Cthrc1蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及CTHRC1蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用。CTHRC1蛋白能有效地促进创面愈合，并可避免激素类药物的副作用。
【专利说明】CTHRC1蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及制药应用领域，更具体地说，本发明涉及CTHRCl蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]一般来说，创面是正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。也称为伤口或者创伤。
[0003]创面愈合过程可以分为止血期、炎症期、增生期和重塑期，它是机体固有的组织修复过程。
[0004]具体来说，止血期从创面形成的一瞬间开始，机体首先出现的反应是自身的止血过程。这一过程包括一些非常复杂的生物学反应:先是创面周围的小血管、毛细血管等反应性收缩使局部血流量减少，即之而来的是暴露的胶原纤维吸引血小板聚集形成血凝块；随后血小板释放血管活性物质如5-羟色胺及前列腺素等，使血管进一步收缩，血流减慢，同时释放的磷脂和ADP将吸引更多的血小板聚集。最后，内源性及外源性凝血过程也将被启动。凝血过程结束后，机体即开始进行创面的愈合。
[0005]炎症期开始自创面形成开始的前2-3天。由于局部血管的收缩，导致局部组织缺血，引起组织胺和其他血管活性物质的释放，使创面局部的血管扩张；同时，因坏死组织，以及可能的致病微生物的存在，引发机体的防御反应(炎症反应):免疫细胞如粒细胞和巨噬细胞向创面移动和集中。一方面，粒细胞防止或吞噬入侵的细菌，另一方面，巨噬细胞吞噬消化坏死的组织细胞碎片，同时，组织细胞破坏后释放出来的自身蛋白溶酶也可以消化溶解坏死的组织细胞碎片，使创面清洁，以便启动组织的修复过程。巨噬细胞除吞噬消化组织细胞碎片外，同时也是刺激成纤维细胞增殖分化，合成胶原蛋白的关键因素。这一过程也被称为清创阶段。同时，创面会反应性地出现收缩，以期减少创面面积。临床上因这一时期的创面大多被黑色的坏死组织所覆盖，因此也被称为黑色期。而当这一层坏死组织被清除后，创面仍会被一层薄薄的腐烂失活组织所覆盖，使创面外观呈黄色，因此临床上分期时常将此时的创面称为黄色期。
[0006]增生期开始自创面形成后的2-24天，上皮细胞再生创面修复首先是创面周缘健存的基底细胞开始增生，并向中心部位移行。与此同时，基底细胞的增殖刺激创面基底部毛细血管和结缔组织的反应性增生。当创面被新生的上皮细胞覆盖后，创面外观呈粉红色，故而又称此时的创面为粉红色期。肉芽组织形成随后，基底细胞的增生刺激肉芽组织的生长。同时，巨噬细胞释放的生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)，β转型生长因子(β-TGF)和α转型生长因子(α-TGF)等，加速肉芽组织的形成。肉芽组织的形成有着重要的生物学意义，主要表现在:(I)填补组织的缺损；(2)保护创面，防止细菌感染，减少出血；(3)机化血块和坏死组织及其他异物由于新生健康的肉芽组织外观呈鲜红色，因此，临床上又将此时的创面称之为红色期。随着肉牙组织的不断形成，创面组织的缺失被填充，上皮细胞便从创面周缘向中心移行，最终使得创面得以完全被再生的上皮细胞覆盖。
[0007]然而，当创面被再生的上皮细胞完全覆盖后，创面的愈合过程并没有完全结束。这就是创面的重塑期。因为新生的肉芽组织和上皮细胞还需要进一步分裂分化、转型，使其力量增强，才最后使创面得以完全愈合。这一过程主要表现在以下2个方面:
[0008](I)新形成的上皮细胞不断分裂，使表皮层增厚；(2)肉芽组织内部转型:形成的胶原纤维排列发生改变，使新生的结缔组织力量增加；同时，毛细血管数目减少，使创面局部颜色减退，接近于正常色。
[0009]正常的创面愈合需要全身和局部多种因素的协调，某些因素的不足或过度就可能造成病理性的创面愈合。延迟的创面愈合，包括难愈合创面就是对广大患者个人、家庭及社会造成严重影响的最常见病理性创面愈合类型。而这种情况的发生，主要是由于不正常的炎症和增生过程，其核心的一点是表皮的角质形成细胞不能及时覆盖创面。角质形成细胞及时覆盖创面，不但意味着创面渗出的停止，感染可能和营养丢失的缓解，还可以避免继发的过度瘢痕形成。因此，促进角质形成细胞的及时覆盖，是治疗创面的核心问题。
[0010]影响创面愈合的因素包括全身因素和局部因素。全身因素主要指年龄、性别、有无糖尿病、高血压、营养状况等，这些因素虽然重要，但往往难以干预，或者是仅能部分得到控制。因此，从改善局部因素着手，是治疗创面的一个更重要的方向。而局部因素中，创面微环境起到了重要作用。细胞外基质不仅是创面微环境的结构基础，它还包含了非常多的成分，如细胞因子、分泌蛋白、结构蛋白、炎症细胞、间质细胞、血管内皮细胞、血管外膜细胞等。其中部分成分不但为正常发育和组织器官修复、结构功能维持所必需，对肿瘤、外伤、炎症、畸形的发生、发展、维持和消退也起到重要影响。在创面愈合过程中也是如此，部分细胞外基质蛋白成分的过多或者不足，可能对创面的愈合速度和质量起到重要影响。
[0011]由此可见，创面是一个非常常见而且重要的临床问题。外伤性创面、糖尿病足、静脉瘀滞性溃疡、压力性溃疡以及感染、肿瘤切除引起的创面发病率居高不下，且随着经济社会的发展，有不断增高趋势。创面不但给患者带来疼痛、影响工作、生活，还可能造成局部及全身感染可能，延迟愈合的创面往往造成严重的瘢痕，而经久不愈的创面可能导致恶性肿瘤发生。目前临床可用的促进创面愈合药物非常有限，主要是生长因子类药物及生长激素类药物。但是效果不能让人满意，并且使用有局限性。因此，开发新的促进创面愈合药物仍然非常必要。
[0012]胶原三股螺旋重复蛋白I (collagen triple helix repeat containing
I,CTHRC1)是一种细胞外分泌蛋白，2005年首次被报导。最初发现其具有促进成纤维细胞和血管平滑肌细胞迁移，抑制胶原蛋白表达的作用，而且是TGF-β信号的负调节因子。后来发现其还和细胞分化，肿瘤发生、发展有关(例如，参见王萍等，CTHRCl与肿瘤关系的研究进展，《生命科学》2010年08期；周琦等，宫颈癌组织中胶原三股螺旋重复蛋白I表达及临床意义，《中华实用诊断与治疗杂志》，2011年07期等)。但是，目前为止，CTHRCl与角质形成细胞和创面愈合的关系还没有报导。
【发明内容】
[0013]本发明的一个目的是提供CTHRCl蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用。
[0014]在一个实施方案中，所述的CTHRCl蛋白选自重组人CTHRCl蛋白或重组小鼠CTHRCl 蛋白。
[0015]所述的创面可以发生在哺乳动物，特别是人和小鼠的身上。
[0016]具体来说，发明人下面通过小鼠创面标本和人正常皮肤及瘢痕标本免疫组化证实，CTHRCl在正常皮肤上皮中基本不表达，而在创面愈合过程中高表达，说明它与创面愈合有相关性。而根据CTHRCl在其它细胞中具有促进迁移和抑制胶原蛋白表达的作用，发明人推测其可能具有加快创面愈合，改善创面愈合质量的作用。为了验证该假说，发明人构建了小鼠源性和人源性CTHRCl蛋白表达载体，表达并纯化了重组蛋白。接着通过体内外实验证实了 CTHRCl重组蛋白不明显影响角质形成细胞增殖，但可以促进角质形成细胞迁移，促进小鼠创面愈合。这些结果揭示了 CTHRCl蛋白具有成为促进创面愈合外用药物的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1a 为人真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及 HaCaT 细胞CTHRCl的mRNA表达水平的柱形图。
[0018]图1b为人真皮成纤维细胞及HaCaT细胞CTHRCl的蛋白表达水平的柱形图。
[0019]图1c为在炎症因子TGF-β I诱导下(2ng/ml)，HaCaT细胞CTHRCl的mRNA表达水平的柱形图。
[0020]图1d为正常人皮肤和人未成熟瘢痕的照片。
[0021]图1e为正常人体皮肤表皮和在未成熟瘢痕表皮中的CTHRCl表达水平的柱形图。
[0022]图1f为正常小鼠皮肤和小鼠创面皮肤的照片。
[0023]图1g为正常小鼠皮肤和小鼠创面皮肤中的CTHRCl表达水平的柱形图。
[0024]图2a为从合成的小鼠CTHRCl编码区中PCR出带相应酶切位点的编码CTHRCl蛋白的核苷酸序列的琼脂糖电泳图。
[0025]图2b为双酶切V152、V162载体及CTHRCl编码序列PCR产物的琼脂糖电泳图。
[0026]图2c为所述的双酶切产物胶回收后经转化后选取的8个单克隆(clonel、clone2、clone3、clone4、clone5、clone6、clone7 和 clone8)的琼脂糖电泳图。
[0027]图2d为clonel经测序验证后表达的CTHRCl重组蛋白的Western blot图。
[0028]图3为实施例三进行的划痕实验的照片及相应的柱状图。
[0029]图4为实施例四进行的增殖实验的柱状图。
[0030]图5为实施例五中小鼠创面愈合照片和相应的柱状图。
[0031]下面基于具体实施例并结合附图对本发明作进一步的阐述。
【具体实施方式】
[0032]预备实施例、免疫组化步骤；
[0033]人正常皮肤及未成熟瘢痕组织、成熟瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织及小鼠创面组织多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡至水；柠檬酸钠缓冲液水浴抗原修复；0.3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性；10%BSA室温封闭I小时；一抗4度过夜，PBS清洗3次；二抗室温孵育I小时，PBS清洗3次；DAB发色，自来水洗10分钟；苏木素复染10秒，自来水洗10分钟；脱水透明后封片。
[0034]实施例一、CTHRCl在体外及体内的表达；
[0035]实时定量PCR (Real time PCR):
[0036]RNA提取:①6厘米培养皿中HDF及HaCaT细胞生长至80_90%融合时，弃去培养基，1*PBS洗一次，加入RNAiso Plus(购自Takara，中国大连)300μ 1，以细胞刮勺刮下细胞后转移至离心管，移液枪反复吹吸至裂解液中无肉眼可见沉淀。室温放置5分钟。②加Λ 60 μ I氯仿，震荡混匀，室温静置5分钟。12，000g4°C离心15分钟。③将上清液转移至新离心管中并加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10分钟。12，000g4°C离心10分钟。④弃去上清，向沉淀中加入lml75%的乙醇清洗沉淀，12，000g4°C离心5分钟。⑤弃上清并室温干燥沉淀，溶解于适量DEPC处理水中，并测定浓度。
[0037]反转录:配制10 μ I反应体系如下,5 X PrimeScriptTM缓冲液(购自Takara,中国大连)2.0 μ I, Random6mers (购自 Takara,中国大连)(100 μ M) 0.5 μ I, PrimeScriptTMRT Enzyme Mixl (Takara,中国大连)0.5 μ 1，Oligo dT Primer (购自 Takara,中国大连)(50 μ Μ) 0.5 μ I,总 RNA (购自 Takara,中国大连)500ng, RNase Free dH20 (购自 Takara,中国大连)加至总体积10 μ I。反转录条件为:37°C 30分钟，850C 5秒钟，4°C保存。
[0038]实时定量PCR:采用ABI PRISM7300实时定量PCR系统。反应体系配制(10 μ I):SYBR Premix Ex TaqTM(购自 Takara,中国大连)(2 X) 5 μ 1，PCR Forward Primer (购自 Takara,中国大连)(10 μ M) 0.4 μ I, PCR Reverse Primer (购自 Takara,中国大连)(10 μ Μ) 0.4 μ 1，ROX参照染料(购自Takara，中国大连)(50 X) 0.2 μ 1，DNA模板(反转录产物以dH20稀释40倍)I μ I, dH203 μ I。反应条件为:阶段195°C，30秒；阶段295°C 5秒，600C 31秒，循环40次； 阶段395°C 15秒，60°C 30秒，95°C 15秒。结果与GAPDH表达水平采用2-dt CT法定量比较。
[0039]Western blot:①6厘米培养皿中HDF及HaCaT细胞生长至80-90%融合时，弃去培养基，1*PBS洗一次，冰上放置，加入300 μ IlX负载缓冲液(loading buffer)，刮下细胞，冰上放置I到2分钟。沸水浴变性10分钟后放置于冰上。②聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶浓度10%);③转膜，条件为恒流300mA，90分钟5%脱脂牛奶室温封闭I小时后孵育一抗，CTHRCl小鼠单抗(杭州华安生物技术有限公司制备)，4°C过夜過I X TBS洗4次，每次5分钟后避光孵育抗小鼠荧光二抗，室温I小时；?扫膜后Image J软件半定量。
[0040]免疫组织化学染色
[0041]人正常皮肤及未成熟瘢痕组织、成熟瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织及小鼠创面组织多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡至水；柠檬酸钠缓冲液水浴抗原修复；0.3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性；10%BSA室温封闭I小时；一抗4度过夜，PBS清洗3次；二抗室温孵育I小时，PBS清洗3次；DAB发色，自来水洗10分钟；苏木素复染10秒，自来水洗10分钟；脱水透明后封片。
[0042]如图1所示，CTHRCl在HaCaT细胞中的表达水平极低，几乎不能被检出。图1a所不为人真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblasts, HDF)及HaCaT细胞CTHRCl的mRNA表达水平，图1b所示为二者CTHRCl的蛋白表达水平。但是在炎症因子TGF-β I诱导下(2ng/ml)，HaCaT细胞CTHRCl的mRNA表达水平可以明显上调(参见图lc)。在正常人体皮肤表皮中，通过免疫组化的方法几乎检测不到CTHRCl蛋白的表达，但是在愈合不久的未成熟瘢痕表皮中，可见CTHRCl蛋白表达明显增加(参见图1d和图le)。类似的结果通过C57小鼠创面模型也得到了验证，在小鼠正常皮肤表皮中，CTHRCl蛋白几乎不表达，但是在创面愈合过程中，CTHRCl蛋白的表达水平均明显增加(参见图1f和图1g)。
[0043]实施例二、小鼠源性及人源性CTHRCl重组蛋白表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化；
[0044]①查询小鼠源性及人源性CTHRCl基因⑶S序列并合成；
[0045]②合成PCR引物，并从⑶S序列中PCR出包含酶切位点的CTHRCl序列；
[0046]③双酶切PCR产物及载体质粒；
[0047]④酶切产物电泳，胶回收后连接，转化感受态DH5a细菌，并涂板，挑单克隆，摇菌，菌液PCR、酶切及测序验证；
[0048]⑤验证成功后提质粒，转染293吉凯细胞，两天后筛选，筛选稳定后收上清；
[0049]⑥亲和柱层析法纯化重组蛋白并测定浓度,分装，western blot鉴定。
[0050]小鼠CTHRCl重组蛋白表达载体构建及蛋白表达、纯化、鉴定过程及结果为:首先从合成的小鼠CTHRCl编码区中PCR出带相应酶切位点的编码CTHRCl蛋白的核苷酸序列，并经琼脂糖电泳验证分子量，如图2a所示。然后双酶切V152、V162载体及CTHRCl编码序列PCR产物，以琼脂糖电泳分离，如图2b所示。双酶切产物胶回收后4度水浴连接16小时，转化感受态DH5a细菌，并涂板，挑单克隆八个，摇菌后菌液PCR验证连接是否成功，如图2c所示。挑选其中一个测序，完全吻合后摇菌提质粒，并转染293吉凯细胞后嘌呤霉素筛选，收集上清，然后以亲和柱层析发纯化蛋白，测定浓度后分装，以Western blot验证,如图2d所示。人CTHRCl重组蛋白与此相同，仅合成⑶S序列不同。
[0051]实施例三、体外角质形成细胞迁移实验；
[0052]永生化角质形成细胞(HaCaT)细胞种入24孔板(3X 105/ml)，以含10% FBS的DMSO培养基培养，两天左右细胞生长融合。换液为含1%FBS的DMEM，24小时后用移液器小枪头垂直皿底轻轻划痕，以PBS清洗3次，去除漂浮细胞。然后每孔加入含不同浓度重组人CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm, 10nm)的培养基(含1%FBS的DMEM)500 μ I。放入活细胞工作站，每6小时拍照一次至24小时。测量每个视野缩小的面积并统计分析。实验重复三次，算出均值后以Student’ T检验法比较各组间P值，P值小于0.05认为有统计学意义。
[0053]角质形成细胞的迁移是创面愈合过程中核心的细胞过程，迁移较快意味着创面愈合加速。如图3所示，通过划痕实验发现，重组人CTHRCl蛋白可以促进HaCaT细胞迁移，而且这种作用有浓度依赖性。
[0054]实施例四、体外角质形成细胞增殖实验；
[0055]HaCaT细胞以含10% FBS的DMSO培养基培养至70-80%融合时消化并种入96孔板，以含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞后，每孔种入加入含2000个细胞的100 μ I培养基。24小时后换液为含1%FBS的DMEM并加入不同浓度人源性重组CTHRCl蛋白(Onm，lnm, 1nm,10nm),每两天换液I次,每两天以CCK-8法测定波长450nm0D值一次。测定至加蛋白后第6天。实验重复三次，算出均值后以Student’ T检验法比较各组间P值，P值小于0.05认为有统计学意义。
[0056]结果显示，重组人CTHRCl蛋白对HaCaT细胞体外增殖无明显影响；角质形成细胞增殖也是和创面愈合密切相关的细胞过程，如图4所示，重组人CTHRCl蛋白在促进HaCaT细胞迁移的浓度范围内，对HaCaT细胞体外增殖没有明显影响。
[0057]实施例五、小鼠创面愈合模型的建立及重组蛋白处理，创面愈合过程的观察。
[0058]实验开始前I天小鼠背部剃毛后以10%硫化钠脱毛。实验开始时标记小鼠背部4个创面位置，前两个创面中点为耳后1.5厘米，背部中线两次各0.5厘米，另两个创面中点为前两个创面中点后1.5厘米。创面直径均为5毫米。画线后以锐利眼科剪剪去全层皮肤。每天创面给药一次，分别为空白对照，Onm重组蛋白(即蛋白稀释液)，1nm小鼠源性重组CTHRCl蛋白，40nm小鼠源性重组CTHRCl蛋白。每天创面大小拍照。共6只小鼠，各时间点创面大小以Student’ T检验法比较各组间P值，P值小于0.05认为有统计学意义。
[0059]如图5所示，发明人构建了 C57小鼠创面模型，并且将重组小鼠CTHRCl蛋白外用，每日I次，然后观察创面愈合速度，结果发现，创面直接外用CTHRCl蛋白可以有效促进小鼠创面的愈合。
[0060]本发明据此发现了 CTHRCl蛋白外用促进创面愈合药物的潜力，它能有效地帮助创面愈合，并可避免激素类药物的副作用。
【权利要求】
1.CTHRCl蛋白在制备促进创面愈合作用的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CTHRCl蛋白选自重组人CTHRCl蛋白或重组小鼠CTHRCl蛋白。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的创面发生在哺乳动物上。
4.如权利 要求3所述的应用，其特征在于，所述的哺乳动物是人或小鼠。
【文档编号】A61P17/02GK104043106SQ201310080556
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2013年3月13日
【发明者】张志刚, 刘晓瑾, 杨小妹 申请人:上海市肿瘤研究所