专利名称：一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域兽用生物制品行业，涉及一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗及其制备方法。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是一种鸡群急性、高度传染性呼吸道疾病。目前疾病呈全球性分布，给各国及地区的养鸡业带来严重的危害。该疫病可引起呼吸困难、抵抗力减弱而导致雏鸡大量死亡，也会引发育成鸡和蛋鸡的肾脏和/或生殖器官病变，从而导致生长滞缓、产蛋量蛋品质下降。鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus, IBV)可分为多种不同的血清型，目前已知的IBV血清型约有60余种，各个血清型之间不存在交叉免疫保护或仅存在微弱交叉免疫保护。不同血清型毒株间的交叉保护能力较差，因此单一血清型的IBV疫苗不能起到很好的预防作用，这已经给我国养鸡业产生了极大的危害。根据对我国多个地区进行流行病学调查和血清型的调查鉴定分析，现地目前主要流行的IBV血清型为Massachusetts和793/B血清型，国内市场现仅有的Massachusetts血清型(H52、H120等)单价疫苗，但不能有效的抵抗IB流行毒株的攻击，而经常造成免疫失败。
发明内容
针对当前我国鸡传染性支气管炎病毒流行毒株存在多种血清型，但以Massachusetts血清型和793/B血清型为主，本发明提供一种能够同时有效预防鸡传染性支气管炎Massachusetts血清型和793/B血清型的二价活疫苗，解决目前国内现有IBV疫苗对上述两种血清型IBV毒株只能提供部分预防或甚至无任何预防效果的问题，从而更大程度上预防避免鸡传染性支气管炎的广泛发生于流行。该二价活疫苗结合Massachusetts血清型IBV弱毒H120株与本发明人自我国分离、经人工弱化处理获得的具有良好免疫原性的793/B血清型FN0-E55株制备出具有对上述两种血清型均有良好免疫原性的弱毒二价疫苗，对预防当前我国鸡传染性支气管炎疾病起到更好、更广谱的免疫保护作用，保护率可达80 100%。同时该二价疫苗在实际生产应用中可以大幅度的降低对鸡群反复免疫产生的应激反应，并且可以缩减对人力、物力等成本的消耗。本发明的另一个目的在于提供该鸡传染性支气管炎二价活疫苗(FN0-E55株+H120株)的制备方法。本发明中有以下特点:1.本发明涉及的鸡传染性支气管炎二价活疫苗含有鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株和鸡传染性支气管炎病毒H120株两种活性成分。2.疫苗中的鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株仅能够被793/B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和而不能被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清充分中和；鸡传染性支气管炎病毒H120株仅能够被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和而不能被793/B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清充分中和；鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)FN0_E55株病毒株已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGNCC N0.7310。3.鸡传染性支气管炎二价活疫苗的制备方法如下:分别将鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株和H120株接种于10.5日龄SPF鸡胚，病毒复制后收获含毒鸡胚尿囊液作为半成品，将以上两毒株半成品混合后，加入常用的冻干保护剂混匀、分装后进行冷冻真空干燥，即制成鸡传染性支气管炎二价活疫苗(FN0-E55株+H120 株)。4.用该疫苗接种7日龄SPF鸡后不引起任何症状，并能够诱导靶动物产生针对793/B血清型和Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎的特异性免疫应答。
具体实施例方式一、菌毒种的来源及特性(一)鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)1.病毒分离与鉴定2009年，本申请人由浙江某鸡场分离得到一株鸡传染性支气管炎病毒，经分子生物学试验、血清学试验等方法，鉴定为鸡传染性支气管炎病毒793/B血清型，定名为FNO-E株。2.鸡传染性支气管炎病毒(FNO-E株)的传代致弱通过接种SPF鸡胚 连续传代，将分离得到的鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行了毒力弱化，实验结果表明，传代至第P25代时，病毒毒力开始下降，传代至P50代之后对雏鸡的感染率为0%。说明该病毒传代至P50代及P60代后已经致弱，对雏鸡已无致病力。选取P55代作为疫苗研制的候选毒株，为一株鸡传染性支气管炎弱化毒株，命名为鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus) FN0-E55 株,该毒株已于 2011 年 09 月 26日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC N0.7310。3.生产用鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)的纯粹性检验3.1无菌检验按《中华人民共和国兽药典》((中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011.，本发明以下简称《中国兽药典》))规定的方法:对鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)第55 60代毒种进行无菌检验，分别接种T.G、G.P小管和G.A斜面培养基各2支，每支0.2mL, 一支置37°C培养；一支置于25°C培养,观察3日，移植后的病毒培养物接种的T.G、G.P和G.A斜面培养基,观察五日均无细菌、霉菌生长，表明FN0-E55株毒种未受细菌与霉菌的污染。3.2支原体检验按《中国兽药典》规定的方法对第55 60代毒种进行支原体检验，经过5日、10日、15日培养，观察液体培养基无颜色变化，再经移植后培养14日观察，支原体液体培养基仍然无颜色变化；接种毒种的琼脂平板上均未出现支原体菌落。表明FN0-E55株毒种无支原体污染。3.3外源病毒检验按《中国兽药典》要求，对第55 60代毒种进行了外源病毒的检测，结果表明，FN0-E55株毒种无外源病毒污染。4.免疫原性将弱化出的毒株病毒含量稀释到103_ 5EID5tlA).1mL,接种10只7日龄SPF雏鸡，每只免疫IOOyL,免疫途径为滴鼻点眼，并设空白对照组。3周后，连同条件相同的空白对照组，用鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行强毒攻击,攻毒剂量为104_5TOCID5ci/只,攻毒后4 5天进行剖杀，取出气管，分别在每只鸡的气管头、中、尾部取3、4、3段气管进行纤毛运动观察并评分，评分标准如下:A)气管环组织内周边无一个纤毛运动，计为4分。B)气管环组织内周边约75%纤毛停止运动，计为3分。C)气管环组织内周边约50%纤毛停止运动，计为2分。D)气管环组织内周边约25%纤毛停止运动，计为I分。E)气管环组织内周边无纤毛停止运动，计为O分。每只鸡气管纤毛评分低于20分，即纤毛损伤率低于50% (20/40)时，则判定为该只鸡被保护或未感染；若气管纤毛评分高于20分，即纤毛损伤率高于50% (20/40)时，则判定为该只鸡未被保护或感染。根据以上判定标准所得，免疫组应有8只以上的鸡被保护；对照组应至少有8只鸡未被保护。5.鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)的稳定性取FN0-E55株病毒，按103_ 5EID5tl剂量滴鼻接种SPF鸡，将病毒在靶动物体内连续传代5代，期间未观察到 任何可疑鸡传染性支气管炎感染症状，证明该弱毒株在5代以内保持毒力稳定。(二)鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(H120株)1.毒种的来源鸡传染性支气管炎病毒H120株(CVCCAV1514)是商品化疫苗的生产种毒，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和分发。本申请人自中国兽医药品监察所获取。2.主要特性(I)纯净按《中国兽药典》进行，IBVH120毒种应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。(2)病毒含量IBVH120毒种经尿囊腔内注射10日龄SPF鸡胚的感染剂量应^ IO6 0EID50 / 0.1ml0接种后鸡胚在24 144小时全部或部分死亡，存活的鸡胚胎儿出现失水、蜷缩、发育小等特异性病痕判为感染。(3)安全性以105_qEID5q滴鼻I滴(约0.03ml)，对各种日龄SPF鸡均应安全。(4)免疫原性以5X102_°EID5(i的病毒液，对I 3日龄SPF雏鸡滴鼻，14日后，连同条件相同的对照鸡用M41株强毒滴鼻，对照鸡至少80%发病，免疫鸡至少80%保护。(5)特异性用生理盐水将IBVH120株种毒稀释至0.1羽份/ 0.1ml，与等量抗鸡传染性支气管炎特异性血清混合，在20 25°C作用I小时，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml。置37°C观察24 144小时，应不引起特异死亡及鸡胚病变，至少有8个鸡胚健活。
二、疫苗的制备取鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)生产代次种毒接种9 11日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL。密封针口后，置于37°C，相对湿度60%继续孵育。接种后24小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2 8°C冷却。将冷却后的鸡胚用碘酊消毒气室部位，然后无菌剥除气室部卵壳，吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶中，留样后冻存。取鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(H120株)生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释至10_2 10_4，每胚尿囊腔接种0.1ml，接种后密封针孔，置37°C继续培养孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后30小时前照蛋I次，弃去死胚，收取30 36小时的活胚，气室向上直立，至于2 8°C中冷却4 24小时。将冷却后的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组置灭菌瓶中，同时做无菌检验，然后冷冻保存。收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。然后将以上收获的两毒株病毒液(即为疫苗制备中的半成品)在经检验合格后，将两病毒株的半成品混合，使各个毒株在每羽份终产品中效价达到IO3 5EID5tl以上，再与保护剂混合进行分装配苗，并进行冷冻真空干燥处理，即制成鸡传染性支气管炎二价活疫苗(FNO-E55 株 +Hl2O 株)三、疫苗检验(I)物理性状:制品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。(2)纯粹检验:按《中国兽药典》中的规定进行检验，应纯粹。(3)鉴别检验:通过血清中和实验进行，FN0-E55株毒种应被抗鸡传染性支气管炎病毒(793/B血清型)阳性血清中和，不应被抗鸡传染性支气管炎病毒(Massachusetts血清型)阳性血清中和。H120株毒种应被抗鸡传染性支气管炎病毒(Massachusetts血清型)阳性血清中和，不应被抗鸡传染性支气管炎病毒(793/B血清型)阳性血清中和。(4)安全检验:用7日龄SPF鸡20只，10只各滴鼻接种过疫苗10羽份，另10只作对照。观察14日，应全部健活，且无呼吸异常及神经症状。任何一组非特异性死亡鸡应不超过I只，否则可重检I次。(5)效力检验:用I 3日龄SPF雏鸡20只，每只滴鼻接种疫苗I羽份，接种后10日随机分为两组，连同对照鸡10只隔离饲养。第一组用10倍稀释的鸡传染性支气管炎病毒强毒M41株(CVCC AV1511)滴鼻攻击，每只I 2滴，连续观察10日，以是否出现鸡传染性支气管炎典型症状为判定标准。对照组应至少8只雏鸡出现鸡传染性支气管炎典型症状，免疫组雏鸡应至少保护8只。第二组在免后14日用鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株进行强毒攻击，攻毒剂量为IO4 5TOCID5ci/只，攻毒途径为滴鼻，点眼。攻毒后5天进行剖杀，取出气管，分别在每只鸡的气管头、中、尾部取3、4、3段气管环进行纤`毛运动观察并评分，根据以上判定标准所得，免疫组应有8只以上的鸡被保护；对照组应至少有8只鸡未被保护。(6)剩余水分测定:遵照《中国兽药典》规定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4%,如果有超过时,可重检I次,重检后如有I个样品超过规定,该批制品应判为不合格。(7)真空度测定:遵照《中国兽药典》规定包装前测定真空度，无真空的制品，应予副除报废。本发明涉及的微生物资源鸡传染性支气管炎病毒弱毒株是由本发明人分离的鸡传染性支气管炎病毒FNO-E株经人工致弱而成，该毒株的血清型为鸡传染性支气管炎病毒793/B血清型，命名为鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus) FN0-E55株,该弱毒株鸡传染性支气管炎病毒已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCCN0.7310。鸡传染性支气管炎病毒H120株(CVCC AV1514)生产种毒和攻毒IBV强毒M41株(CVCC AV1511)是从中国兽医药品监察所获取。本发明的积极意义本发明涉及一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗及其制备方法。本发明是用本发明人分离并弱化的鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株结合鸡传染性支气管炎病毒H120株制备出安全、有效的鸡传染性支气管炎二价活疫苗。本发明能够有效的预防目前国内流行的Massachusetts血清型和793B血清型IBV引发的鸡传染性支气管炎的发生，可解决目前国内原有疫苗对上述两种血清型IBV不能提供有效保护的问题，与此同时能够减少免疫过程中产生的过多的应激反应和成本的消耗。实施例
以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例1——疫苗的制备取鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)生产代次种毒用灭菌生理盐水稀释后接种10.5日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL。密封针口后，置于37°C，相对湿度60%继续孵育。接种后24小时照胚，弃去死胚；将活胚置于2 8°C冷却。将冷却后的鸡胚用碘酊消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳，吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组。收获后的胚液置于灭菌瓶中，留样后冻存。取鸡传染性支气管炎病毒弱毒株(H120株)生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释至10_2 10_4，接种10.5日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔接种0.1ml，接种后密封针孔，置37°C继续培养孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后30小时前照蛋I次，弃去死胚，收取30 36小时的活胚，气室向上直立，至于2 8°C中冷却4 24小时。将冷却取出，用碘酊消毒气室部位，然后无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组置灭菌瓶中，同时做无菌检验，然后冷冻保存。收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。两株疫苗半成品在经检验合格后，将两株疫苗半成品混合，保证各个毒株在终广品中每羽份效价达到IO3 5EID5tl以上，再与常规冻干保护剂混合进行配苗后分装，在冷冻真空干燥设备中进行冷冻真空干燥后，即为鸡传染性支气管炎二价活疫苗(FN0-E55株-H120株)。实施例2——疫苗检验(I)物理性状:制品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后均迅速溶解。(2)纯粹检验:按《中国兽药典》中的规定进行检验，均纯粹。(3)鉴别检验:按《中国兽药典》中的规定进行检验血清中和试验。将疫苗用灭菌生理盐水稀释至每1.0ml含I羽份,与等量的抗鸡传染性支气管炎病毒Massachusetts型特异性血清(购自中国兽医药品监察所)混合，置于20 25°C作用60分钟。取部分中和后疫苗稀释液通过尿囊腔途径接种9 10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37°C孵育24 144小时无特异性死亡，打开鸡胚也无任何胎儿失水、蜷缩、发育小等特异性病痕，并且10只鸡胚全部健活。 同时取其余中和后疫苗稀释液分为两组:第一组用无血清MEM稀释到200个TOCID50,与等量的鸡传染性支气管炎病毒793/B株阳性血清(由本发明人制作和保存)37°C中和30分钟，然后接种到气管环培养物中，每管200 μ L，接种5管，吸附30min后补液至ImL, 37°C旋转培养；第二组直接接种到气管环培养物中，每管200 μ L，接种5管，吸附30min后补液至lmL，37°C旋转继续培养；同时设定气管环培养物的空白对照组。连续观察5日，根据气管环纤毛运动情况判定。结果疫苗未中和的实验组5管中的气管环上皮纤毛全部失去活性，而空白对照组和中和抗鸡传染性支气管炎病毒(793/B血清型)阳性血清的实验组的气管环上皮纤毛全部健活。(4)疫苗的安全性检验IBV 二价疫苗(FN0-E55株+H120株)进行了靶动物的多项安全性试验。实验结果见表1、2和3，由表中数据可以表明该疫苗对靶动物具有良好的安全性。I)单剂量重复接种安全性试验将疫苗用无菌生理盐水重溶，以单只I羽份剂量接种10只7日龄SPF雏鸡，每只免疫100 μ L，免疫途径为滴鼻点眼，连续观察2周后再次以相同剂量相同途径接种免疫，并设空白对照组。连续观察10日，观察是否有呼吸异常及神经症状等临床症状。表I单剂量重复接种安全性试验结果
权利要求
1.一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，其特征在于该疫苗含有鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株和鸡传染性支气管炎病毒H120株两种活性成分。
2.如权利要求1所述一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，其特征在于鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株仅能够被793B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和而不能被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清充分中和；鸡传染性支气管炎病毒H120株仅能够被Massachusetts血清型鸡传染性支气管炎阳性血清中和而不能被793B血清型鸡传染性支气管炎阳性血清充分中和；鸡传染性支气管炎病毒(Infectious BronchitisVirus)FN0-E55株病毒株已于2013年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGNCCN0.7310。
3.权利要求1所述鸡传染性支气管炎二价活疫苗的制备方法，其特征在于制备方法如下: 分别将鸡传染性支气管炎病毒FN0-E55株和H120株接种于10.5日龄SPF鸡胚，病毒复制后收获含毒鸡胚尿囊液作为半成品，将以上两毒株半成品混合后，加入常用的冻干保护剂混匀、分装后进行冷冻真空干燥，即制成鸡传染性支气管炎二价活疫苗(FN0-E55株+H120 株)。
4.如权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，其特征在于用该疫苗接种7日龄SPF鸡后不引起任何症状，并能够诱导靶动物产生针对793B血清型和Massachusetts血清型鸡传 染性支气管炎的特异性免疫应答。
全文摘要
本发明涉及一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗及其制备方法。本发明是用本发明人分离并弱化的鸡传染性支气管炎病毒FNO-E55株结合鸡传染性支气管炎病毒H120株制备出安全、有效的鸡传染性支气管炎二价活疫苗。本发明能够有效的预防目前国内流行的Massachusetts血清型和793B血清型IBV引发的鸡传染性支气管炎的发生，可解决目前国内原有疫苗对上述两种血清型IBV不能提供有效保护的问题，与此同时能够减少免疫过程中产生的过多的应激反应和成本的消耗。
文档编号A61P31/14GK103182082SQ20131009718
公开日2013年7月3日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者沈元, 曹玉飞, 嵇康, 张鹏超, 林志晓 申请人:浙江诺倍威生物技术有限公司