一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，本发明公开了一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，该方法采用高温水提取、酸碱调pH值、超滤等方法有机结合，制备成注射液或粉针剂，该方法得到的制剂中分子量大于10000的物质小于等于多肽重量的5％，过敏性试验和稳定性试验表明，本发明方法制备成的制剂具有更优的质量。
【专利说明】一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种鹿瓜多肽新的制备方法。
【背景技术】
[0002]以鹿骨和甜瓜子为原料的药物制剂，主要是鹿瓜多肽注射制剂，该制剂具有调节 骨代谢、刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成的作用，亦可调节钙鳞代谢、增加骨钙沉积、防止 骨质疏松，并具有抗炎、镇痛、抗风湿等作用，已在临床广泛使用。
[0003]鹿瓜多肽注射制剂中骨诱导多肽类生物因子可有效促进机体内影响骨形成和吸 收的骨源性生长因子的合成，包括骨形态发生蛋白（BNPs)、β-转化生长因子（TGF-β)和 成纤维细胞生长因子（FGF)等，从而具有多种生物活性、促进细胞有丝分裂与分化的作用， 并具有容骨活性。其中BMPs是一种高效诱导物质，是间充质细胞向骨系细胞分化的最初 信号分子，能诱导血管周围游动的间充质细胞转化为不可逆性的骨系细胞，g卩软骨细胞和 成骨细胞，从而促进骨痂形成，诱导新骨形成，促进骨折修复；还可调节细胞外基质成分的 改变，通过与TGF-β和FGF相互之间地协调作用，更好地诱导新骨形成，使骨组织更成熟。 TGF-β则是一族具有多种的蛋白多肽，对成骨细胞及成软骨细胞有促进分化或降低分化的 双重作用，与多种因子如细胞外基质和其他分化调节生长因子一起协同参与对细胞分化的 调节，也可促进细胞外基质的合成，并对其新合成的基质降解有显著抑制作用；对于成骨细 胞也可促进其合成I型胶原、骨粘连素和骨桥蛋白；同时，TGF-β对淋巴细胞和巨噬细胞的 作用表明，它既能缓解炎性反应的破坏性，又能协助巨噬细胞来源的某些细胞因子在组织 修复中发挥作用。FGF是一组肝素粘合多肽，可刺激细胞的趋向移动、增殖和分化，增加合 成胶原细胞的数量，促进骨胶原蛋白及非胶原蛋白的合成，增加骨钙素的合成。甜瓜子提取 物是从葫芦科植物甜瓜的成熟干燥种子经特殊工艺提取而成，能降低骨折局部毛细血管通 透性，减少炎性渗出促进局部血运障碍的恢复；能降低全血粘度及红细胞聚集程度,改善骨 痂局部的血液循环，为骨细胞提供一个良好的供血环境；还能抑制前列腺素的释放，达到止 痛效果。在促进骨折早期愈合中，甜瓜子提取物与补充的骨诱导多肽类生物因子具有协同 作用，可促进骨源性生长因子的合成。鹿瓜多肽富含的多种游离氨基酸为骨细胞合成BNPs、 TGF-β和FGF等骨源性生长因子提供原料，从而促进骨源性生长因子的合成。其中的有机 钙、磷离子可参与钙磷代谢，维持骨容量。
[0004] 临床应用表明，以鹿骨和甜瓜子为原料的注射制剂是治疗骨折不愈合、骨质疏松 症、风湿、类风湿性关节炎、腕舟状骨缺血性坏死和软组织损伤等的有效药物，在骨科的应 用前景广阔。
[0005] 随着该制剂的临床应用越来越广泛，出现一些不良反应，虽然不良反应率比较低， 但药物关系到人的生命，提高其产品质量是重中之重。
【发明内容】
[0006] 基于上述原因， 申请人:采用高温水提取技术、超滤技术相结合的方法，得到鹿骨提 取物和甜瓜子提取物，混合后超滤，制备成注射制剂，该方法制备得到注射制剂高分子量物 质不超过5%，稳定性试验表明，该制剂具有更好的稳定性。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0008] 一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其制备方法为：鹿骨和甜瓜子的重量比^ 卜4 : 1-4,鹿骨采用高温水提取，酸调pH值，碱调pH值，超滤，获得鹿骨提取液；甜瓜子采 用高温水提取，酸调pH值，碱调pH值，离心后超滤，获得甜瓜子提取液；将鹿骨提取液和甜 瓜子提取液混合后，超滤，制备成注射液；或者将鹿骨提取液和甜瓜子提取液混合后，超滤， 冷冻干燥，制备成粉针剂。
[0009] 其中鹿骨提取液制备方法为：
[0010] 取鹿骨去掉骨髓，粉碎，加入鹿骨重量的2-4倍的注射用水，12〇°C-125°C提取 3次，每次3小时-5小时，合并提取液，过滤，滤液用酸调pH值为2. 5-3. 5,0°C _5°C静置 12-24小时，过滤，滤液用碱调pH9. 0-11. 0,0°C _5°C静置12-24小时，过滤，滤液用酸调PH 值6. 5-7. 5,滤液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为 1万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液， 浓缩至含多肽含量l-3mg/ml，得到鹿骨提取液；
[0011] 其中甜瓜子制备方法为：
[0012] 取甜瓜子，粉碎，加入甜瓜子重量的2-4倍的注射用水，120°C -125°C提取3次， 每次3小时-5小时，合并提取液，过滤，滤液用酸调pH值为2. 5-3. 5,0°C -5°C静置12_24 小时，过滤，滤液用碱调ρΗ9· 0-11. 0,0°C _5°C静置12-24小时，过滤，滤液用酸调pH值 6. 5-7. 5,在l5〇0〇-l7〇OOr/min离心5-10分钟，取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超 滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分 子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量i- 3mg/ml，得到甜瓜子提取液；
[0013] 其中注射液的制备方法为：
[0014] 按照多肽含量重量比1-3 : 0.5-1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，力口 入活性炭，过滤，滤液用截取分子量8〇00的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0. 22 μ m滤 芯过滤，浓缩至多肽含量为3_6mg/ml，灌装，得到注射液；
[0015] 其中粉针剂的制备方法为：
[0016] 按照多肽含量重量比1-3 : 0.5-1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，力口 入活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经〇· 22 μ m滤 芯过滤，浓缩至多肽含量为3-6mg/ml，灌装，冷冻干燥，得到冻千粉针剂。
[0017] 其中制备方法中酸为醋酸、枸橼酸、马来酸、乳酸或酒石酸。
[0018] 其中制备方法中碱为枸橼酸钠、醋酸钠、二乙醇胺或乙二胺。
[0019] 一、过敏性反应试验研究
[0020] 试验1组：药物组合物鹿骨400g，甜瓜子i〇〇g，制备成注射液，其中分子量大于 10000占多肽重量的5. 5%。
[0021] (1)取鹿骨去掉骨髓，粉碎，取400g，加水WOOg，于12rc提取3次，每次4小时， 合并提取液，过滤，滤液用盐酸调pH值为3. 0,(TC静置I6小时，过滤，滤液用氢氧化钠调 pH10.0,0°C静置I6小时，过滤，滤液用盐酸调pH值7.0,滤液用截取分子量为10万的超滤 膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截 取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量2mg/ml，得到鹿骨提取液； [0022] (2)取甜瓜子100g，粉碎，加入甜瓜子重量的3倍的注射用水，1211：提取3次，每 次4小时，合并提取液，过滤，滤液用盐酸调pH值为3. 0, (TC静置18小时，过滤，滤液用氢氧 化钠调pHIO· 0,0°C静置12小时，过滤,滤液用盐酸调PH值7. 0,在16000r/min离心1〇分 钟，取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万 的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为 8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩 至含多肽含量2mg/ml，得到甜瓜子提取液；
[0023] (3)按照多肽含量重量比2 : 1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入 活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0. 22 μ m滤芯 过滤，浓缩至多肽含量为4mg/ml，灌装，得到注射液；
[0024]试验2组：药物组合物鹿骨400g，甜瓜子l〇〇g，制备成注射液，其中分子量大于 10000占多肽重量的5.0%。
[0025] ⑴取鹿骨去掉骨髓，取400g粉碎，加入鹿骨重量的2倍的注射用水，125<C提取 3 次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液用枸橼酸调pH值为2· 5,5Γ静置12小时，过滤，滤 液用枸橼酸钠调ΡΗ9. 0,5°C静置12小时，过滤，滤液用枸橼酸调ΡΗ值6. 5,滤液用截取分子 量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为i万的超滤膜超滤，保留透过 液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量1. 5mg/mi， 得到鹿骨提取液；
[0026] ⑵取甜瓜子100g，粉碎，加入甜瓜子重量的2倍的注射用水，12δΓ提取3次，每 次3小时，合并提取液，过滤，滤液用枸橼酸调pH值为3. 0, 5。(：静置12小时，过滤，滤液用枸 橼酸钠调pH9· 0, 5°C静置24小时，过滤，滤液用枸橼酸调PH值6. 5,在15000r/min离心5 分钟，取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1 万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为 8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓 缩至含多肽含量1. 5mg/ml，得到甜瓜子提取液；
[0027] (3)按照多肽含量重量比2 : 1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入 活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0. 22 μ m滤芯 过滤，浓缩至多肽含量为4mg/ml,灌装，得到注射液；
[0028]试验3组：药物组合物鹿骨400g，甜瓜子l〇〇g，制备成注射液，其中分子量大于 10000占多肽重量的4. 0%。
[0029] ⑴取鹿骨去掉骨髓，取400g粉碎，加入鹿骨重量的2. 5倍的注射用水，122?提取 3次，每次4. 5小时，合并提取液，过滤，滤液用乳酸调pH值为3. 3, 3。〇静置20小时，过滤， 滤液用醋酸钠调PH10. 5,3°C静置2〇小时，过滤，滤液用乳酸调pH值7. 3,滤液用截取分子 量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为丨万的超滤膜超滤，保留透过 液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量2. 5mg/ml， 得到鹿骨提取液；
[0030] ⑵取甜瓜子100g，粉碎，加入甜瓜子重量的2. 5倍的注射用水，1241：提取3次， 每次3_ 5小时，合并提取液，过滤，滤液用乳酸调pH值为3· 〇, 3-C静置22小时，过滤，滤液 用醋酸钠调pHIO. 5,3°C静置22小时，过滤，滤液用乳酸调pH值7. 2,在15500r/min离心6 分钟，取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1 万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓 缩至含多肽含量2. 5mg/ml，得到甜瓜子提取液；
[0031] (3)按照多肽含量重量比2 : 1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入 活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0· 22 μ m滤芯 过滤，浓缩至多肽含量为4mg/ml，灌装，得到注射液；
[0032] 试验4组：药物组合物鹿骨400g，甜瓜子100g，制备成注射液，其中分子量大于 10000占多肽重量的2. 8%。
[0033] (1)取鹿骨去掉骨髓，取400g粉碎，加入鹿骨重量的3. 5倍的注射用水，121°C提取 3次，每次4小时，合并提取液，过滤，滤液用酒石酸调pH值为3· 〇, (TC静置16时，过滤，滤 液用乙二胺调PH10. 0, 〇°C静置16小时，过滤，滤液用酒石酸调pH值7· 0,滤液用截取分子 量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万的超滤膜超滤，保留透过 液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量2mg/ml，得 到鹿骨提取液；
[0034] (2)取甜瓜子，粉碎，加入甜瓜子重量的3倍的注射用水，121°C提取3次，每次4小 时，合并提取液，过滤，滤液用酒石酸调pH值为3. 0,0°C静置16小时，过滤，滤液用乙二胺 调ρΗ10· 0,0°C静置I6小时，过滤，滤液用酒石酸调PH值7_ 〇,在l6〇〇〇r/min离心8分钟， 取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万的 超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至 含多肽含量2mg/ml，得到甜瓜子提取液；
[0035] (3)按照多肽含量重量比2 : 1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入 活性炭，过滤，滤液用截取分子量8〇00的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0· 22 μ m滤芯 过滤，浓缩至多肽含量为4mg/ml,灌装，得到注射液；
[0036] 试验5组：药物组合物鹿骨400g，甜瓜子100g，制备成注射液，其中分子量大于 10000占多肽重量的0.80%。
[0037] (1)取鹿骨去掉骨髓，取400g粉碎，加入鹿骨重量的3倍的注射用水，121°C提取3 次，每次4. 5小时，合并提取液，过滤，滤液用枸橼酸调PH值为3. 0,2?静置20小时，过滤， 滤液用枸橼酸钠调ρΗ10· 0,2°C静置20小时，过滤，滤液用枸橼酸调pH值7. 0,滤液用截取 分子量为1〇万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万的超滤膜超滤，保留 透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量2mg/ ml，得到鹿骨提取液；
[0038] ⑵取甜瓜子，粉碎，加入甜瓜子重量的3倍的注射用水，121?提取3次，每次4小 时，合并提取液，过滤，滤液用枸橼酸调pH值为3. 0, 2°C静置22小时，过滤，滤液用枸橼酸纳 调ρΗ10· 0, 2°C静置22小时，过滤，滤液用枸橼酸调PH值7· 0,在l6〇OOr/min离心8分钟， 取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1万^ 超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液,浓缩至 含多肽含量l-3mg/ml,得到甜瓜子提取液；
[0039] ⑶按照多肽含量重量比2 : 1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入 活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0· 22 μ m滤芯 过滤，浓缩至多肽含量为4mg/ml，灌装，得到注射液；
[0040] 试验动物：雄性BN大鼠，SPF级，体重180-200g。
[0041]试验方法：取大鼠，随机分组，对照组、试验药物1组至试验药物5组，按临床等倍 剂量腹腔注射给予BN大鼠，0· 8mL/kg，隔日注射1次，连续3次。对照组注射无菌生理盐 水。第3次注射药物隔日，再给予药物6mL/kg，尾静脉注射给药，对照组给予无菌生理盐 水，各组动物给药 3〇分钟，取眼眶血，采血后将动物处死，取出肺脏和气管，取血清用于检 测组胺含量。取大鼠的肺、支气管组织lOOmg,加入i mL匀浆液，液氮中反复冻融3次，每次 lOmin,然后在冰浴中超声3X4s，4°C 12000r/min离心30min。取上清，蛋白定量后，ELISA 测组胺含量，采用试剂盒提供的方法进行测定。
[0042] 试验结果：见表1。
[0043] 表1对BN大鼠血清和组织中组胺含量的影响
[0044]
【权利要求】
1. 一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其特征在于：鹿骨和甜瓜子的重量比为 1-4 : 1-4,鹿骨采用高温水提取，酸调pH值，碱调pH值，超滤，获得鹿骨提取液；甜瓜子采 用高温水提取，酸调pH值，碱调pH值，离心后超滤，获得甜瓜子提取液；将鹿骨提取液和甜 瓜子提取液混合后，超滤，制备成注射液；或者将鹿骨提取液和甜瓜子提取液混合后，超滤， 冷冻干燥，制备成粉针剂。
2. 根据权利要求1所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中鹿骨提取液制备方 法为： 取鹿骨去掉骨髓，粉碎，加入鹿骨重量的2-4倍的注射用水，120°C _125°C提取3次， 每次3小时-5小时，合并提取液，过滤，滤液用酸调pH值为2. 5-3. 5,0°C -5°C静置12-24 小时，过滤，滤液用碱调pH9. 0-11.0,0°C -5°C静置12-24小时，过滤，滤液用酸调pH值 6. 5-7-5,滤液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为1 万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的超滤膜超滤，保留透过液，浓 缩至含多肽含量l_3mg/ml，得到鹿骨提取液。
3. 根据权利要求1所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中甜瓜子制备方法 为： 取甜瓜子，粉碎，加入甜瓜子重量的2-4倍的注射用水，120°C _125°C提取3次，每次3 小时-5小时，合并提取液，过滤，滤液用酸调pH值为2. 5-3. 5,0°C _5°C静置12-24小时，过 滤，滤液用碱调PH9. 0-11. 0,0°C _5°C静置12-24小时，过滤，滤液用酸调pH值6. 5-7. 5,在 15000-17000r/min离心5-10分钟，取上清液用截取分子量为10万的超滤膜超滤，保留透过 液，透过液用截取分子量为1万的超滤膜超滤，保留透过液，透过液用截取分子量为8000的 超滤膜超滤，保留透过液，浓缩至含多肽含量l_3mg/ml，得到甜瓜子提取液。
4. 根据权利要求1所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中注射液的制备方法 为： 按照多肽含量重量比1-3 : 0.5-1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入活 性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0. 22 μ m滤芯过 滤，浓缩至多肽含量为3-6mg/ml，灌装，得到注射液。
5. 根据权利要求1所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中粉针剂的制备方法 为： 按照多肽含量重量比1-3 : 0.5-1混合鹿骨提取液和甜瓜子提取液，混合完全，加入活 性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0. 22 μ m滤芯过 滤，浓缩至多肽含量为3-6mg/ml，灌装，冷冻干燥，得到冻干粉针剂。
6. 根据权利要求2或3所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中制备方法中酸 为醋酸、枸橼酸、马来酸、乳酸或酒石酸。
7. 根据权利要求2或3所述的一种鹿瓜多肽注射制剂的制备方法，其中制备方法中碱 为枸橼酸钠、醋酸钠、二乙醇胺或乙二胺。
【文档编号】A61P19/10GK104248652SQ201310257400
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】朱吉满 申请人:哈尔滨誉衡药业股份有限公司