如权利要求11所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述亲水性材料选自由聚乙 二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚恶唑啉构成的组。
13. 如权利要求1所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述共价键是不可降解的键或 可降解的键。
14. 如权利要求13所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述不可降解的键是酰胺键 或磷酸键。
15. 如权利要求13所述的治疗药物-聚合物结构体，其中所述可降解的键选自由二硫 键、可酸降解的键、酯键、酐键、可生物降解的键或酶促降解的键构成的组。
16. -种制备配体缀合的双螺旋寡RNA结构体的方法，所述方法包括以下步骤： (1) 在结合有官能团-亲水性材料的固相支持物上合成单链RNA ; (2) 将疏水性材料共价结合到结合有所述官能团-亲水性材料的单链RNA的5'端； (4) 将官能团-RNA-聚合物结构体和单独合成的互补的单链RNA与固相支持物分离； (5) 通过官能团将配体结合到亲水性材料的末端；以及 (6) 将结合有配体的RNA-聚合物结构体与互补的单链RNA退火以形成双链RNA结构 体。
17. -种制备双螺旋寡RNA结构体的方法，所述方法包括以下步骤： (1) 在固相支持物上合成单链RNA ; (2) 将亲水性材料共价结合到单链RNA的5'端； (3) 将配体结合到与所述单链RNA结合的亲水性材料； (4) 将结合有配体的RNA-亲水性聚合物结构体和单独合成的互补的RNA-疏水性聚合 物结构体与固相支持物分离；以及 (5) 将结合有配体的RNA-亲水性聚合物结构体与互补的RNA-疏水性聚合物结构体退 火以形成双链结构， 其中所述制备方法在步骤（1)至（4)之间包括合成与步骤（1)的单链RNA互补的单链 RNA，然后将疏水性材料共价结合所合成的单链RNA以合成单链RNA-疏水性聚合物结构体 的步骤。
18. -种制备结合有配体的双螺旋寡RNA结构体的方法，所述方法包括以下步骤： (1) 在结合有官能团的固相支持物上合成单链RNA ; (2) 将亲水性材料共价结合到步骤（1)中所获得的材料； (3) 将配体共价结合到步骤（2)中所获得的材料； (4) 将步骤（3)中所获得的材料与固相支持物分离； (5) 通过结合到3'端的官能团，将疏水性材料共价结合到从步骤（4)所得的材料；以 及 (6) 将从步骤（5)所得的材料与互补的单链RNA退火以形成双链RNA结构体。
19. 一种纳米颗粒，包括如权利要求1至15中任一项所述的治疗药物-聚合物结构体。
20. -种药物组合物，包括如权利要求1至15中任一项所述的治疗药物-聚合物结构 体。
21. -种药物组合物，包括如权利要求19所述的纳米颗粒。
22. -种反义寡核苷酸（ASO)-聚合物缀合物，由下式5表示： 式5 A-X-R-Y-B 其中A和B的一个是亲水性材料，另一个是疏水性材料，X和Y各自彼此独立地为简单 的共价键或连接分子介导的共价键，R是ASO。
23. 如权利要求22所述的反义寡核苷酸（ASO)-聚合物缀合物，其中所述ASO由10-50 个核苷酸组成。
24. 如权利要求23所述的反义寡核苷酸（ASO)-聚合物缀合物，其中所述寡核苷酸包 括修饰，所述修饰包括在一个或更多个核苷酸的糖部分的2'碳位置的-0H基被-CH 3(甲 基）、-〇CH3、-NH2、-F (氣）、甲氧乙基、丙基、甲硫基乙基、氛基丙 基、-0-3-二甲基氨基丙基、-0-N-甲基乙酰氨基或-0-二甲基羟氨基乙基取代；核苷酸的 糖部分的氧被硫取代；将核苷酸之间的键修饰为选自由硫代磷酸酯键、磷酸硼键和甲基膦 酸酯键之一或两种或更多种的组合；或修饰为PNA (肽核酸）或LNA (锁核酸）的形式。
25. 如权利要求22所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述亲水性材料具 有200-10, 000的分子量。
26. 如权利要求25所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述亲水性材料选 自由聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚恶唑啉构成的组。
27. 如权利要求22所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述疏水性材料具 有250-1，000的分子量。
28. 如权利要求27所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述疏水性材料是 C12-C5(l烃或胆固醇。
29. 如权利要求22所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述共价键是不可 降解的键或可降解的键。
30. 如权利要求29所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述不可降解的键 是酰胺键或磷酸键。
31. 如权利要求29所述的反义寡核苷酸（AS0)-聚合物缀合物，其中所述可降解的键选 自由二硫键、可酸降解的键、酯键、酐键、可生物降解的键或酶促降解的键构成的组。
32. -种AS0-聚合物缀合物，包括结合到如权利要求22至31中任一项所述的AS0-聚 合物缀合物的亲水性材料的配体。
33. -种制备AS0-聚合物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 将亲水性材料共价结合到固相支持物上； (b) 在包括亲水性材料的固相支持物上合成AS0 ; (c) 将疏水性材料共价结合到固相支持物上的AS0的5'端；以及 (d) 从固相支持物分离并纯化所得的AS0-聚合物缀合物。
34. -种制备AS0-聚合物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 在结合有官能团的载体上合成AS0 ; (b) 将亲水性材料共价结合到所述AS0的5'端； (c) 将结合所述亲水性材料的AS0缀合物与所述载体分离；以及 (d) 将疏水性材料共价结合到从所述载体分离的所述AS0的3'端。
35. -种制备包括与之连接的配体的AS0-聚合物缀合物的方法，所述方法包括以下步 骤： (a) 将亲水性材料结合连接有官能团的固相支持物； (b) 在结合有官能团-亲水性材料的固相支持物上合成AS0 ; (c) 将疏水性材料共价结合到AS0的5'端； (d) 将步骤（c)中获得的AS0-聚合物缀合物与固相支持物分离；以及 (e) 将配体结合到从固相支持物分离的AS0-聚合物缀合物的亲水性材料。
36. -种制备包括与之连接的配体的ASO-聚合物缀合物的方法，所述方法包括以下步 骤： (a) 在连接有官能团的固相支持物上合成AS0; (b) 将亲水性材料共价结合到AS0的末端； (c) 将配体共价结合到AS0-亲水性材料缀合物； (d) 将连接有官能团的AS0-亲水性材料-配体缀合物与固相支持物分离；以及 (e) 将疏水性材料共价结合到从固相支持物分离的缀合物的AS0的3'端。
37. -种纳米颗粒，包括如权利要求22至31中任一项所述的AS0-聚合物缀合物。
38. -种纳米颗粒，包括如权利要求32的结合有配体的AS0-聚合物缀合物。
39. -种药物组合物，包括药学上有效量的如权利要求22至31中任一项所述的 AS0-聚合物缀合物。
40. -种药物组合物，包括药学上有效量的如权利要求37所述的纳米颗粒。
41. 一种药物组合物，包括药学上有效量的如权利要求32所述的结合有配体的AS0-聚 合物缀合物。
42. -种药物组合物，包括药学上有效量的如权利要求38所述的纳米颗粒。
【文档编号】A61K9/16GK104244987SQ201280069918
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】蔡济旭, 韩宝兰, 金韩娜, 朴翰浯, 尹坪伍, 金淳基, 郑光柱, 权泰宇, 崔锺德, 李三用, 郑恩贞 申请人:株式会社百奥尼