专利名称：一种siRNA分子及其抗肿瘤应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SiRNA分子，尤其是指靶向NET-1和VEGF基因的siRNA分子及其抗肿瘤应用。
背景技术：
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double-strand RNA,dsRNA)引发其同源信使RNA(messenger RNA, mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature.1998，391:806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20 25bp，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)。siRNA的一条链惨入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-1nduced silencing complex, RISC),与互补 RNA 的序列配对。RISC 首先介导 siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式,或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF)是诱导血管生成的促进因子，可促进内皮细胞分裂与增殖、促进血管生成以及增加微、小静脉的通透性，诱导丝氨酸蛋白酶与间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。VEGF在成熟器官中表达较低，在一些代谢旺盛、血供丰富的组织细胞中表达较`高，尤其是在肿瘤组织中。随着研究的深入，VEGF促进肿瘤血管生成的作用和与人类癌症的发病机制的关系是确定的，因此，抑制VEGF途径被确认为是一种重要的有效的抗癌治疗方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种siRNA分子及其抗肿瘤应用。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子，其特征在于，其序列由如下正义链和反义链1、2组成:正义链:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3’ (SEQ ID NO:1),反义链1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’ (SEQ ID NO:2),反义链2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’ (SEQ ID NO:3)；
上述SiRNA分子中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ；n代表N的个数，η是O 2的整数。换言之，上述双链siRNA分子的主干序列为:正义链:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUU-3’ (SEQ ID NO:4),反义链1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGC-3’ (SEQ ID NO:5),反义链2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGG-3，(SEQ ID NO:6)。优选地，所述的N为dT，且η为2。优选地，所述的η为O。本发明还提供了上述靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子在在制备抑制细胞中NET-1基因和VEGF基因功能的药物中的应用。本发明还提供了上述靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述的肿瘤为肝癌或肺癌。体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与NET-1和VEGF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到治疗肿瘤的目的·。本发明的有益效果是:本发明的双靶向SiRNA分子可以应用于制备调节细胞中NET-1基因和VEGF基因功能的药物中发挥RNA干扰的作用，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到抗肿瘤的目的。
图1-1是RT-QPCR检测肝癌细胞株H印G2各实验组NET-1和VEGF基因的mRNA表达水平结果图。图1-2是RT-QPCR检测肺癌细胞株A549各实验组NET-1和VEGF基因的mRNA表达水平结果图。图2是Western Blot检测各实验组NET-1蛋白表达水平结果图。其中，A为不同实验组NET-1和内参β-actin蛋白印迹结果图；B为不同实验组NET-1蛋白相对表达水平柱形图。图3是ELISA检测各实验组细胞中VEGF的含量结果柱形统计图。图4是CCK8法检测各实验组的细胞生长曲线图。图5是流式细胞术检测各实验组细胞凋亡结果图。其中，A为不同实验组的FCM分析结果图；B SAnnexin V和PI双染阳性细胞的定量柱形图。
具体实施例方式为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表不的意思和范围相同。其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
本发明的siRNA分子来源于针对NET-1和VEGF基因开放阅读框的功能保守区而设计。siRNA的制备可采用多种方法，比如:化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。本发明的siRNA分子可以作为制备调节细胞中NET-1基因和VEGF基因功能药物的有效成分，尤其是抗肿瘤药物的有效成分。出于应用目的，可将SiRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。实施例11、细胞培养肝癌细胞株H印G2和肺癌细胞株A549购于上海中科院细胞研究所，用含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)培养，所述的培养基中加入青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，其终浓度分别为100U/mL和100 μ g/mL,培养于37 °C 二氧化碳培养箱。2、siRNA 体外转染用在线设计软件(ThermosiDESIGN Center 和 Invitrogen BLOCK-1TRNAiDesigner)设计靶向NET-1 (基因库登录号:AF065388)和VEGF (基因库登录号:ΝΜ_001025366.2)基因的 siRNA 序列 NET-1siRNA 和 VEGF siRNA。并设计同时靶向 NET-1和VEGF基因的双靶向siRNA序列:VEGF_NET siRNA，设计方案参照公开号为CN102191246、名称为《多靶标干扰核酸分子及其应用》的中国发明专利进行，序列见表I。取步骤I中培养得到的处于对数生长期的细胞，按96孔板接种密度为5X IO4/孔、6孔板接种密度为IX IO6/孔接种 细胞，将其分为实验组和不转染siRNA的未处理组，所述的实验组包括NET-1siRNA转染组、VEGF siRNA转染组、VEGF-NET siRNA转染组.各实验组采用相应的siRNA按操作说明用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)转染到细胞内，使siRNA终浓度为50nM，37°C培养4h后，培养液换成含10% FBS (Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)ο所有的实验均重复3次，结果均用平均值土SD表示，用SPSS17.0进行统计学分析。统计学差异用单因素方差分析和双侧t检验。P <0.05表明差异显著。在所有的图表中，*、#表明与未处理组和双靶向siRNA组相比差异显著。表1:siRNA序列及对照序列 I VEGF ——IEXIj I GCUUCCUAC^CACAACAAttCSEQIDNO: 7)
权利要求
1.一种靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子，其特征在于，其序列由如下正义链和反义链1、2组成: 正义链:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3，，反义链 1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’，反义链 2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’ ； 上述siRNA分子中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ；η代表N的个数，η是O 2的整数。
2.如权利要求1所述的靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子，其特征在于，所述的N为dT,且η为2。
3.如权利要求1所述的靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子，其特征在于，所述的η为O。
4.权利要求1-3中任一项所述的靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子在在制备调节细胞中NET-1基因和VEGF基因功能的药物中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用 。
全文摘要
本发明提供了一种靶向VEGF和NET-1基因的双靶向siRNA双链分子，其特征在于，其序列由如下正义链和反义链1、2组成，其中正义链为5’-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3’，反义链1为5’-UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’，反义链2为5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；上述siRNA分子中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。本发明的siRNA分子可以应用于制备调节细胞中NET-1基因和VEGF基因功能的药物中发挥RNA干扰的作用，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和侵袭，达到抗肿瘤的目的。
文档编号A61K48/00GK103243100SQ201310206799
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月29日 优先权日2013年5月29日
发明者陈莉, 仲崇俊, 王建力, 张一心, 吴圆圆, 王桂兰, 周家名, 乔宇, 李铁军 申请人:南通大学, 南通市第一人民医院, 百奥迈科生物技术有限公司