一种具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制备方法和应用。所述提取物是来源于天竺桂、柴桂、油桂中的至少一种树皮的提取物，所述提取物中的总多酚含量达50wt%以上。本发明所述的桂皮多酚提取物的半数细胞致死浓度＞50μg/mL，且对丝裂原ConA诱导的淋巴细胞的增殖及参与免疫调节和炎症反应的重要细胞因子IL-6、IFN-γ的分泌均具有浓度依赖性的抑制作用，可望作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备治疗免疫性疾病的药物制剂，尤其可望作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备治疗类风湿性关节炎的药物制剂，具有药用价值。
【专利说明】一种具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制备方法和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种桂皮多酚提取物及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种具有 免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制备方法和应用，属于中药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 类风湿性关节炎（RA)是当前危害人类健康的最重要疾病之一，被称为"不死的癌 症"。RA是一种以多关节受累、滑膜炎症、骨与软骨破坏等为主要特征的慢性全身性自身免 疫炎性疾病，其发病机理至今尚未完全阐明，普遍认为与遗传、感染和免疫调节等因素紊乱 密切相关。我国RA的患病率约0. 3%?0. 4%，约有400万患者，病程5-10年致残率为60%， 晚期90%患者丧失社会劳动力和生活自理能力，是成人劳动力丧失的主要原因之一，因此 造成了很多家庭问题以及巨大的社会负担。现行治疗类风湿性关节炎的方法主要有手术治 疗、化学药物治疗和细胞因子类生物制剂的治疗。一般认为外科手术只适用于晚期畸形病 例，且费用昂贵，对机体创伤较大；化学药物如非留体抗炎药、抗风湿药和糖皮质激素等的 长期应用会引起胃肠道不适、骨髓抑制、肝损伤、高血压等严重的不良反应；生物制剂在干 预病变细胞的同时，对正常细胞也同样会产生一定的作用，干扰机体的固有免疫和适应性 免疫，从而产生较大的毒性和破坏机体防御作用的风险。因此，寻求高效低毒的防治RA的 药物仍是世界医学界面临的一项艰巨任务和难题。
[0003] 桂皮为樟科樟属植物肉桂、柴桂、天竺桂、锡兰桂、油桂等树皮的通称，为常用中 药，又为食品香料或烹饪调料。商品桂皮的原植物比较复杂，约有十余种。研究表明（上海 中医药杂志，2011年第45卷第5期第82?86页):不同种类桂皮的化学成分存在一定的差 异性，例如：肉桂中的总多酚含量为1. 31%，而柴桂中的总多酚含量为1. 92%。虽然李尧华等 报道（四川中医杂志，1989, 2 :28):用肉桂25g+绿豆200g+陈石灰适量治疗类风湿性关节炎 40例，显效34例，有效6例；但是对其作用机制还不明确，其发挥药效的物质基础也尚未弄 清。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有免疫抑制活性的桂 皮多酚提取物及其制备方法和应用。
[0005] 本发明所述的具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，是来源于天竺桂、柴桂、油桂 中的至少一种树皮的提取物，所述提取物中的总多酚含量达50wt%以上。
[0006] 进一步说，所述提取物中的总多酚含量达70wt%?90wt%。
[0007] 本发明所述提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0008] a)用乙醇水溶液或丙酮水溶液对天竺桂、柴桂、油桂中的至少一种树皮药材进行 提取；
[0009] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0010] c)用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其 中的乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位；
[0011] d)将乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树 脂柱，依次用3?5柱体积水、3?5柱体积lOvol%乙醇水溶液、3?5柱体积35vol%乙醇 水溶液和3?5柱体积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，干燥， 即得所述的提取物。
[0012] 步骤a)中所述的提取可以是冷浸提取、温浸提取或回流提取。
[0013] 步骤a)中所述的提取可以为1?3次；每次提取时，1克树皮药材使用5?50毫 升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
[0014] 上述的乙醇水溶液和丙酮水溶液的体积百分比浓度均优选为20%?70%。
[0015] 步骤c)中的萃取，每次用于萃取的乙酸乙酯的体积推荐为被萃取的粗提液体积 的0. 5?1. 5倍。
[0016] 步骤d)中所述的干燥优选为真空干燥或冷冻干燥。
[0017] 研究表明：本发明所述的桂皮多酚提取物的半数细胞致死浓度（CC50) >50 μ g/ mL，且对丝裂原ConA诱导的淋巴细胞的增殖及参与免疫调节和炎症反应的重要细胞因子 IL-6、IFN- γ的分泌均具有浓度依赖性的抑制作用,可望作为活性成分之一或唯一的活性 成分用于制备治疗免疫性疾病的药物制剂，尤其可望作为活性成分之一或唯一的活性成分 用于制备治疗类风湿性关节炎的药物制剂。
[0018] 本发明中所述的药物制剂形式是任何可药用的口服剂型或注射剂，包括：片剂、糖 衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲 齐IJ、丸剂、散剂、注射液、粉针剂等。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明，但并不因此限制本发明；本 领域的技术人员根据下述内容所作的一些非本质的改进或替换均属于本发明的保护范围。
[0020] 实施例中所用的天竺桂树皮药材产自江西上饶，实施例中所用的柴桂和油桂树皮 药材均产自云南。实施例中关于提取物中的总多酚含量的测定是参照文献"上海中医药杂 志，2011年第45卷第5期第83页"中所述方法。
[0021] 实施例1
[0022] a)在40°C用体积浓度为50%的丙酮水溶液对天竺桂树皮药材进行温浸提取1次， 其中：1克天竺桂树皮药材用50毫升丙酮水溶液；
[0023] b)减压蒸馏除去提取液中的丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0024] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0025] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用4柱体积水、4柱体积lOvol%乙醇水溶液、4柱体积35vol%乙醇水溶液和4柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0026] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为76wt%。
[0027] 实施例2
[0028] a)在室温下，用体积浓度为50%的丙酮水溶液对天竺桂树皮药材进行搅拌提取2 次，其中：1克天竺桂树皮药材用25毫升丙酮水溶液；
[0029] b)减压蒸馏除去提取液中的丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0030] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0031] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用4柱体积水、4柱体积lOvol%乙醇水溶液、4柱体积35vol%乙醇水溶液和4柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0032] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为72wt%。
[0033] 实施例3
[0034] a)在40°C用体积浓度为20%的丙酮水溶液对柴桂树皮药材进行温浸提取2次，其 中：1克柴桂树皮药材用25毫升丙酮水溶液；
[0035] b)减压蒸馏除去提取液中的丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0036] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1.5倍，共萃取2次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0037] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用4柱体积水、4柱体积lOvol%乙醇水溶液、4柱体积35vol%乙醇水溶液和4柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0038] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为70wt%。
[0039] 实施例4
[0040] a)用体积浓度为20%的丙酮水溶液对柴桂树皮药材进行回流提取1次，其中：1克 柴桂树皮药材用50毫升丙酮水溶液；
[0041] b)减压蒸馏除去提取液中的丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0042] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0043] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用5柱体积水、5柱体积lOvol%乙醇水溶液、5柱体积35vol%乙醇水溶液和5柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0044] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为70wt%。
[0045] 实施例5
[0046] a)在室温下，用体积浓度为70%的乙醇水溶液对柴桂树皮药材进行搅拌提取1次， 其中：1克柴桂树皮药材用50毫升乙醇水溶液；
[0047] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0048] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0049] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用5柱体积水、5柱体积lOvol%乙醇水溶液、5柱体积35vol%乙醇水溶液和5柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0050] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为78wt%。
[0051] 实施例6
[0052] a)在室温下，用体积浓度为50%的乙醇水溶液对油桂树皮药材进行搅拌提取2次， 其中：1克油桂树皮药材用25毫升乙醇水溶液；
[0053] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0054] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0055] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用3柱体积水、3柱体积lOvol%乙醇水溶液、3柱体积35vol%乙醇水溶液和3柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0056] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为81wt%。
[0057] 实施例7
[0058] a)用体积浓度为20%的乙醇水溶液对油桂树皮药材进行回流提取3次，其中：1克 油桂树皮药材用10毫升乙醇水溶液；
[0059] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0060] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的〇. 5倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0061] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用3柱体积水、3柱体积lOvol%乙醇水溶液、3柱体积35vol%乙醇水溶液和3柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0062] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为71wt%。
[0063] 实施例8
[0064] a)在40°C下，用体积浓度为70%的乙醇水溶液对油桂树皮药材进行温浸提取2 次，其中：1克油桂树皮药材用25毫升乙醇水溶液；
[0065] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0066] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0067] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用3柱体积水、3柱体积lOvol%乙醇水溶液、3柱体积35vol%乙醇水溶液和3柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0068] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为76wt%。
[0069] 实施例9
[0070] a)用体积浓度为70%的乙醇水溶液对油桂树皮药材进行回流提取1次，其中：1克 油桂树皮药材用50毫升乙醇水溶液；
[0071] b)减压蒸馏除去提取液中的乙醇，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0072] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0073] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用3柱体积水、3柱体积lOvol%乙醇水溶液、4柱体积35vol%乙醇水溶液和4柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0074] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为78wt%。
[0075] 实施例10
[0076] a)在40°C下，用体积浓度为50%的丙酮水溶液对油桂树皮药材进行温浸提取2 次，其中：1克油桂树皮药材用30毫升丙酮水溶液；
[0077] b)减压蒸馏除去提取液中的丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液；
[0078] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体 积的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0079] d)将得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂 柱，依次用3柱体积水、3柱体积lOvol%乙醇水溶液、3柱体积35vol%乙醇水溶液和3柱体 积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，冷冻干燥，即得本发明所述 的提取物。
[0080] 经测定分析，本实施例制得的提取物中，总多酚的含量为73wt%。
[0081] 实施例11
[0082] 用MTT法检测本发明所述的桂皮多酚提取物的细胞毒性：
[0083] 样品组：用RPMI-1640培养液对实施例2、5、6、10所制备的提取物分别配制成浓度 为 12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL 及 50 μ g/mL 的溶液；
[0084] 对照组：RPMI-1640培养液；
[0085] 将BALB/c小鼠脾淋巴细胞（4X IO5个/孔)与各实验组样品分别共培养48h，在培 养结束前4h加入MTT溶液（5mg/mL)。培养结束后，吸去培养上清150 μ 1，再加150 μ I DMSO 溶解甲臜颗粒，低速摇床l〇min，用酶标仪于570nm处读取OD值。
[0086] 检测各实验组的细胞活性值（0D值)，详细检测结果见表1所示。
[0087] 表1各实验组在作用48h后所测的细胞OD值（Xrhi, ;2=5)
[0088]
【权利要求】
1. 一种具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，其特征在于：是来源于天竺桂、柴桂、油 桂中的至少一种树皮的提取物，所述提取物中的总多酚含量达50wt%以上。
2. 如权利要求1所述的桂皮多酚提取物，其特征在于：所述提取物中的总多酚含量达 70wt% ?90wt%。
3. -种权利要求1所述的桂皮多酚提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 用乙醇水溶液或丙酮水溶液对天竺桂、柴桂、油桂中的至少一种树皮药材进行提 取； b) 减压蒸馏除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加适量水稀释浓缩液，得粗提液； c) 用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯层，减压蒸馏除去其中的 乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位； d) 将乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀释并上样于DM130大孔树脂柱， 依次用3?5柱体积水、3?5柱体积lOvol%乙醇水溶液、3?5柱体积35vol%乙醇水溶 液和3?5柱体积70vol%乙醇水溶液洗脱，收集35vol%的乙醇流分，减压浓缩，干燥，即得 所述的提取物。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中所述的提取为冷浸提取、温 浸提取或回流提取。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中所述的提取为1?3次；每 次提取时，1克树皮药材使用5?50毫升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
6. 如权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液和丙酮水溶液 的体积百分比浓度均为20%?70%。
7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤c)中的萃取，每次用于萃取的乙 酸乙酯的体积为被萃取的粗提液体积的0. 5?1. 5倍。
8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤d)中所述的干燥为真空干燥或冷 冻干燥。
9. 一种权利要求1或2所述的桂皮多酚提取物的应用，其特征在于：以所述提取物作 为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备治疗免疫性疾病的药物制剂。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于：以所述提取物作为活性成分之一或唯一的 活性成分用于制备治疗类风湿性关节炎的药物制剂。
【文档编号】A61P19/02GK104274528SQ201310273225
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】李医明, 杨以阜, 贾琦, 陈亮, 杨扬 申请人:上海中医药大学