专利名称：清热祛湿冲剂在制备防治手足口病中药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用配制品，具体涉含来自植物的未确定结构的药物制剂。
背景技术：
手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等， 个别重症患者儿病情进展快，已发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。手足口病的症状表现为急性起病，发热，手掌或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔黏膜出现散在的疱疹，疼痛明显。 部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。
手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道该病，1958年第一次分离出柯萨奇病毒，1959年提出并命名为手足口病。我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、安徽等10几个省份均有本病报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发，5-10月间发生了 7000余病例。 1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71。2008年HFMD疫情在安徽省阜阳市暴发，共发生HFMD病例4496例，死亡22例，其病原体为EV71。2010年全国报告1795336例患者，死亡888例，流行呈逐年增加的趋势，严重威胁着人类的健康和全球经济的发展。
引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型(EV71)和A组柯萨奇病毒(CoxA)、 埃可病毒(Echo)等某些血清型。EV71病毒颗粒为二十面体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24 30nm。病毒颗粒的衣壳共包括60个亚单位，分别由4种衣壳蛋白 (VP1-VP4)拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒颗粒外壳的内侧与病毒的核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于这三种蛋白上。病毒基因组为712 815kb核苷酸单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5'和3'非编码区，在 3'非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白。P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2 和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白，包括2A (特异性蛋白水解酶)、2B、2C、3A、VPg (5'蛋白水解酶)、3C (特异性蛋白水解酶)、3D (RNA多聚酶组分)。据推测，5'非编码区可能与病毒株的致病性有关。
目前防治手足口病的最有效手段是接种疫苗，但至今仍未开发出供临床应用的的手足口病病毒疫苗，从而加大了防治的难度。由于目前尚无特异、高效的抗病毒药物，对症处理是临床的主要治疗原则，利用更昔洛韦、病毒唑、干扰素进行抗病毒治疗，但最终还需靠人的自身免疫力治愈，且大多数的西药都可能导致严重的副作用。
清热祛湿冲剂(国药准字Z44020564)是一种治疗暑湿热病的中药制剂，其有效成分由以下原料药制成:党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g，苍术15g，野菊花75g，陈皮15g。该颗粒剂具有清热祛湿，益气生津的作用，用于暑湿病邪引起的四肢疲倦，食欲不振， 身热口干症状，对于治疗暑热、湿热有显著效果，但目前尚未有该清热祛湿冲剂有防治手足口病的报道。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供清热祛湿冲剂在制药中的新用途。
清热祛湿冲剂在制药中的新用途是
清热祛湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。 所述的清热祛湿冲剂为国家正式批准生产和上市的中成药，国药准字号为Z44020564，其每 IOOOg中所含的有效成分由以下原料制得
党参30g、茵陈45g、岗梅根75g、黄芪45g、苍术15g、野菊花75g和陈皮15g。
上述的清热祛湿冲剂可按代号为WS3-B-1841-94的部颁标准所规定的方法制备 (见中药成方制剂第九册第81页)，该方法的具体步骤为
取野菊花、苍术、陈皮加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量为50% ;药渣与党参，茵陈，岗梅根，黄芪四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次I小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥，喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成 lOOOg，即得。
本发明所涉及的清热祛湿冲剂除了具有治疗暑湿热病的作用外，还能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。当所述的清热祛湿冲剂用于防治手足口病时，其用法如下:每次10g， 一日3次，7天一个疗程；儿童每次5g，一日3次，7天一个疗程。
为了公众能更好地理解本发明的有益效果，下面将通过实施例和体外细胞实验进一步阐明。
图1为清热祛湿冲剂对RD细胞的细胞毒性示意图，该图是不同浓度药物加入到RD 细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对细胞生长的影响结果图。
图2为清热祛湿冲剂抗肠道病毒EV71的作用示意图，该图是不同浓度药物加入肠道病毒EV71侵染的RD细胞中培养60h后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对肠道病毒EV71抑制的影响结果图。
具体实施方式
I实验材料与方法
1.1细胞、病毒
RD细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，病毒EV71由广州市儿童医院中心实验室惠赠。
1. 2 药物
受试药物清热祛湿冲剂，广东众生药业股份有限公司，批号111203。所述受试药物按代号为WS3-B-1841-94的部颁标准生产(见中药成方制剂第九册第81页)，具体步骤组如下
(I)取野菊花75g、苍术15g和陈皮15g加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量约为50% ；
(2)药渣与党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次I小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥， 喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成lOOOg，即得。
对照药物利巴韦林注射液，由广州市白云山天心制药股份有限公司，批号 120201。
1. 3实验仪器
倒置显微镜(Nikon，型号TMS_F)、酶标仪(BI0-RAD，型号iMark)
2实验方法
2.1细胞培养
370C，5% (体积比，以下相同)CO2加湿培养箱中培养。使用含有10% (体积比，以下相同)FBS、100U/ml的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例 1/3-1/4。
2. 2病毒培养
接种EV71病毒200ul/孔于已经长满90%细胞的24孔板，置37°C，5%C02培养箱中，吸附lh，加入含1%FBS的维持液，次日换液，逐日观察，待3/4细胞出现病变时，放在_80°C冰箱中冻存20min,自然解冻20min,反复3次，13000rpm, IOmin, 4°C离心,过滤膜, 取上清液，每管O. 5ml分装于无菌离心管(1. 5ml)中，冷冻保存于_80°C备用。
2. 3TCID50肠道病毒EV71感染性的测定
2. 3.1TCID50 的测定
选择经24_48h培养后生长旺盛、成层良好的RD细胞细胞I瓶，倾弃生长液，加入Iml胰酶，37°C消化2-3min，用含10%FBS的DMEM生长液分散细胞，使细胞胞悬液浓度为2X IO4个/孔。用移液器将细胞悬液加入96孔板中，每孔IOOul。将培养板置于37°C， 5%C02温箱中培养12 18小时，待细胞长成单层后备用；将肠道病毒EV71用含1%FBS的维持液作10倍稀释系列成10个浓度，弃去培养板中的生长液，每孔加入不同稀释度的病毒液 IOOul，每个稀释度6孔。6个对照孔加入维持液IOOul，37°C吸附lh，然后各孔再加入维持液IOOul，轻轻摇匀，37°C，5%C02培养箱培养3天，逐日观察记录各孔细胞病变情况。
2. 3. 2结果统计
细胞全部出现CPE判为( ++++) ;50%_75%细胞出现CPE为(+++) ;25%_50%细胞出现CPE (++);25%以内细胞出现CPE为( + );无CPE为(一)。并根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算，最终获得TCID5(i/100微升；距离比=(高于50%病变率的百分数-50%) / (高于50%病变率的百分数-低于50%的病变率)LogTCID50 =距离比*稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，结果见表I。
表I肠道病毒EV71接种RD细胞的TCID5tl滴度统计
权利要求
1.清热怯湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用；所述的清热祛湿冲剂，每IOOOg中所含的有效成分由以下原料制得党参30g、茵陈45g、岗梅根75g、黄芪45g、苍术15g、野菊花75g和陈皮15g。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的清热祛湿冲剂的制备方法由以下步骤组成取野菊花、苍术和陈皮加水蒸馏，收集蒸馏液30ml，加入乙醇使含乙醇量为50% ;药渣与党参、茵陈、岗梅根和黄芪四味药，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次I小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩成稠膏，加蔗糖适量，混匀，制粒，干燥，喷入上述蒸馏后的乙醇溶液，制成 lOOOg，即得。
全文摘要
本发明涉及清热祛湿冲剂在制备防治EV71型肠道病毒感染引起的手足口病中药中的应用。所述的清热祛湿冲剂为国家正式批准生产和上市的中成药，其国药准字号为Z44020564，处方组成为党参30g，茵陈45g，岗梅根75g，黄芪45g，苍术15g，野菊花75g，陈皮15g。本发明所涉及的清热祛湿冲剂能抑制肠道病毒EV71在RD细胞上复制，减少RD细胞的病变，具有抗肠道病毒EV71的作用，用于防治手足口病的效果显著。
文档编号A61P31/14GK103054988SQ20131001130
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者李耿, 赖小平, 许仕杰, 姚海燕 申请人:东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院