专利名称：一种耐热保护剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及活的微生物保存领域，具体涉及耐热保护剂及其应用。
背景技术：
病毒等生物活性物质及其相关制品的热敏感性一直是活疫苗长期保存的瓶颈。我国幅员辽阔，经济水平差异较大，运输、使用过程中疫苗短期暴露高温环境(甚至45°C以上) 的现象依然存在，所以对活疫苗的耐热性能提出了更高的要求。
耐热冻干保护剂考虑了活疫苗在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响。但是，现有耐热冻干保护剂仅能使活疫苗在2 8 °C条件下保存24个月，37 °C条件下保存30天。发明内容
本发明的目的是提供一种耐热保护剂，能够增强活疫苗的耐热性能。
本发明还提供耐热保护剂在制备活疫苗冻干粉中的应用，采用该耐热保护剂制备的活疫苗冻干粉在37°C保存2个月，15°C条件下保存24个月。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种耐热保护剂，按照质量百分含量由下列物质组成低聚糖40% 80%，氨基酸3% 12%，明胶3% 12%,酪蛋白水解物3% 12%，聚乙烯基吡咯烷酮3% 12%，甘油3% 12%,普鲁尼克-68 3%-12%ο
所述低聚糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖中的一种或两种以上的混合物。
所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和异亮氨酸中的一种或两种以上的混合物。
一种所述耐热保护剂在制备活疫苗冻干粉中的应用。
用溶剂溶解耐热保护剂，得到保护剂溶液；将保护剂溶液与活病毒液混合，得到活疫苗；将活疫苗进行冷冻干燥即得活疫苗冻干粉。
所述溶剂为无菌的生理盐水、注射用水、PBS缓冲液、TriS-HCl缓冲液或Hank’ s 液，所述耐热保护剂与溶剂的质量比为3:6 8。
所述保护剂溶 液与活病毒液按照质量比为1:0. 5 2混合。
所述活病毒液为鸡新城疫病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。
冷冻干燥的方法为将活疫苗在常压、温度为_40°C _65°C条件下保持2 6小时，在真空度为O.1 10. Ombar温度为-10°C 4°C条件下保持10 26小时，在真空度为O.01 5. Ombar温度为10°C 28°C条件下保持2 8小时。
本发明耐热保护剂，由于其成分及含量的合理搭配，使得活疫苗耐热、耐储存。耐热保护剂中的低聚糖能够置换毒囊膜或者细胞壁中的，让病毒处于休眠状态，降低病毒干燥和保存期的生命活动，进而大大加强其耐热性能。
采用本发明耐热保护剂制备的活疫苗冻干粉，避免了冰晶的形成，减少病毒囊膜或者细胞壁的物理损伤，使得活疫苗冻干粉在37°C保存2个月，15°C条件下保存24个月。
具体实施方式
下面通过实施例进一步解释本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1耐热保护剂的制备本实施例中如果无特殊说明，百分数均指重量百分含量。
其中，酪蛋白水解物购自ShanHai Richu Bioscience Co. · Ltd,批号 090901 ;聚乙烯基吡咯烷酮(K-30)购自国药集团化学试剂有限公司，批号F20111009 ;普鲁尼克68 (Pluronic F 68)购自上海生工生物有限公司，批号HJ0522B2012。
耐热保护剂I配方海藻糖68%，甘氨酸6%，明胶3%，酪蛋白水解物6%，聚乙烯基吡咯烷酮 6%，甘油5%，普鲁尼克686%。
耐热保护剂2配方海藻糖 38%，蔗糖 20%，精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和异亮氨酸各2%，明胶6%，酪蛋白水解物10%，聚乙烯基吡咯烷酮 3%，甘油3%，普鲁尼克6810 %。
耐热保护剂3配方海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖各15%，精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸各2%，明胶10%，酪蛋白水解物8%，聚乙烯基吡咯烷酮 4%，甘油8%，普鲁尼克684%。
耐热保护剂4配方鹿糖48%,精氨酸10%，明胶10%，酪蛋白水解物6%，聚乙烯基吡咯烷酮10%，甘油10%， 普鲁尼克68 6%。
耐热保护剂5配方乳糖77%，蛋氨酸2%，谷氨酸6%，明胶3%，酪蛋白水解物3%，聚乙烯基吡咯烷酮3%，甘油3%，普鲁尼克683%。
耐热保护剂6配方菊糖40%,谷氨酸和异亮氨酸各6%，明胶12%，酪蛋白水解物11%，聚乙烯基吡咯烷酮11%，甘油11%，普鲁尼克683%。
按照各耐热保护剂的配方称取各成分，获得耐热保护剂1-6。
实施例2 鸡新城疫活疫苗冻干粉的制备及其耐热性能 (O耐热保护剂的制备按实施例1方法制得耐热保护剂I 一 6。
( 2 )鸡新城疫病毒液(活病毒液)的准备由南京天邦生物科技有限 公司提供鸡新城疫病毒液。具体制备方法按照《兽用生物质量质量标准汇编》(2006-2008)相关要求，制备鸡新城疫病毒液(La Sota株)，每羽份病毒液病毒含量为107_%id5(i (鸡胚检验法)。
(3)鸡新城疫活疫苗冻干粉的制备 ①用溶剂溶解耐热保护剂，得到保护剂溶液；将耐热保护剂I与无菌注射用水按照质量比为3 7混合，待耐热保护剂I完全溶解后， 用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌，得到保护剂溶液1，4°C保存备用。
按照制备保护剂溶液I的方法，将耐热保护剂2-6，分别配制成相应的保护剂溶液。不同之处在于，保护剂溶液2中溶剂为无菌PBS缓冲液(pH7. 2)，耐热保护剂2与无菌 PBS缓冲液(pH7. 2)按照质量比为3 6 ;保护剂溶液3中的溶剂为无菌生理盐水，耐热保护剂3与无菌生理盐水按照质量比为3 8混合；保护剂溶液4和5的配制方法同保护剂溶液 2 ;保护剂溶液6的配制方法同保护剂溶液3。
PBS 缓冲液(ρΗ7· 2):将 8. 5g NaCl,3. 5g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 25g NaH2PO4 · 2H20 溶于蒸懼水，定容至1000ml。
咨保护剂溶液I — 6分别与鸡新城疫病毒液(活病毒液)混合，得到活疫苗I — 6。
其中活疫苗I中保护剂溶液I与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:1。活疫苗2中保护剂溶液2与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:0. 5。活疫苗3中保护剂溶液3与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:2。活疫苗4中保护剂溶液4与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:1.5。活疫苗5中保护剂溶液5与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:0. 5。活疫苗6中保护剂溶液6与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:2。
③将活疫苗I用真空冷冻干燥机按照下述方法进行干燥将活疫苗I在常压、温度为_40°C条件下保持2小时，在真空度为O.1mbar温度为_10°C条件下保持10小时，在真空度为O. Olmbar温度为10°C条件下保持2小时，即得鸡新城疫活疫苗冻干粉I。
将活疫苗2用真空冷冻干燥机按照下述方法进行干燥将活疫苗2在常压、温度为_65°C条件下保持6小时，在真空度为10. Ombar温度为4°C条件下保持26小时，在真空度为5. Ombar温度为28°C条件下保持8小时，即得鸡新城疫活疫苗冻干粉2。
将活疫苗3用真空冷冻干燥机按照下述方法进行干燥将活疫苗3在常压、温度为_52°C条件下保持4小时，在真空度为5. Ombar温度为_3°C条件下保持18小时，在真空度为2. 5mbar温度为20°C条件下保持5小时，即得鸡新城疫活疫苗冻干粉3。
按照活疫苗I的干燥方法，将活疫苗4干燥后得到鸡新城疫活疫苗冻干粉4。按照活疫苗2的干燥方法，将活疫苗5干燥后得到鸡新城疫活疫苗冻干粉5。按照活疫苗3的干燥方法，将活疫苗6干燥后得到鸡新城疫活疫苗冻干粉6。
对照疫苗A按照名称为“鸡新城疫活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用”、 专利号为ZL200510115162. O发明专利，实施例3中“A组试验疫苗”的制备方法。保护剂配方为明胶1. 2g，乳糖Sg，精氨酸lg，山梨醇4g，蒸馏水定容100ml，蒸汽灭菌后与鸡新城疫病毒液(活病毒液)的质量比为1:1混合，_30°C入箱，预冻在_45°C以下5小时后升温，曲线全程共计48小时，升华过程中真空度控制在IOmHg以下，冷凝器保持在_70°C，得到鸡新城疫活疫苗对照疫苗A。
(4)鸡新城疫活疫苗冻干粉耐热性能的比较按照《中国兽药典》(2010版)中鸡胚检测法检测鸡新城疫活疫苗冻干粉1-6和对照疫苗A在不同条件下保存后的毒价。
表I鸡新城疫活 疫苗冻干粉与对照疫苗A的比较
权利要求
1.一种耐热保护剂，按照质量百分含量由下列物质组成 低聚糖40% 80%， 氨基酸3% 12%， 明胶3% 12%, 酪蛋白水解物3% 12%， 聚乙烯基吡咯烷酮3% 12%， 甘油3% 12%, 普鲁尼克-68 3%-12%ο
2.根据权利要求1所述耐热保护剂，其特征在于所述低聚糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求2所述耐热保护剂，其特征在于所述氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和异亮氨酸中的一种或两种以上的混合物。
4.一种权利要求1 一 3之一所述耐热保护剂在制备活疫苗冻干粉中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于用溶剂溶解耐热保护剂，得到保护剂溶液；将保护剂溶液与活病毒液混合，得到活疫苗；将活疫苗进行冷冻干燥即得活疫苗冻干粉。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述溶剂为无菌的生理盐水、注射用水、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Hank’ s液，所述耐热保护剂与溶剂的质量比为3:6 8。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于所述保护剂溶液与活病毒液按照质量比为1:0. 5 2混合。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述活病毒液为鸡新城疫病毒液或猪繁殖与呼吸综合征病毒液。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于冷冻干燥的方法为将活疫苗在常压、温度为-40°C _65°C条件下保持2 6小时，在真空度为O.1 10. Ombar温度为-10°C 4°C条件下保持10 26小时，在真空度为O. 01 5. Ombar温度为I (TC 28 °C条件下保持2 8小时。
全文摘要
本发明提供一种耐热保护剂及其应用，涉及活的微生物保存领域。所述耐热保护剂，由下列物质组成低聚糖40%～80%，氨基酸3%～12%，明胶3%～12%，酪蛋白水解物3%～12%，聚乙烯基吡咯烷酮3%～12%，甘油3%～12%，普鲁尼克-683%-12%。本发明还提供耐热保护剂在制备活疫苗冻干粉中的应用。用溶剂溶解耐热保护剂，得到保护剂溶液；将保护剂溶液与活病毒液混合，得到活疫苗；将活疫苗进行冷冻干燥即得活疫苗冻干粉。本发明耐热保护剂能提高活疫苗的耐热性能，采用该耐热保护剂制备的活疫苗冻干粉在37℃保存2个月，15℃条件下保存24个月。
文档编号A61K47/42GK103041399SQ20131000460
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月7日 优先权日2013年1月7日
发明者卢宇, 吕芳, 邓碧华, 张金秋, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院