海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了海参糖胺聚糖在制药物中的应用，动物试验证明，重均分子量为大于54,500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和，并且在同一剂量下随着重均分子量增加起效时间延迟的同时药效持续时间增加。天然分子段的海参糖胺聚糖在一定剂量下持续药效时间可达16小时，可用于制备防治动脉血栓栓塞疾病药物。相对肝素类药物以及维生素K拮抗剂类药物更具安全性。临床上用于血栓栓塞疾病治疗视窗宽，安全性高，具有良好的开发研究价值。
【专利说明】海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海参糖胺聚糖的医药用途，具体涉及重均分子量为大于54, 500Da的 解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞性疾病药物中的应 用，血栓栓塞疾病包括动脉粥样硬化血栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态以及 手术后的血栓形成或治疗手术后的血栓。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展和人口老龄化的进程，老年人血管老化，血管壁受损，易患高血 压、动脉硬化、糖尿病。血管内皮细胞受损后，产生的凝血激酶增多，促进凝血酶形成，凝血 黄素 A2也增多，同时制造抗凝物质前列环素减少，易诱发血栓形成。如血糖增高时，糖与红 血球中的血红蛋白结合，使全身组织缺氧，这时血小板凝集性增强，粘度增大，容易促进血 栓形成。因此中老年人血栓栓塞疾病的发病率逐年增加，据世界卫生组织统计，全球每年有 1500万人死于血栓性疾病，血栓形成，即局部血液凝块形成，是导致心肌梗死和中风等动脉 疾病以及静脉血栓栓塞性疾病（包括深部静脉血栓形成和肺栓塞）发生和患者死亡的主要 原因。
[0003] 防治栓塞形成药物可按作用机制分为抗凝血药物、抗血小板药物、直接溶栓药物 等，临床上均能用于预防和治疗血栓性疾病。其中抗凝药物是通过影响凝血因子，从而防止 血栓形成或复发。抗凝药物对已经形成的血栓无溶解作用，但可以防止血栓扩展和新血栓 形成，有利于促进血栓早期自溶，同时抗凝血药物对静脉血栓形成具有明显预防作用，同时 抗凝血药物还可以用于配合体外循环和血液透析中防治血栓的形成使用，旨在防止治疗操 控时的血液凝固。
[0004] 患者出现的血液高凝状态或血栓形成，均涉及到凝血蛋白增高、凝血蛋白激活和 血液凝固性增加等诸多因素。临床上对高凝状态的防治原则，除要去除高凝状态的病因外， 还须选用减低或具有灭活凝血蛋白的药物，使高凝状态转向正常的方向发展，避免导致血 栓倾向进展，使用药物注射的主要有肝素及低分子肝素，口服的主要有华法林、双香豆素、 新双香豆素等，降低血粘度防治血栓栓塞的药物主要有低分子右旋糖苷。其中华法林能够 抑制某些凝血因子的维生素 K依赖性激活，是现处方量最大的抗凝血药物，且至今仍是临 床上唯一一个口服有效的维生素 K拮抗剂和唯一一个获准长期应用的抗凝血药物。临床研 究证实，华法林能够减少心房纤维性颤动患者64%的中风发生率。不过，尽管高度有效，但 华法林也会带来严重甚至致死性的出血风险。此外，因药动学的个体差异性大且易受到饮 食的影响，药物相互作用又很复杂，故华法林在临床实践中难以最优剂量用药，另外肝素及 低分子肝素类药物，临床使用易导致出血，不同体质的人使用监控性强。因此就目前临床使 用的抗凝药物来说均具有一定的副作用，鉴于人口的老龄化、血栓性疾病发病率的增加，以 及现有抗凝药物在临床用于栓塞性疾病预防和治疗的广泛性以及其安全隐患的严重性。从 中药中筛选、分离更具疗效性、安全性防治血栓栓塞性疾病，是预防和治疗血栓栓塞疾病的 一种必然趋势。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用， 以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床应用的需要。
[0006] 动物试验证明，重均分子量为大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段 的海参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，其抗凝活性呈剂量依赖性，与肝素及低分子肝素 比较，其随剂量增加凝血作用递增缓和，并且在同一剂量下随着重均分子量增加起效时间 延迟的同时药效持续时间增加。天然分子段的海参糖胺聚糖在一定剂量下持续药效时间可 达16小时。
[0007] 因此，所述重均分子量为大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海 参糖胺聚糖中的一段或者一段以上，可用于制备防治血栓栓塞疾病药物，具体的，所述血栓 栓塞疾病包括动脉粥样硬化血栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态以及手术后 的血栓形成或治疗手术后的血栓。
[0008] 所述的"重均分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖 胺聚糖"指的是，重均分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量或天然 分子段的海参糖胺聚糖，或者是重均分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重 均分子量或然分子段的海参糖胺聚糖的多段混合物；
[0009] 优选的：所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
[0010] 54, 500Da ?57, 000Da、57, OlODa ?62, 990Da、63, OOODa ?67, 000Da、67, OlODa ? 72,990Da、73,000Da ?77,000Da、77,010Da ?82,990Da、83,000Da ?87,000Da、 87,010Da ?92,990Da、93,000Da ?97,000Da、97,010Da ?102,900Da、103,000Da ? 107, 000Da、107, OlODa ?112, 990Da、113, OOODa ?117, 900Da 或 118, OOODa ?122, 050Da 中的任意一段； toon] 特别优选的，所述解聚海参糖胺聚糖的重均分子量为：
[0012] 54, 500Da ?57, 000Da、58, OOODa ?62, 000Da、63, OOODa ?67, 000Da、68, OOODa ? 72,000Da、73,000Da ?77,000Da、78,000Da ?82,000Da、83,000Da ?87,000Da、 88,000Da ?92,000Da、93,000Da ?97,000Da、98,000Da ?102,000Da、103,000Da ? 107, 000、108, OOODa ?112, OOODa、113, OOODa ?117, OOODa、118, OOODa ?122, OOODa 中的 任意一段；
[0013] 所述药物，包括治疗有效量的所述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体， 所述药学上可接受的载体选自甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮 或氯化钠的一段以上，优选甘露醇；
[0014] 所述的药物为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针剂；
[0015] 分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖，皮下 注射给药量为大鼠 lmg/kg?100mg/kg，优选2mg/kg?80mg/kg ;静脉注射给药量为大鼠 0· lmg/kg ?40mg/kg，优选 0· 2mg/kg ?30mg/kg ;
[0016] 所述药物中，所述解聚海参糖胺聚糖的纯度为90?99. 99%，优选92%以上，为 了达到更理想的效果更优选94%以上；所述的天然分子段的海参糖胺聚糖的纯度为90? 99. 99%，优选92%以上，为了达到更理想的效果，更优选95%以上；
[0017] 所述纯度为重量纯度。
[0018] 所述的解聚海参糖胺聚糖的多分散度为1?2,优选1?1. 6,更优选1?1. 4 ;
[0019] 所述多分散度指的是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合 物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布 宽度指数，是重均分子量（Mw)与数均分子量（Μη)之比，即Mw / Μη。这个比值随分子量分 布宽度而变化。在单分散时，Mw / Μη等于1，随着分子量分布变宽，Mw / Μη值逐渐变大。
[0020] 所述重均分子量的定义如下：重均分子量（Weight-averageMolecularWeight):所 有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们 是分子量不同的同系物的混合物。聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子 量。
[0021] 重均分子量是采用高效液相凝胶色谱法测试的。
[0022] 所述解聚海参糖胺聚糖可采用商业化产品，如哈尔滨红杉生物制药有限公司生产 的海参糖胺聚糖或解聚海参糖胺聚糖，或采用如下的方法制备：
[0023] (1)将酶加入绞碎的海参，在进行酶解和沉淀，收集海参糖胺聚糖粗品，对海参糖 胺聚糖粗品进行纯化和脱色，收集海参糖胺聚糖；
[0024] 所述海参选自玉足海参、糙海参、梅花参、二色桌片参或白底福肛参中的一种以 上，优选玉足海参或二色桌片参；
[0025] 所述的酶为水解蛋白酶和复合胰酶，水解蛋白酶可采用商业化产品，如诺维信(沈 阳）生物技术有限公司的Alcalase，复合胰酶可采用商业化产品，如无锡市雪梅酶制剂科技 有限公司的雪梅牌复合胰酶，水解蛋白酶的用量为海参重量的2%，复合胰酶的用量为海参 重量的2?3% ;
[0026] (2)将重量浓度为5%醋酸和3%的双氧水加入步骤（1)的产物降解，收集重均分子 量为大于54, 5000Da的解聚海参糖胺聚糖；
[0027] 所述药物的制备方法，为制剂领域常规的方法，如《中药制剂手册》记载的方法，获 得所述的注射液或冻干粉针剂；
[0028] (3)将所需分子量段的海参糖胺聚糖以及解聚海参糖胺聚糖采用凝胶柱收集所需 分子量段；
[0029] 所述的凝胶吸附柱，如Sephadex-G100凝胶吸附柱、Sephadex_G50凝胶吸附柱或 Sephadex_G200,所述Sephadex-G100凝胶吸附柱，可以采用美国GE公司的葡聚糖凝胶柱。
[0030] 本发明的含有解聚海参糖胺聚糖药物可通过皮下或者静脉注射的方法施加于需 要治疗的患者，给药剂量由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体 状况等）确定。一般而言，以解聚海参糖胺聚糖计，皮下给药剂量为〇. 1?50mg/kg，优选 0· 2?45mg/kg，静脉给药的给药剂量为0· 01?30mg/kg，优选0· 05?20mg/kg。
[0031] 海参糖胺聚糖是海参体壁中含有的一种酸性粘多糖是海参所特有的。本发明发 现，海参糖胺聚糖具有显著抗凝血、抗血小板聚集、降低血粘度、纤溶、调节血脂等生物活 性，可用于治疗血栓性疾病。
[0032] 海参糖胺聚糖通过进一步解聚成为不同分子量段的解聚海参糖胺聚糖，其呈现不 同的抗凝血活性，且随着剂量增加其抗凝血活性递增趋势缓和，相对肝素类药物以及维生 素 K拮抗剂类药物更具安全性。临床上用于血栓栓塞疾病治疗视窗宽，安全性高，具有良好 的开发研究价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的纯度图：
[0034] 图1-1天然分子段的海参糖胺聚糖的纯度图；
[0035] 图1-2重均分子量为54, 876Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0036] 图1-3重均分子量为60, 915Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0037] 图1-4 ;重均分子量为64, 904Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0038] 图1-5重均分子量为71，147Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0039] 图1-6重均分子量为74, 844Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0040] 图1-7重均分子量为80, 336Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0041] 图1-8重均分子量为84, 48 IDa的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0042] 图1-9重均分子量为90, 919Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0043] 图1-10重均分子量为95, 82 IDa的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0044] 图1-11重均分子量为10, 1250Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0045] 图1-12重均分子量为10, 3998Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0046] 图1-13重均分子量为10, 9161Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0047] 图1-14重均分子量为115, 268Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图；
[0048] 图1-15重均分子量为121，017Da的解聚海参糖胺聚糖纯度图。
[0049] 图2为海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的分子量测试报告。
[0050] 图2-1天然分子段的海参糖胺聚糖的分子量测试报告；
[0051] 图2-2重均分子量为54, 876Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0052] 图2-3重均分子量为60, 915Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0053] 图2-4重均分子量为64, 904Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0054] 图2-5重均分子量为71，147Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0055] 图2-6重均分子量为74, 844Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0056] 图2-7重均分子量为80, 336Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0057] 图2-8重均分子量为84, 48 IDa的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0058] 图2-9重均分子量为90, 919Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0059] 图2-10重均分子量为95, 82 IDa的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0060] 图2-11重均分子量为10, 1250Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0061] 图2-12重均分子量为10, 3998Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0062] 图2-13重均分子量为10, 9161Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0063] 图2-14重均分子量为115, 268Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告；
[0064] 图2-15重均分子量为121，017Da的解聚海参糖胺聚糖分子量测试报告。
[0065] 图3为解聚海参糖胺聚糖体外抗凝血剂量与凝血时间的线性关系图。
[0066] 图3-1DHG-1体外抗凝血实验结果。
[0067] 图3-2DHG-2体外抗凝血实验结果。
【具体实施方式】
[0068] 解聚海参糖胺聚糖的提取方法是指提取自海参的海参糖胺聚糖，经降解和解聚后 产生解聚糖胺聚糖，收集所需分子量的解聚海参糖胺聚糖。从海参体壁中提取海参糖胺聚 糖的方法是本领域技术人员所熟悉的，如中国专利ZL200910305363. 5。
[0069] 实施例1
[0070] 海参糖胺聚糖的提取：
[0071] 称取玉足海参药材4. 5kg，水浸16小时。将海参体壁淋干水分，绞碎，称重并补水 至36kg，置60°C水浴中，加入6mol/L氢氧化钠调pH至8. 2±0. 2,加入90ml水解蛋白酶 Alcalase (诺维信(沈阳）生物技术有限公司）搅拌，酶解4小时，85°C以上灭活10分钟，降 温至49°C ±2°C，加入6mol/L氢氧化钠调pH至8. 2±0. 2,再加9g复合胰酶(无锡市雪梅酶 制剂科技有限公司，雪梅牌)搅拌酶解4小时，煮沸15分钟，冷却。5°C离心，收集上清液，力口 入6mol/L盐酸调pH至2. 5±0· 2,4°C冷藏2小时，离心，收集上清液，加入6mol/L氢氧化钠 调pH至7. 5±0. 2,加入0. 8倍体积的乙醇，4°C静置12h。
[0072] 离心，收集沉淀称重，加8倍重量的蒸馏水，加热至85°C ±2°C，待完全溶解后，力口 入6mol/L氢氧化钠调pH至9. 0±0. 2,加入氯化|丐至溶液中氯化|丐浓度达到3% (w/v)， 升温至92°C保持15分钟，冷却至室温，4°C离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至 11.0±0. 1，离心，收集上清液，用6mol/L盐酸调pH至6.0±0. 1，加1倍体积乙醇，4°C冷藏 12h ；
[0073] 冷藏液离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充分溶解，加乙酸钾使 其最终浓度为2mol/L，4°C静置12h。离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充 分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4°C静置12h。离心，沉淀用冷2mol/L乙酸钾溶 液洗涤三次，然后依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后80°C干燥，称 重，得粗品A。
[0074] 粗品A加0. 05mol/L、pH6. 0的HAc-NaAc缓冲液溶解制成2%溶液上柱，溶液通过 纤维素层析柱后，用1. 5倍柱体积的0. 4mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液（pH6. 0±0. 1)洗 漆，再用lmol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液（ρΗ6· 0±0· 1)洗脱，根据紫外检测仪在220nm处 数值的变化速度收集洗脱液，置60°C水浴中，用NaOH调pH至11±0. 1，按体积量加入3%双 氧水，保持4小时，冷却，离心，收集上清液，用HC1调pH至7. 2±0. 1，加1倍量乙醇，4°C静 置 12h。
[0075] 离心，收集沉淀，依次用80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇洗漆，得粗品B。
[0076] 粗品B用蒸馏水溶解成5%的溶液，用截留分子量1万的超滤膜浓缩至原体积的 1/2,补加水至原体积，再超滤至1/2体积，再加水重复一次，超滤液冷冻干燥，得海参糖胺 聚糖，
[0077] 该实例得到的海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得到 纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-1)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量128, 024Da，D值为1. 26 (图谱 见图2-1)
[0078] 实施例2
[0079] 解聚海参糖胺聚糖的制备
[0080] 实施例2-1
[0081] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚4h50min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0082] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在54, 500Da?57, OOODa，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0083] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-2)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量54,876Da，D值为1.28 (图谱 见图2-2)
[0084] 实施例2-2
[0085] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚4h20min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0086] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在58, OOODa?62, OOODa，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0087] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-3)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量60,915Da，D值为1.36 (图谱 见图2-3)
[0088] 实施例2-3
[0089] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚3h50min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0090] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在63, OOODa?67, 000Da，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0091] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-4)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量64,904Da，D值为1.34 (图谱 见图2-4)
[0092] 实施例2-4
[0093] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚3h20min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0094] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过s印hadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在68, OOODa?72, OOODa，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0095] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-5)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量71，147Da，D值为1. 38 (图谱 见图2-5)
[0096] 实施例2-5
[0097] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚2h55min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0098] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0· 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在73, OOODa?77, 000Da，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0099] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-6)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量74, 844Da，D值为1. 26 (图谱 见图2-6)
[0100] 实施例2-6
[0101] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚2h30min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0102] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在78, OOODa?82, OOODa，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0103] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-7)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量80, 336Da，D值为1. 33 (图谱 见图2-7)
[0104] 实施例2-7
[0105] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚2h5min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0106] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在83, OOODa?87, OOODa，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0107] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-8)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量84, 481Da，D值为1. 29 (图谱 见图2-8)
[0108] 实施例2-8
[0109] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚lh40min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0110] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex-G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在88, OOODa?92, 000Da，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0111] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-9)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量90, 919Da，D值为1. 26 (图谱 见图2-9)
[0112] 实施例2-9
[0113] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双 氧水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚lhl5min。将该溶液用0. lmol/1的氢 氧化钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的 粗品。
[0114] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在93, OOODa?97, OOODa，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0115] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99. 0%的纯品（图谱见图1-10)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量95,821Da，D值为1.27 (图谱 见图2-10)
[0116] 实施例 2-10
[0117] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧 水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚55min。将该溶液用0. lmol/1的氢氧化 钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
[0118] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在98, OOODa?102, OOODa，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0119] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99. 0%的纯品（图谱见图1-11)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，TOSOH)色谱分析知该产品的重均分子量101，250Da，D值为1. 24 (图谱 见图2-11)
[0120] 实施例 2-11
[0121] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧 水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚40min。将该溶液用0. lmol/1的氢氧化 钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
[0122] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在103, OOODa?107, OOODa，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0123] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-12)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量103, 998Da，D值为1. 26 (图谱 见图2-12)
[0124] 实施例 2-12
[0125] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧 水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚30min。将该溶液用0. lmol/1的氢氧化 钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
[0126] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在108, OOODa?112, 000Da，D值< L 5,纯度为98%以上。
[0127] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99.0%的纯品（图谱见图1-13)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量109, 161Da，D值为1. 22 (图谱 见图2-13)
[0128] 实施例 2-13
[0129] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧 水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚20min。将该溶液用0. lmol/1的氢氧化 钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
[0130] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过sephadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在113, OOODa?117, OOODa，0值< L 5,纯度为98%以上。
[0131] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99. 0%的纯品（图谱见图1-14)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量115, 268Da，D值为1. 38 (图谱 见图2-14)
[0132] 实施例 2-14
[0133] 将上述实施例1中的海参糖胺聚糖纯品用5%醋酸配成5%的溶液，加入30%的双氧 水使溶液中双氧水的浓度为3%，40°C进行控制解聚10min。将该溶液用0. lmol/1的氢氧化 钠中和至中性，加入3倍体积的乙醇进行醇沉，静置，离心，得到解聚海参糖胺聚糖的粗品。
[0134] 该粗品干燥，溶于5倍重量的水中，过s印hadex_G75柱，用0. 5mol/l的氯化钠进 行洗脱，脱去盐及小分子杂质，脱盐后的样品冷冻干燥既得55g解聚海参糖胺聚糖，其分子 量都在118, OOODa?122, OOODa，D值< 1. 5,纯度为98%以上。
[0135] 该实例得到的解聚海参糖胺聚糖，经示差折光检测器（RID-10A，岛津）可得 到纯度为99. 0%的纯品（图谱见图1-15)，经该实例得到的解聚海参糖胺聚糖经凝胶柱 (TSKgelG4000PWXL，T0S0H)色谱分析知该产品的重均分子量121，017Da，D值为1. 36 (图谱 见图2-15)
[0136] 实施例3
[0137] 将以上获得的40. 0g海参糖胺聚糖或者解聚海参糖胺聚糖加入80g甘露醇、加入 注射用水l〇〇〇ml溶解，经过超滤、灌装、冻干，得到1000瓶注射用海参糖胺聚糖或者解聚海 参糖胺聚糖的冻干粉针剂。
[0138] 实施例4
[0139] 海参糖胺聚糖和解聚海参糖胺聚糖的药效学实验
[0140] 4. 1体外抗凝血实验
[0141] 4. 1.1试验材料
[0142] 供试样品：
[0143] 名称：解聚海参糖胺聚糖，以下缩写：DHG ;DHG_1 (实施例2-1)、DHG-2 (实施例 2-6);配制：精密吸取后以注射用生理盐水稀释至所需浓度。
[0144] 试验动物
[0145] 品系：兔；来源：上海陈行实验用兔有限公司；性别：雄性；体重：1850克；动物合 格证号：SCXK (沪）2008-0010。
[0146] 4. 1.2试验仪器
[0147] 血小板聚集凝血因子分析仪（型号LG-PABER北京世帝科学仪器公司）。
[0148] 4. 1.3实验方法
[0149] 实验当日，于样品池中分别加入兔血浆80 μ 1、0. 9%氯化钠溶液10 μ 1，预热180s 后，加入1%氯化钙溶液1〇μ 1，立即混匀，避免产生气泡，用血小板聚集凝血因子分析仪开 始计算时间，记录各样品池凝结时间，即为空白。
[0150] 精密量取对照品溶液，用0. 9%氯化钠溶液稀释成不同浓度的溶液，即为不同浓度 的样品溶液 DHG-1 (40. 0μ g/ml ?200. 0μ g/ml)、DHG-2 (30. 0μ g/ml ?200. 0μ g/ml)。
[0151] 用10 μ 1不同浓度的样品溶液代替10 μ 10. 9%氯化钠溶液，分别测定各浓度的样 品溶液的血浆凝结时间。每个浓度平行测定4次，求平均值。
[0152] 4. 1.4实验结果
[0153] 实验结果显示样品终浓度在DHG-1 (40. 0 μ g/ml?200. 0 μ g/ml)、DHG-2 (30. 0 μ g/ml?200. 0 μ g/ml)剂量范围内，随剂量增加凝血时间延长，凝血时间延长递增 趋势缓和。因此，解聚海参糖胺聚糖组合物用于抗凝血更具安全性，可控性。
[0154] 表1-1DHG-1体外抗凝血实验结果
[0155]
【权利要求】
1. 重均分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的海参糖胺聚糖中的 一段或者一段以上，在制备防治动脉血栓栓塞疾病药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血栓栓塞疾病包括动脉粥样硬化血 栓性疾病、静脉血栓栓塞性疾病、血液高凝状态、手术后形成的血栓或者是预防手术后血栓 的形成。
3. 根据权利要求1?2任一项所述的应用，其特征在于，所述的重均分子量大 于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖和天然分子段的海参糖胺聚糖包括重均分子量大于 54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量和天然分子段的海参糖胺聚糖，或者是重 均分子量大于54, 500Da的解聚海参糖胺聚糖任意一重均分子量和天然分子段的海参糖胺 聚糖的多段混合物。
4. 根据权利要求1?2任一项所述的应用，其特征在于，所述解聚海参糖胺聚糖的重均 分子量为： 54,500Da ?57,000Da、57,010Da ?62,990Da、63,000Da ?67,000Da、67,010Da ? 72,990Da、73,000Da ?77,000Da、77,010Da ?82,990Da、83,000Da ?87,000Da、 87,010Da ?92,990Da、93,000Da ?97,000Da、97,010Da ?102,900Da、103,000Da ? 107, 000Da、107, OlODa ?112, 990Da、113, OOODa ?117, 900Da 或 118, OOODa ?122, 050Da 中的任意一段。
5. 根据权利要求1?2任一项所述的应用，其特征在于，所述解聚海参糖胺聚糖的重均 分子量为： 54,500Da ?57,000Da、58,000Da ?62,000Da、63,000Da ?67,000Da、68,000Da ? 72,000Da、73,000Da ?77,000Da、78,000Da ?82,000Da、83,000Da ?87,000Da、 88,000Da ?92,000Da、93,000Da ?97,000Da、98,000Da ?102,000Da、103,000Da ? 107, 000、108, OOODa ?112, OOODa、113, OOODa ?117, OOODa、118, OOODa ?122, OOODa 中的 任意一段。
6. 根据权利要求1?2任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所 述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻 干粉针剂。
7. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所述的解聚 海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针 剂。
8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的权利要求所 述的解聚海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻 干粉针剂。
9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗有效量的所述的解聚 海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体，为静脉或皮下注射给药的注射液或者是冻干粉针 剂。
【文档编号】A61K31/726GK104147040SQ201310175750
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2013年5月13日
【发明者】王志国, 刘全海, 董玉琼 申请人:上海开润生物医药有限公司, 哈尔滨红豆杉生物制药有限公司