专利名称：一种靶向微泡造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向微泡造影剂及其制备方法。
背景技术：
微泡造影剂作为基因治疗中的一种安全载体，在超声辐照下能够有效地进行靶向性基因转染，成为当前肿瘤基因治疗领域的研究热点。将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，可使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”可使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，具有安全、无创，并可作用于深部组织和器官的特点，是一种新型的基因靶向传输技术，具有广阔的发展空间。
然而普通微泡载基因微泡造影剂本身并无主动靶向性，与组织没有特异性结合位点，经血管注射后，微泡在体内将随机分布，只有超声辐照处的微泡才能定向破裂释放基因，大量的微泡流经超声辐照以外的部位，自由分解消化，从而造成微泡及基因的大量流失破坏。因此在微泡上连接肿瘤特异性靶向配体或抗体，导致更多的“配体-受体对”形式，使微泡和靶器官之间结合的更紧密。尽管如此，在体内环境下，由于血液具有流动性，靶向微泡与受体接触时间短暂，靶向微泡配体-受体对形成数量不足，而且血流冲刷作用又会将一部分结合的靶向微泡冲刷掉，导致有效的靶向微泡配体-受体数量有限，基因转染率仍达不到理想水平。发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效增加靶向微泡配体-受体对形成数量，进一步提高载基因微泡基因转染率的靶向微泡造影剂及其制备方法。
本发明提供的靶向超声微泡造影剂，为平均粒径为1-4微米的微泡混悬液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，球壁材料中还含有结合多肽配体C(RGDyK)的PEG连接臂，其结构为DSPE-PEG-c(RGDyK)。
所述DSPE的重量百分含量为造影剂的0.2%-0.8%, DPPA的重量百分含量为造影剂的 0.02%-0.2%o
所述球壁材料中聚乙二醇分子量为4000-6000，其重量百分含量为造影剂的0.05%-0.4%O
所述泊洛沙姆的重量百分含量为造影剂的0.01%-0.1%。
所述氟碳类组织相容性惰性气体为全氟丙烷。
所述PEG连接臂中PEG分子量为800-2000，DSPE-PEG-c (RGDyK)的重量百分含量为造影剂的0.1%-0.2%。
上述的靶向超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤:
(I)将C(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA (N，N-二异丙基乙胺)加入到乙腈中，加入HBTU,室温下反应得到 DSPE-PEG-c (RGDyK)；
(2)将DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40_60°C充分混悬于双蒸水中，制成混悬液A，将DSPE-PEG-c (RGDyK)溶于无水乙醇中，溶解完全，制成溶液B ；
(3)混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，在超声过程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C ；
(4)将聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再将氟碳类组织相容性惰性气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理，形成平均粒径为1-4微米的微泡混悬液。
本发明的微泡造影剂采用的靶向配体为环状五肽C(RGDyK)，即cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys),其分子片段小,且易进行共价偶联。该配体既可与微泡采用共价方法稳定连接，又可与整合素靶向性结合；而整合素由于仅在肿瘤毛细血管及肿瘤细胞有高表达，而在正常细胞不表达或表达甚微，所以C(RGDyK)是较理想的配体，具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞特异性靶向功能。
PEG为亲水性高聚合度的柔性连接臂。运用其作为连接臂的靶向微泡水溶性好，在体内具有较长的半衰期。可使微泡在体内有较长的时间与靶器官更加紧密的结合。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，具有性质稳定，抗氧化性强，成品稳定等特点，是首选的辅料。
本发明的靶向微泡造影剂，以肿瘤组织中的整合素为靶点，采用共价偶联法，通过PEG衍生物连接臂(PEG-DSPE)将c (RGDyK)以共价结合法连于自制脂质微泡上制备出带连接臂的靶向微泡造影剂，使PEG连接臂一端连着含有RGD结构的与之结合力强的环状五肽c (RGDyK)配体，另一端与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相连。
本发明插入柔软的连接臂作为一种链绳结构，其系着配体的游离端活动度大，在靶区能提供配体与受体结合所需的相对较长的接触时间与更多的接触机会；再者，有了连接臂后配体能充分暴露在造影剂表面，而直接连接时部分配体可能掩埋在造影剂外壳材料之中，造成配体的浪费。运用PEG及其衍生物作为连接臂的靶向微泡水溶性好，在体内具有较长的半衰期，此外PEG长链还具有很好的柔韧性，且可产生较好的空间位阻作用，综合作用的结果是使血液中调理蛋白对纳米粒的粘附性下降，从而降低了 MPS吞噬细胞对微泡的识别和吞噬作用。该种连接臂上面都含有可供共价修饰的官能团，如氨基，羧基，羟基等，这为它们与配体和微泡之间的共价偶联提供了物质基础。所以连接臂的加入十分有助于增强配体与受体之间的粘附，会有更多的靶向微泡配体一受体对形成，微泡与靶器官之间的结合便更加紧密，不易被循环血液带走，靶向结合力便会大大提高，从而获得更好的基因转染率和肿瘤治疗效果。
本发明微泡造影剂的制备工艺采用超声匀化、高速剪切机剪切生成微泡的方法，具有制备原料少，制备工艺简单、方便，制备的超声微泡大小适宜、粒径分布均一、靶向探针结合率高等特点。
图1为不带连 接臂的靶向微泡造影剂示意图。
图2为本发明的带连接臂的靶向微泡造影剂示意图。
图3为本发明的靶向微泡造影剂的光学显微镜图(X400)。
图4为本发明的靶向微泡造影剂的荧光显微镜图片(X400)。
图5为实施例5组I荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100X)。
图6为实施例5组II荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100X)。
图7为实施例5组III荧光显微镜观察肿瘤组织的EGFP显影强度(100X)。
具体实施方式
实施例1:合成本发明的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影剂
本发明的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影剂如图2所示，通过下述步骤制备:
(I)合成 DSPE-PEG-c (RGDyK):将 10 毫摩尔 c (RGDyK)和 10 毫摩尔 DSPE-PEG2000，30毫摩尔的DIEA (N，N- 二异丙基乙胺)加入到15mL乙腈中，随后加入20毫摩尔的HBTU，室温反应30分钟，环状五肽c (RGDyK)的-NH2基与DSPE-PEG的-OH基通过共价偶联得产物DSPE-PEG-c (RGDyK)，减压蒸干溶剂，柱色谱层析，经高效液相色谱分析，纯度>95%，质谱鉴定分子结构正确；
(2)将40mgDSPE、4mgDPPA、5mg泊洛沙姆，40_60°C充分混悬于5ml双蒸水中，制成混悬液A ;将8mg DSPE-PEG2000-C (RGDyK)溶于150-250微升无水乙醇中，于40°C条件下溶解完全，制成溶液B ;
(3)混悬液A于探头超声仪中进行超声处理(工作3秒，暂停3秒，功率30%，3分钟，频率20kHz)，超声次数为一次或两次，在超声过程中逐滴加入溶液B，观察所制得的溶液均澄清，得到澄清液C ;
(4)将20mg PEG4000加入澄清液C中，溶解完全；再将全氟丙烷气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速机械剪切设备处理(lX104r/min)2min，形成平均粒径为1_4微米的微泡混悬液。
表征方法如下:将微泡分散于生理盐水中，显微镜下观察制备的超声微泡大小均匀适宜、粒径分布均一、分散良好(见图3);测定微泡浓度为1.5X109/mL，平均粒径为(1.5±0.5) ii m,粒径均一,97%微泡直径小于5 ii m。新型革巴向超声造影剂突光显微镜图片(X400):可见密集分布的表面呈绿色光环的微泡，其浓度密集，大小均一，形态规整。证实有靶向环状多肽配体连于微泡表面(见图4)。
得到的靶向微泡造影剂，球壁材料各组成成分的重量百分比为:
DSPE-PEG2000·-C(RGDyK)，0.16%
PEG4000 (微泡膜材料)，0.4%
磷脂:DSPE(0.8%), DPPA (0.08%)
泊洛沙姆,0.1%
包裹气体为全氟丙烷，溶液为去离子双蒸馏水。
按实施例1的方法制备实施例2、3的DSPE-PEG-c (RGDyK)靶向微泡造影剂，所不同的是加入的原料质量，见表1，得到的微泡造影剂其球壁材料各组成成分的重量百分比也列在表I中。
表I
权利要求
1.一种靶向超声微泡造影剂，为平均粒径为1-4微米的微泡混悬液，球壁材料包括DSPE和DPPA和聚乙二醇和泊洛沙姆，包裹气体为氟碳类组织相容性惰性气体，溶液为去离子双蒸馏水，其特征在于球壁材料中含有结合多肽配体c (RGDyK)的PEG连接臂，其结构为DSPE-PEG-c(RGDyK)。
2.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述DSPE的重量百分含量为造影剂的0.2%-0.8%，DPPA的重量百分含量为造影剂的0.02%-0.2%。
3.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述球壁材料中聚乙二醇分子量为4000-6000，其重量百分含量为造影剂的0.05%-0.4%。
4.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述泊洛沙姆的重量百分含量为造影剂的0.01%-0.1%。
5.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述氟碳类组织相容性惰性气体为全氟丙烷。
6.根据权利要求1所述的靶向超声微泡造影剂，其特征在于所述PEG连接臂中PEG分子量为800-2000，DSPE-PEG-c (RGDyK)的重量百分含量为造影剂的0.1%-0.2%。
7.—种权利要求1-6之一所述的靶向超声微泡造影剂的制备方法，包括以下步骤: (IMfc(RGDyK)和DSPE-PEG和DIEA (N’N-二异丙基乙胺)加入到乙腈中，加入HBTU，室温下反应得到DSPE-PEG-c (RGDyK)； (2 )将DSPE、DPPA和泊洛沙姆，40-60°C充分混悬于双蒸水中，制成混悬液A，将DSPE-PEG-c (RGDyK)溶于无水乙醇中，溶解完全，制成溶液B ； (3)混悬液A于探头超声仪中进行超声处理，在超声过程中逐滴加入溶液B，得到澄清液C ; (4)将聚乙二醇加入澄清液C中，溶解完全；再将氟碳类组织相容性惰性气体通入溶液C中，充分饱和的同时，应用高速 机械剪切设备处理，形成平均粒径为1-4微米的微泡混悬液。
全文摘要
本发明涉及一种靶向微泡造影剂，将环状多肽配体c(RGDyK)与DSPE-PEG通过共价键偶联合成DSPE-PEG-c(RGDyK)，使配体与微泡之间插入PEG衍生物(PEG-DSPE)连接臂，采用超声振荡匀化、高速剪切法制备有连接臂的靶向微泡造影剂。配体与微泡之间插入PEG衍生物连接臂制备的靶向微泡造影剂，有助于增强配体与受体之间的粘附，能够有效增加靶向微泡配体-受体对形成数量，使微泡与靶器官之间的结合更加紧密，进一步提高载基因微泡基因转染率。
文档编号A61K49/22GK103230605SQ20131015141
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者周平, 李家乐, 高峰 申请人:中南大学湘雅三医院, 周平