牙齿相关干细胞的新用途
【专利摘要】牙齿相关干细胞的新用途。提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗牙齿相关疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病、与T淋巴细胞异常活化或升高相关的疾病、红斑狼疮或系统性红斑狼疮的产品，或者制备用于修复牙齿相关组织的产品中的新用途。还提供了包含牙齿相关干细胞的组合物以及使用牙齿相关干细胞预防或治疗疾病的方法。
【专利说明】牙齿相关干细胞的新用途
[0001]本申请为申请号为201080005266.5、发明名称为“牙齿相关干细胞的新用途”的发
明申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及牙齿相关干细胞的新用途。具体地，本发明涉及牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途；还涉及牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途；还涉及根据上述用途的治疗方法；还涉及包含牙齿相关干细胞的组合物。
【背景技术】
[0003]干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原始细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。在成体组织及器官中普遍存在着特异的成体干细胞，目前已经发现的例如来源于人的牙齿相关干细胞都是来源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),包括牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stem cellsfrom human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cells, PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)(1-4，即指文献I至4，下同)，它们可以来源于多种动物(例如哺乳动物，例如人)。研究表明牙齿相关干细胞具有很高的增殖能力和多向分化潜能，能够向成骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞分化。当把牙齿相关干细胞和三维支架材料的复合物植入到裸鼠皮下时，能够产生自体牙髓牙本质复合体样结构和牙骨质牙周膜复合体样结构(1，3)。目前在自体小型猪模型上已经应用I3DLSCs和SCAP成功再生出生物牙根(4)。目前国际上干细胞研究焦点之一集中在建立各种组织成体干细胞库，进行干细胞的临床试验研究。
[0004]根据WH0(2003)统计数字表明，牙齿相关疾病所波及的人群范围已远远超过其它任何一种疾病。目前，全世界每年用于牙齿疾病的治疗费用已超过200亿美元。在牙齿相关疾病中，牙周病是一种全世界范围内发病率很高的细菌感染性疾病，最终导致牙齿支持组织丧失和牙齿缺失，并能引起一系列的全身系统性疾病(13);而牙齿缺失可对人体消化系统和全身健康造成严重的影响，同时也会使患者产生不良的社会心理影响。但目前对牙周病及牙齿组织缺损没有好的药物或治疗方法进行治疗或修复；有关牙齿缺失的治疗主要仍是采用人工材料制作牙齿的替代物。
[0005]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是以多脏器受累和血中存在多种抗体为特征的自身免疫病，常规的免疫抑制或免疫调节治疗可使多数患者的生存期延长，生活质量得到改善。1996年意大利学者Marmont首先报道用自体骨髓移植治疗重症红斑狼疮取得成功后，国内外迅速开展了自体外周血干细胞移植和自体骨髓移植治疗重症SLE等多种难治性免疫病，取得了较好的疗效。造血干细胞移植能使部分患者达到病情控制，但其费用高、并发症多，病情复发率高达40%-50%，不能被常规使用；并且，移植后虽然部分患者有可能达到长期缓解，但均不能彻底根治自身免疫性疾病，部分患者存在复发的问题。
[0006]因此，目前仍然需要可有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供有效治疗某些牙齿相关疾病和某些免疫性疾病的新颖方法。本发明人在研究中现出人意料地发现牙齿相关干细胞例如牙周膜干细胞(PDLSCs)不但在自体的牙齿中使缺损的牙齿组织再生，而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生，同时TOLSCs还对异常升高的T淋巴细胞有抑制作用。本发明基于上述研究结果得以完成。
[0008]发明概沭
[0009]本发明首先涉及TOLSCs在制备用于预防或治疗牙周病，牙齿缺损修复的产品中用途。
[0010]本发明还涉及TOLSCs在制备用于预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的产品中用途。
[0011]本发明还涉及一种预防或治疗牙周病，修复缺损牙齿组织的方法，其包括给予需预防或治疗牙周病或需修复缺损牙齿组织的宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组织量的I3DLSCs。
[0012]本发明涉及一种预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的方法，其包括给予T淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有效量的roLSCs。
[0013]发明详沭
[0014]更详细地，本发明提供了以下的各个方面以及各个方面的具体项。
[0015]本发明第一方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。
[0016]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
[0017]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0018]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自:牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0019]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自:牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。
[0020]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的牙齿相关的疾病或病情，或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。
[0021]根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙齿、牙根、牙髓、牙龈等等，以及其它与牙齿内部、牙齿表层、牙齿表面或者牙齿周围相关的组织。
[0022]本发明第一方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。
[0023]本发明第二方面提供了牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。
[0024]根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
[0025]根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0026]根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自:牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0027]根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。
[0028]本发明第二方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。
[0029]本发明第三方面提供了预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的方法，或者形成或修复牙齿相关组织的方法，该方法包括给有需要预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞，或者该方法包括给有需要形成或修复牙齿相关组织的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞。
[0030]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
[0031]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0032]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自:牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0033]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自:牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。
[0034]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的牙齿相关的疾病或病情，或者用于自体或异体的牙齿相关组织形成或修复。
[0035]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关组织包括但不限于牙齿、牙根、牙髓、牙龈等等，以及其它与牙齿内部、牙齿表层、牙齿表面或者牙齿周围相关的组织。
[0036]根据本发明第三方面任一项的方法，其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方案中，所述的宿主是选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0037]在本发明第三方面任一项方法的一个实施方案中，其包括以下步骤:
[0038](a)采集人牙周膜；
[0039](b)培养 hPDLSCs ；
[0040](c)任选地冷冻保存M3DLSCs ；
[0041](d)任选地融化hPDLSCs，以及任选地对hTOLSCs检查支原体、细菌、集落形成效率、间质干细胞标记模式和核型分析；
[0042](e)制备 hPDLSCs 片；
[0043](f)将HA/TCP置于容纳有hPDLSCs片的器皿中；
.[0044](j)在任选的牙周初始治疗后，将hTOLSCs片与HA/TCP植入到牙周损伤缺陷处；
[0045](k)任选的进行临床和放射照相评价、血液学和免疫学评价。
[0046]本发明第三方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。
[0047]本发明第四方面提供了预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的方法，该方法包括给有此需要的宿主施用有效量的牙齿相关干细胞。
[0048]根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
[0049]根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0050]根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自:牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0051]根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的牙齿相关干细胞用于自体或者异体的免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。[0052]根据本发明第四方面任一项的方法，其中所述的宿主是哺乳动物。在一个实施方案中，所述的宿主是选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0053]本发明第四方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。
[0054]本发明第五方面提供了一种组合物，其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药学可接受的载体。
[0055]根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
[0056]根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物。在一个实施方案中，所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0057]根据本发明第五方面任一项的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，并且选自:牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontalligament stem cells,PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。
[0058]根据本发明第五方面任一项的组合物，其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情，或者用于牙齿相关组织形成或修复，或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。
[0059]根据本发明 第五方面任一项的组合物，其中所述的有效量是可以有效地用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的剂量，或者是要以有效地用于牙齿相关组织形成或修复的剂量，或者是要以有效地用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的剂量。
[0060]本发明第五方面及其各子项的特征和优点同样适用于本发明其它任一方面及其各子项。
[0061]根据本发明上下文的详细记载，本发明令人满意地实现上上述的各个方面及其各子项。
[0062]下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
[0063]本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
[0064]本发明人在研究中现出人意料地发现TOLSCs等牙齿相关的干细胞不但在自体的牙齿中使缺损的牙齿组织再生，而且能在异体缺损的牙齿组织使牙齿组织再生。本发明基于上述研究结果得以完成。因此，本发明涉及牙齿相关干细胞例如roLSCs在制备用于预防或治疗牙周病，牙齿缺损修复的产品中用途(例如图8所示)；还涉及一种预防或治疗牙周病，修复缺损牙齿组织的方法，其包括给予需预防或治疗牙周病或需修复缺损牙齿组织的宿主以有效预防或治疗量或修复缺损牙齿组织量的牙齿相关干细胞例如roLSCs。
[0065]此外，本发明提出生物牙根再生的新理念；利用自体异体SCAP/DPSCs和TOLSCs再生出了具有生物学功能的生物牙根，在新形成的功能性生物牙根上再进行冠的修复，恢复患者的咀嚼功能(例如图10所示)；提供生物牙根再生的具体实施方法，为进一步对生物牙根再生的机理进行深入研究及生物牙根的商品化提供依据。因此，本发明涉及生物牙根再生的新理念，并涉及SCAP，DPSCs, PDLSCs等牙齿相关的干细胞在生物牙根再生中的用途。本发明还涉及生物牙根再生的具体实施办法，其中包括牙周膜干细胞膜片的制备及其所需最佳细胞数及最佳生长时间。
[0066]再者，本发明涉及牙齿相关干细胞例如TOLSCs在制备用于预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的产品中用途。本发明还涉及一种预防或治疗与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或症状的方法，其包括给予T淋巴细胞异常升高的宿主预防或治疗有效量的牙齿相关干细胞例如roLSCs。本发明进一步涉及牙齿相关干细胞例如SHED在预防或治疗系统性红斑狼疮病等自身免疫系统病中用途(例如图11所示)。
[0067]根据本发明，术语“牙周病”包括但不限于牙周炎。
[0068]根据本发明，术语“缺损牙齿组织”包括但不限于宿主牙齿的各种缺损情况，如各种原因引起的牙齿脱落。
[0069]根据本发明，术语“宿主”通常指哺乳动物，包括但不限于人，猪，牛，马等。在一个实施方案中，术语“宿主”是指人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
[0070]根据本发明，术语“产品”是指适于roLSCs应用的各种形式。根据本发明，术语“产品”还指适于牙齿相关干细胞 应用的各种形式，例如组合物、药物组合物等。
[0071]根据本发明，术语“与牙齿相关的疾病或病情”是指本文所述宿主罹患或者表现的疾病、病情、体症、身体状态等，这些疾病、病情、体症、身体状态等与牙齿相关。
[0072]根据本发明，术语“牙齿相关组织形成或修复”或者术语“牙齿相关组织的形成或修复”或者“形成或修复牙齿相关组织”等，它们具有相同或近似的含义，并且通常是指本文所述宿主的牙齿相关组织进行形成、修复、生成、再生、培养等处理或操作，或者对牙齿相关组织异常(例如缺损)进行形成、修复、生成、再生、培养等处理或操作。
[0073]根据本发明，术语“组合物”是具有本领域技术人员通常理解的含义，并且通常是指可接或间接(例如临用前稀释)用于临床使用的形式，例如剂型、药物剂型、给药形式、等。在临床应用领域或者药物领域，术语“组合物”还通常与“药物组合物”具有同等含义。
[0074]可改变本发明组合物或药物组合物中牙齿相关干细胞的实际剂量水平，以便所得的干细胞量能有效针对具体宿主、患者在特定组合物及其组成以及相应给药方式的情况下得到所需的治疗或预防反应。剂量水平须根据具体干细胞的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度、疾病或病情的治疗进程、形成和修复(以及生成、再生、培养等)处理或操作的进程、以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，干细胞的剂量以及施用时间从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。因此，就本发明而言，本领域技术人员在本发明详细公开的信息的教导下，可以根据例如但不限于上述的具体情况来确定在具体情况下所适用的具体剂量，而无需要作具体限定。特别是，可以参考本发明实施例部分中所用的具体量来确定任一情况下的使用量，例如在本发明下文使用了具体剂量的五指山小型猪roLSCs，本领域技术人员可根据上述剂量并结合本领域公知技术教导将该剂量换算为人用条件下的剂量。
[0075]本发明牙齿相关干细胞可以单独(即以原样形式)或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将牙齿相关干细胞加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。在本发明的一个实施方案中，所述牙齿相关干细胞存在于细胞相容的介质(例如，生理盐水如0.9%生理盐水，等等)中。在本发明的一个实施方案中，所述牙齿相关干细胞存在于细胞相容的介质中，并且在低温下保存，例如在冷藏、冷冻等条件下保存，并且可任选在在临用前复溶成适用根据本发明精神而施用的形式。
【专利附图】
【附图说明】
[0076]图1.人TOLSCs免疫分子的表达:应用流式细胞术检测fPDLSCs和cPDLSCs相关免疫分子的表达。HLA-1，HLA-ΠDR,⑶80和⑶86的表达情况如图所示:fPDLSCs (76.2%±5.8%, η=5)和 cPDLSCs (78.5%±6.4%, η=5)表达 HLA-1,但是不表达HLA-Π DR和共刺激分子⑶80、⑶86。
[0077]图2.PDLSCs抑制T淋巴细胞增殖:(a) fPDLSCs/cPDLSC不会引起同种异体T淋巴细胞增殖。(b) fPDLSCs/cPDLSC剂量依赖性地抑制丝裂原PHA引起的T淋巴细胞增殖。(c)延迟加入fPDLSCs/cPDLSC也能够抑制PHA引起的T淋巴细胞增殖。(d) fPDLSCs/cPDLSC能够抑制双向混合淋巴细胞反应。
[0078]图3.PDLSCs通过分泌PGE2抑制T淋巴细胞增殖:(a)在Transwell培养实验中，PDLSCs也能抑制T淋巴细胞增殖.，提示I3DLSCs分泌可溶性因子来发挥免疫抑制作用。(b)在单纯roLSCs培养上清和MLR上清中都存在TGF- β 1，但是两者之间没有显著性差异。(c)PGE2的浓度在MLR中显著性升高。(d)中和实验表明抗TGF- β I抗体没有恢复T淋巴细胞增殖，PGE2抑制剂抵消了 I3DLSCs的免疫抑制作用，提示PGE2是介导TOLSCs免疫抑制作用的主要因子。(e，f)roLSCs的免疫抑制作用并没有引起T淋巴细胞的凋亡(e)，与单纯用PHA刺激T淋巴细胞后的凋亡率一致(f)。(g) I3DLSCs引起的被抑制的T淋巴细胞用PHA或者IL-2再刺激时可以重新恢复增殖。
[0079]图4.HGF和IL-10的测定:在单纯TOLSCs培养上清和MLR上清中都没有测到HGF和IL-10，说明这两种因子没有参与roLSCs介导的免疫抑制作用。
[0080]图5.PDLSCs介导的牙周组织再生:(a)在_4w和Ow,四组的临床指标之间没有显著性的差异。但是治疗后12周，自体或者同种异体roLSCs移植组的ro，GR和AL与空白对照组和HA/TCP相比显著恢复。(b，c, d, e)CT扫描显示治疗前都有明显的牙周骨缺损，而且缺损程度相近。治疗后12周，自体roLSCs组(h)和同种异体roLSCs组(i)完全获得了牙周骨再生。空白对照组几乎没有骨组织再生(f)，而HA/TCP组的骨缺损程度加重(g).(j，k，l，m)组织学研究发现自体或者同种异体roLSCs组在骨缺损区有明显的新骨和牙周组织再生。但是，典型的牙周炎表现如深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纤维在HA/TCP组和空白对照组仍然清晰可见。PD:探诊深度，GR:牙龈退缩，AL:附着丧失，D:牙本质，C:牙骨质，PDL:牙周膜，B:骨。
[0081]图6.同种异体TOLSCs移植不会引起免疫排斥反应:(a)在如图所示的各个时间点，同种异体roLSCs移植组的⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴细胞没有显著性差异；(b)在移植后3天，⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴细胞数目以及活化T淋巴细胞的标志物——⑶40L的表达情况在四个治疗组之间没有明显差异。
[0082]图7.移植后12w的免疫状况:在治疗后12w，⑶3+，⑶4+，⑶8+T淋巴细胞数目以及活化T淋巴细胞的标志物一⑶40L的表达情况在四个治疗组之间也没有明显差异。
[0083]图8.描绘了本发明的一个实施例中I3DLSCs介导的牙周组织再生。
[0084]图9.描绘了在小型猪上成功再生生物牙根。
[0085]图10.描绘了在小型猪上进行生物牙根再生获得成功。
[0086]图11.描绘了脱落乳牙牙髓干细胞治疗系统性红斑狼疮鼠血清及肾脏组织学改变。
[0087]图12.说明同种异体人牙周膜干细胞(hPDLSCs)用于治疗牙周病的标准操作的一个实例。
【具体实施方式】
[0088]通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰`。
[0089]本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
[0090]实施例1:PDLSCs对T淋巴细朐增葙的抑制作用
[0091]材料和方法
[0092]I)、人 PDLSCs
[0093]选取首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面外科门诊拔除的18-28岁的健康患者的正常第三磨牙，按照以往文献报道的方法分离和培养roLSCs (3)。人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准。为了下一步实验中应用冻存牙周膜干细胞(cryopreserved periodontal ligament stem cells, cFOLSCs),将部分新鲜分离的牙周膜干细胞(freshly isolated periodontal ligament stem cells, fPDLSCs)冻存在液氮中3个月。3个月后，冻存细胞在37°C水浴中快速解冻、接种、常规培养。在本研究中，应用的细胞都在第2-4代。在同一实验中，应用同一代的fPDLSCs和cPDLSCs。
[0094]2)、外周血单个核细朐
[0095]应用梯度密度离心法分离健康供者的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMCs)。
[0096]3)、杭体
[0097]本研究中应用抗人白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)_1、HLA-ΠDR, CD80、CD86 抗体(BD Biosciences)，抗 CD3、CD4、CD8、CD40L、转化生长因子β (transforming growth factor β , TGF- β )、肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor, HGF)抗体(Abeam),抗.1L-10、FITC 标记的抗.小鼠 IgG 抗.体(AbD Serotec)。
[0098]4)、流式细朐术
[0099]为了研究TOLSCs表面相关免疫分子的表达，将1.0X 106fPDLSCs或者cPDLSCs分别与抗HLA-1、HLA-ΠDR,⑶80或者⑶86抗体室温下孵育I小时。经过磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗后，细胞再与FITC标记的抗小鼠IgG 二抗室温下孵育30分钟。孵育结束后上流式细胞仪(BD Inmmunocytometry Systems)检测表达情况。
[0100]5)、混合淋巴细朐反应
[0101]作为刺激细胞，5.0X 104fPDLSCs或者cTOLSCs先在直线加速器下照射20Gy，然后加入等细胞量的同种异体PBMCs，在96孔板、0.2mlRPM1-1640中共同孵育5天。在结束反应前18个小时，每孔加入I μ Ci的3H-thymidine (3H-TdR)。18个小时后，在玻璃纤维滤纸上收集细胞，应用液体闪烁仪(PerkinElmer)计算3H-TdR掺入率。3H-TdR掺入率的结果以每分钟计数土标准差(CPM 土 SD)来表示。
[0102]为了研究I3DLSCs对增殖T淋巴细胞的影响以及此种影响是否具有剂量依赖性，在丝裂原促增殖实验中，以终浓度为0.5 μ g/mL的PHA (Sigma-Aldrich)刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖，与不同剂量的自体fPDLSCs或者cPDLSCs共孵育5天(PDLSCs的量分别为1.0X IO4, 5.0XlO4, 2.5 X IO5, 5.0XlO5)。结束孵育前18小时每孔加入I μ Ci的3H-TdR, 18小时后收集细胞并且计算3H-TdR掺入率。
[0103]进一步研究延迟加入roLSCs是否会影响T淋巴细胞增殖。先用终浓度为0.5 μ g/mL的PHA刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖2天，然后加入同等剂量的fPDLSCs或者cPDLSCs再共同孵育3天。3天后测定3H-TdR掺入率。
[0104]在证实roLSCs能够抑制丝裂原PHA引起的T淋巴细胞增殖后，我们观察I3DLSCs对双向混合淋巴细胞反应(mi xed lymphocyte reaction,MLR)的影响。来自两个不同个体的PBMCs (5.0X IO4)与等量的第三方fPDLSCs或者cTOLSCs共同孵育5天。结束孵育前18小时每孔加入I μ Ci的3H-TdR,孵育结束后收集细胞、计算3H-TdR掺入率。
[0105]6)、与PDLSCs共孵育后的T淋巴细胞的再次刺激
[0106]为了观察TOLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制是否可逆，我们进行了再激活实验。PBMCs (5.0XlO4)先与等量的PDLSCs和PHA (0.5 μ g/mL)共同孵育5天，然后把通过梯度密度离心法获得的T淋巴细胞与PHA(OjygAiL)或者重组人白介素2(interleukin2, IL-2, 50U/mL;R&D systems)共同反应 2 天。2 天后，应用 3H-TdR 掺入法测定T淋巴细胞增殖率。
[0107]7)、Transwell 培养实验
[0108]为了观察通过细胞-细胞直接接触还是I3DLSCs分泌可溶性因子来介导TOLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制,我们进行了 Transwell培养实验。Transwell培养系统(Costar)具有直径为0.4 μ m孔径的微膜，此微膜可以把两种细胞人为地分隔开来。将PBMCs (5.0X IO4)与PHA (0.5 μ g/mL)置于Transwell培养系统的上腔，而5.0 X IO4PDLSCs (从本实验开始，本研究的以下部分都用fPDLSCs)接种在下腔。5天后，应用3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞增殖率。
[0109]8)、可溶件因子的测定及中和实验[0110]当发现可溶性因子介导roLSCs对T淋巴细胞的增殖抑制后，我们应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immumosorbent assay, ELISA)来测定单纯 F1DLSCs 的培养上清(接种1-5天)和MLR培养上清(5.0 X IO4PDLSCs,等量PBMCs和0.5 μ g/mL的PHA)中 TGF_i3 1(R&D systems), HGF (R&D systems),前列腺素 E2 (prostaglandin E2,PGE2;Assay Designs)和 IL_10(R&D systems)的浓度。通过酶标仪(Molecules Devices)在 45Onm(TGF-0 I, HGF 和 IL-10)或者 405nm(PGE2)读取光密度值。
[0111]然后进彳丁中和实验，在Transwell培养系统中建立MLR的反应体系，包括PBMCs (5.0 X IO4)，PDLSCs (5.0 X IO4)和PHA (0.5 μ g/mL)，在反应的同时分别加入以下抗体或者试剂:抗TGF-β抗体(10ng/mL)，抗HGF抗体(10ng/mL)和抗IL-10抗体(10ng/mL)或者PGE2的抑制剂吲哚美辛(5 μ mol/L; Sigma-Aldrich)。5天后，通过3H-TdR掺入法测定T淋巴细胞增殖率。
[0112]9)、测定凋亡T淋巴细胞的百分率
[0113]建立MLR 的反应体系，包括 PBMCs (5.0 X IO4) ,PDLSCs (5.0XlO4)和 PHA (0.5 μ g/mL), 5天后应用Annexin V-Fluos凋亡试剂盒(Roche Diagnostics)来测定凋亡T淋巴细胞的百分率。
[0114]实施例2 =PDLSCs介导的牙周骨缺损修复
[0115]I)、材料和方法
[0116]五指山小型猪和贵州香猪￠-8月龄，体重30-40千克)由中国农业大学实验动物中心提供。本实验通过首都医科大学伦理委员会批准。小型猪尖牙roLSCs的分离和培养方法同人roLSCs。按照文献报道的方法(13)，制备12只雌性五指山小型猪的牙周炎骨缺损模型，总共制备24处下颌第一恒磨牙的牙周炎骨缺损。24处缺损随机分为以下4个组:【I】空白对照组，不做任何治疗；.【2】单纯材料组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料(武汉理工大学提供)、明胶海绵覆盖缺损、缝合；【3】自体TOLSCs移植组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0 X IO7五指山小型猪TOLSCs、明胶海绵覆盖缺损、缝合；【4】异体TOLSCs移植组，翻瓣、刮治、移植HA/TCP支架材料+2.0X IO7香猪PDLSCs、明胶海绵覆盖缺损、缝合。在制备牙周炎骨缺损模型前(_4w)、移植治疗前(Ow)和治疗后12w进行临床检查,包括探诊深度(probing depth,PD)、牙銀退缩(gingival recession,GR)和附着丧失(attachment loss,AL)。在Ow和治疗后12w应用CT(Siemens)观察骨再生的情况。在_4w、治疗后l-7d、2w、4w,8w和12w进行血常规检查、血生化检查、免疫球蛋白检查和T淋巴细胞相关标志物的检查，包括⑶3+细胞计数、⑶4+细胞计数、⑶8+细胞计数以及活化T淋巴细胞的标志物——⑶40L的表达情况。在治疗后12w，处死动物，从实验部位获取标本，固定、脱钙、石蜡包埋，行HE染色，观察组织再生情况。
[0117]通过Student ’ t检验和方差分析进行统计学分析，p<0.05认为是有统计学差异。
[0118]2)、结果和说明
[0119]2-1)、PDLSCs具有低免疫原性
[0120]首先观察到人roLSCs的免疫表型，发现fPDLSCs (76.2%±5.8%, n=5)和cPDLSCs (78.5%±6.4%, n=5)表达 HLA-1，但是不表达 HLA-Π DR 和共刺激分子 CD80、⑶86 (图1)，与体外培养扩增的BMSCs表达状况相似(23)。
[0121]进一步研究roLSCs作为抗原提呈细胞对T淋巴细胞增殖的影响。实验组为预先经过直线加速器20Gy照射的5.0X IO4PDLSCs与等量的同种异体PBMCs共孵育。作为阳性对照的T淋巴细胞增殖组为:5.0X IO4PBMCs与与等量的同种异体PBMCs共孵育。单独培养等量的PBMCs为阴性对照。结果表明，实验组I3DLSCs没有引起同种异体PBMCs增殖，而阳性对照组可以引起显著的
[0122]T淋巴细胞增殖(图2a)，提示TOLSCs具有低免疫原性。
[0123]2-2)、PDLSCs能够抑制T淋巴细朐增葙
[0124]进一步观察TOLSCs对丝裂原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖的影响。将fPDLSCs 和 cPDLSCs 接种，细胞量分别为:1.0XlO4, 5.0XlO4, 2.5 X IO5 和 5.0X 105，然后加入自体 PBMCs (5.0 X IO4)和终浓度为 0.5 μ g/mL 的 PHA0 PHA 刺激 PBMCs (5.0 X IO4)增殖为阳性对照。结果发现，PHA刺激的PBMCs增殖明显地被fPDLSCs或者cTOLSCs所抑制，而且这种抑制是剂量依赖性的。此种免疫抑制作用必须要求TOLSCs的存在，而不是由体积效应(bulk effect)引起，因为在增殖反应体系中加入等量的自体PBMCs不会引起抑制作用(图2b)。此外，即使在PHA刺激PBMCs (5.0XlO4)增殖后两天再加入I3DLSCs,仍然能够明显抑制T淋巴细胞的增殖(图2c)。我们进一步观察I3DLSCs对MLR的影响。来自两个不同个体的PBMCs和第三方的I3DLSCs共同孵育。结果表明，fPDLSCs和cTOLSCs都能够抑制双向MLR (图2d)。本部分实验数据表明，PDLSCs能够剂量依赖性地和抗原非特异性地抑制同种异体T细胞受体引起的和丝裂原引起的T淋巴细胞增殖。
[0125]2-3)、PDLSCs通讨分泌PGE2抑制T淋巴细朐增葙
[0126]我们进一步研究TOLSCs抑制T淋巴细胞增殖的机制问题。为了阐明是否通过PDLSCs和PBMCs细胞-细胞直接接触引起，我们首先进行了 Transwe 11培养实验，将TOLSCs和PBMCs人为地分隔开来。研究结果表明，无论是Transwell培养实验还是细胞-细胞直接接触实验，都能够取得相近的T淋巴细胞增殖抑制效果，提示这种免疫抑制作用与细胞-细胞直接接触无关，而是依靠可溶性因子的存在(图3a)。
[0127]通过ELISA，我们测定单纯TOLSCs培养上清中和MLR上清中几种可能性的可溶性因子。无论I3DLSCs培养上清还是MLR上清，都没有发现HGF和IL-10 (图4)。然后我们继续观察TGF-β I和PGE2，因为这两者被认为是BMSCs发挥免疫调节功能的主要因子(7，25)。如图3b和图3c所示，在接种后l-5d的PDLSCs培养上清中，TGF-β I和PGE2的浓度相对稳定，没有明显的波动。但是，在MLR上清中，PGE2的浓度达15.19±1.26ng/ml，与单纯PDLSCs培养的浓度相比明显升高，TGF-β I的浓度为1459.79±109.49pg/mL，没有明显变化。
[0128]我们通过在MLR体系中添加特异性的抗TGF- β，IL-10, HGF抗体和PGE2抑制剂来观察其恢复τ淋巴细胞增殖的能力，进一步确定roLSCs抑制τ淋巴细胞增殖的主要因子。结果发现，加入PGE2抑制剂能够显著恢复T淋巴细胞的增殖，而且此时的增殖力同单纯用PHA刺激PBMCs的增殖力相近(图3d)。而实验体系中加入抗TGF- β，IL-10, HGF的中和抗体并没有恢复T淋巴细胞的增殖(图3d)。这些数据表明PGE2是介导TOLSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要因子。
[0129]就BMSCs的免疫抑制机制而言，虽然目前尚不清楚哪一种因子发挥主导性的作用以及某些研究还存在不一致，但是大多数的研究认识还是通过BMSCs分泌抗增殖的可溶性因子比如IL-10，HGF, TGF- β I, PGE2,吲哚胺-2，3- 二氧化酶和一氧化氮(5，6，17，19，20，24-28)引起。Beyth等(28)报道IL-10是BMSCs免疫抑制作用的主要介导因子。DiNicola等(7)通过抗体中和实验发现TGF-β I和HGF是发挥作用的主要因素。另有研究表明PGE2的抑制剂能够抵消BMSCs的免疫抑制作用(25)。这些研究都表明了可溶性因子参与了 BMSCs的免疫抑制作用。我们的研究提示PGE2是TOLSCs抑制T淋巴细胞增殖的主要因子。
[0130]2-4)、PDLSCs的免疫抑制作用与T细胞凋亡无关，而是诱导T细胞无能
[0131]进一步研究TOLSCs的免疫抑制作用是否引起了 T淋巴细胞的凋亡。现发现，在PDLSCs、PBMCs和PHA的反应体系中，凋亡的T淋巴细胞比例与单纯PBMC、PHA反应体系相似，排除了 T淋巴细胞凋亡是引起免疫抑制的可能性(图3e，f)。然后，把被I3DLSCs抑制了 5天的T淋巴细胞提取，用PHA或者IL-2再刺激两天。结果发现，已经被抑制了的T淋巴细胞再次明显增殖，这种增殖程度与单纯PHA刺激PBMCs的程度相近似(图3g)。因此，可以认为I3DLSCs的T淋巴细胞增殖抑制是可逆的，通过诱导T淋巴细胞无能引起。
[0132]2-5)、PDLSCs介导的牙周纟目织再牛
[0133]鉴于roLSCs的免疫调节特性，研究同种异体I3DLSCs能否修复小型猪牙周炎骨缺损模型。在移植后12周，同种异体移植roLSCs组的ro为3.5±0.6mm,自体移植组的H)为3.3±0.4mm，HA/TCP组为13.1±1.1mm,空白对照组为10.6±1.3_。统计学分析表明自体或者同种异体I3DLSCs移植组与HA/TCP组和空白对照组相比牙周组织得到了明显再生，而自体或者同种异体roLSCs组之间并没有显著差异(图5a)。CT扫描显示自体和同种异体PDLSCs组的牙槽骨明显再生，基本恢复到了正常水平，而HA/TCP组和空白对照组仅仅少量再生或者没有再生(图5a-h)。组织学观察表明，在自体和同种异体TOLSCs组，明显再生出新骨、牙骨质和牙周纤维，在HA/TCP组和空白对照组，仍可见明显的牙周炎表现，包括深牙周袋、缺乏新生骨和牙周纤维(图5j-m)。此外，与移植治疗前4w相比，治疗后各时间点的血常规检查(表I)、血生化检查(表2)、免疫球蛋白检查(表3)和免疫学相关指标(图6，图7)都没有明显变化，表明 同种异体移植TOLSCs修复牙周炎骨缺损没有排斥反应的发生。
[0134]表I
[0135]
【权利要求】
1.牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情的产品中的用途，或者在制备用于牙齿相关组织形成或修复的产品中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述的牙齿相关干细胞来自哺乳动物，例如所述的牙齿相关干细胞来自选自以下的哺乳动物:人、猪(例如五指山小型猪、贵州香猪)、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊、山羊。
4.根据权利要求1至3任一项的用途，其中所述的与牙齿相关的疾病或病情或者牙齿相关组织形成或修复选自:牙周病、牙周炎、牙齿缺损、牙齿组织缺损、牙齿缺损修复、牙齿相关组织缺损和修复、牙齿相关组织替代物再生、等等。
5.牙齿相关干细胞在制备用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮的产品中的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
7.一种组合物，其包含有效量的牙齿相关干细胞和任选的药学可接受的载体。
8.根据权利要求7的组合物，其中所述的牙齿相关干细胞选自:牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、和根尖牙乳头干细胞。
9.根据权利要求7或8的组合物，其是用于预防或治疗与牙齿相关的疾病或病情，或者用于牙齿相关组织形成或修复，或者用于预防或治疗免疫性疾病或病情、自身免疫性疾病或病情、与T淋巴细胞异常活化有关`的疾病或病情、与T淋巴细胞异常升高有关的疾病或病情、红斑狼疮、或者系统性红斑狼疮。
【文档编号】A61K35/32GK103432007SQ201310273342
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2010年1月22日 优先权日:2009年1月23日
【发明者】王松灵, 施松涛, 丁刚 申请人:首都医科大学