从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从油茶中提取山奈酚及其衍生物的方法。方法为：经浸提、D101大孔吸附树脂分离、硅胶层析分离、DAC色谱分离，中间结合色谱分析，从油茶叶中逐步分离出山奈酚的纯品，以及山奈酚?3?O?β?鼠李糖苷的纯品。本发明同时从油茶叶中成功提取出了山奈酚及其衍生物，即山奈酚、山奈酚?3?O?β?鼠李糖苷，其中后者为首次从油茶叶提取得到，并且该提取方法具有收率高、产品纯度高等优点。
【专利说明】
从油茶叶中提取山奈齡及其衍生物的方法
技术领域
[0001] 本发明设及药物提取技术领域，尤其是设及一种从油茶叶中提取山奈酪及其衍生 物的方法。
【背景技术】
[0002] 油茶叶为山茶科植物油茶的叶，其富含多种药效成分，尤其是黄酬类化合物、巧类 化合物。黄酬类化合物具有多种生物活性，例如屯、血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿 瘤活性、抗氧化自由基活性、镇痛活性、保肝活性等。巧类化合物具有桂疲止咳、抗肿瘤、抗 真菌、抑菌及降胆固醇等生物活性。
[0003] 如何从油茶叶中提取出山奈酪等生物活性成分，对深度开发油茶作物极其重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供从油茶叶中提取山奈酪及其衍生物的方法，所述的提取方 法首次从油茶叶中成功提取出了山奈酪及其衍生物，即山奈酪、山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧， 并且该提取方法具有收率高、产品纯度高等优点。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了 W下技术方案：
[0006] 从油茶叶中提取山奈酪及其衍生物的方法，包括W下步骤：
[0007] A: W乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液；
[000引 B: WDlO 1大孔吸附树脂为填料，依次用水、15-25wt %乙醇溶液、75-85wt %乙醇溶 液对所述粗提液进行恒定洗脱；
[0009] C:将所述75-85wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用9-11:1至1 :2.5-3.5梯度的二氯甲烧-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山 奈酪的流份段，命名为第一顺序组分；W及合并含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段，命 名为第二顺序组分；
[0010] D:采用DAC色谱柱，用55-65 %甲醇-7jC为流动相对所述第二顺序组分进行恒定洗 脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段；
[0011] E:对所述第一顺序组分进行硅胶层析，用45-55:1至8-12:1梯度的二氯甲烧-甲醇 进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山奈酪的流份段。
[0012] 上述提取方法由粗至精的方式从油茶叶中逐步分离出山奈酪(简称为C0-4)的纯 净物，W及山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧(简称为C0-3)的纯净物。
[0013] W干油茶叶为基准，本发明对C0-3的提取率在21.1mg/kgW上，在对C0-4的提取率 在50.2mg/kgW上，并且前后两个产品的纯度均在90% W上。
[0014] 本发明所述的流动相（即洗脱所用的液体)的比例均指体积比，流动相中的"％"指 非水物质所占的体积百分数，乙醇溶液均指乙醇的水溶液，例如，15-25%乙醇溶液指乙醇 体积百分比为15-25%的水溶液。55-65%甲醇-水指甲醇体积百分比为55-65%的水溶液。
[0015] 本发明所述的恒定洗脱是指流动相的组成比例固定。
[0016] 本发明所述的梯度洗脱是指在洗脱过程中不断改变流动相的浓度配比，但起始浓 度和终点浓度是固定的，例如步骤C中的梯度洗脱是指:二氯甲烧-甲醇按照起始浓度为9- 11:1、洗脱终点浓度为1:2.5-3.5的方式进行梯度洗脱。
[0017] 本发明所述的DAC色谱柱指轴向动态压缩工业色谱柱。
[0018] 本发明所述的提取方法适用于不同种属的油茶叶，尤其适合普通油茶(Camellia oleifera Abel),其提取率高。
[0019] 步骤A中，浸提所用的溶剂、料液比、溫度对粗提液中的杂质含量W及有效成分的 提取率都有影响。溶剂优选用40-60 %的乙醇-水溶液，更优选50 %的乙醇-水溶液。料液比 优选为1:2.5-3.5( Ig固体:2.5-3.5mL溶剂），更优选1:2.5-3。浸提溫度优选为70-80°C，并 且W回流浸提为最佳。采用W上浸提条件能降低粗提液中的杂质含量，提高山奈酪及其衍 生物的提取率。
[0020] 另外，为了降低后期分离的难度，在浸提之后可W浓缩干燥粗提液，除去乙醇。
[0021 ]步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积优选为柱体积的3.5-4.5倍，更优选为 4-4.5倍，保证待提取成分能够被充分洗脱出来。所用流动相的浓度优选水、15-20%乙醇溶 液、75-80%乙醇溶液。
[0022] 步骤C中，硅胶层析分离为分离手段，色谱分析为评价分离结果的手段，两者互相 配合，筛选出含有C0-3的洗脱液，W及含有C0-4的洗脱液。筛选通常为粗筛选，一般是经色 谱分析，先将色谱图相似的洗脱液合并，然后与目标提取物的标准品色谱图对比，从中筛选 出含有目标提取物的洗脱液，将其合并。当然，也可W不经过合并，直接与目标提取物的标 准品色谱图对比来选出有用的洗脱液，运种做法工作量较大，但是结果更精确。
[0023] 所述步骤C中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述梯度洗脱优选为：用9-10 :1至1:2.5-3梯度的二氯甲烧-甲醇进行梯度洗脱，采用W上进一步优化的条件，可W提高 分离度和柱效。
[0024] 在所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括:将所述75-85%乙醇溶液洗脱得 到的洗脱液浓缩干燥，可W避免乙醇对后续硅胶层析的干扰。
[0025] 另外，所述步骤C中的色谱分析可W是薄层色谱(TLC)、高效液相色谱等任意能用 于定性的方法，其中后者更准确。
[0026] 另外，在进行硅胶层析时，为了保证待分离物均匀分散在硅胶之中，优选将二氯甲 烧-甲醇稀释待分离物，同时拌入硅胶，之后再水浴蒸干。经过W上处理后的物质再装入娃 胶柱中进行层析。
[0027] 同样，所述步骤D中，经色谱分析可W为:高效液相色谱分析，和/或薄层分析等，优 选前者或两者结合。
[0028] 所述步骤D中，流动相的浓度优选55-60%甲醇-水时，具有更高的分离度。在该步 骤中即可获得C0-3的纯净物，只要在色谱分析后，将仅含有C0-3的流份段合并即可。此处的 "仅含"是指C0-3的含量只要达到提取物的一般纯度即可，在此基础上，可根据生产需求选 择进一步提纯。
[0029] 所述步骤E中，所述步骤C中，所用的硅胶的粒径优选为200-300目，所述梯度洗脱 优选为：用45-50:1至8-10:1梯度的二氯甲烧-甲醇进行梯度洗脱，采用W上进一步优化的 条件，可W提高分离度和柱效。在该步骤中即可获得C0-4的纯净物，只要在色谱分析后，将 仅含有CO-4的流份段合并即可。此处的"仅含"是指CO-4的含量只要达到提取物的一般纯度 即可，在此基础上，可根据生产需求选择进一步提纯，例如W甲醇为溶剂，进行重结晶。
[0030] 与现有技术相比，本发明能达到W下技术效果：
[0031] (1)首次从油茶叶中提取了出高纯度的山奈酪及其衍生物一一山奈酪、山奈酪-3- 0-e-鼠李糖巧；
[0032] (2)由粗到精的提取方式利于提取方法的规模化推广；
[0033] (3)提取收率高。
【附图说明】
[0034] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可W根据运些附图获得其他的附图。
[0035] 图1为本发明实施例1提供的80%乙醇洗脱后收集的样品的液相色谱图；
[0036] 图2为C0-3的质谱图；
[0037] 图3为C0-4的质谱图；
[003引图4为C0-3的Ih-NMR谱图；
[0039] 图 5 为C0-3 的 Uc-NMR 谱图；
[0040] 图 6 为C0-4 的 Ih-NMR谱图；
[0041 ]图 7 为C0-4 的 Uc-NMR 谱图。
【具体实施方式】
[0042] 下面将结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但 是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领 域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保 护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂 或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产品。
[0043] 本发明中所述的流动相的比例均指体积比。
[0044] 实施例1
[0045] 第一步：
[0046] 将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用50 %乙醇按料液比1: 3 在70-80°C加热回流，重复提取2次，每次提取化，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓 缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
[0047] 第二步：
[004引用工业酒精处理约IOL的Dioi型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的 提取液分两次上样，依次用水、20 %乙醇、80 %乙醇洗脱，每个梯度洗脱4倍柱体积，根据化C 和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
[00例 80%乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g，其HPlX谱图如图1所示，洗脱程序： O-IOmin 50%甲醇水溶液，10-20min 80%甲醇水溶液，20-21min 100%甲醇；检测波长 254nm，进样量10化），溶解于10:1的二氯甲烧-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶（200~300 目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约SOOg。
[0050] 流动相系统为二氯甲烧-甲醇（10:1~1:3梯度洗脱），每SOOmL收集为一次，经过 TLC检测合并为1-化2'（表示:将第一次硅胶柱的第一个流份、第二个流份W及第二次硅胶 柱的第二个流份合并），3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'，17-19+14'， 20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66- 67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共计24个组分（两次娃 胶柱的流份用序号后面的符号加 W区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接（同一次 硅胶柱的流份用-衔接），例如，第一次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1、 2……78,第二次装柱的提取液经洗脱后，收集的液体编号分别为1'、2'……84'）。
[0051] 第S步：
[0052] 27-40利用DAC制备色谱分离，60%甲醇-水恒定洗脱，经高效液相色谱分析，合并 经含有C0-3的流份，共9. Img。
[0化3] 第四步：
[0054]将3-7+3'-7'流份溶解于一定比例的二氯甲烧-甲醇中，拌入Sg薄层层析硅胶 (200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶约80g。流动相系统为二氯甲烧-甲醇(50:1至10:1 梯度洗脱），每100血收集为一个流份，经过IlX检测合并为1，2-3，4，5-7，8，9-10，11，12-14， 15,16-17,18-21，22-24,25-26,27-30，31,32-36共计 16 个流份。（编号方法同第二步）。 [0化5] 第五步：
[0056] 将第四步中的5-7样品浓缩至小体积，加甲醇溶解，静置析晶，将粗晶体滤出，W甲 醇重结晶，得到单体化合物C0-4(6.8mg)。
[0057] 第六步:表征提取物
[0化引将C0-3、C0-4进行质谱检测，如图2和3所示。
[0化9 ] 将C0-3、C0-4进行核磁共振图谱检测，C0-3的Ih-NMR、I3C-NMR分别如图4和5所示， C0-4的Ih-NMR、I3C-NMR分别如图6和7所示。
[0060] 结合上述表征结果可W确定C0-3的分子式如下式（一）。
[0061]
[0062] C0-4为山奈酪(结构式如式(二））。
[0063 ]经检测，0)-3、0)-4的纯度分别为93.2%、95.4%。
[0064]
[00化]实施例2
[0066] 第一步：
[0067] 将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用40%乙醇按料液比1: 2.5在70-80°C加热回流，重复提取2次，每次提取化，合并所得上清液，过滤获得上清液，减 压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
[006引 第二步：
[0069] 用工业酒精处理约IOL的DlOl型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的 提取液分两次上样，依次用水、15%乙醇、75%乙醇洗脱，每个梯度洗脱4.5倍柱体积，根据 TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
[0070] 80 %乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g )，溶解于10:1的二氯甲烧-甲醇中， 拌入300g薄层层析硅胶(200~300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约 SOOgo
[0071] 流动相系统为二氯甲烧-甲醇(9:1~1:2.5梯度洗脱），每SOOmL收集为一次，经过 TLC检测合并含有山奈酪的流份段，合并含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段。
[0072] 第S步：
[0073] 对第二步中含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段，利用DAC制备色谱分离，55 % 甲醇-水恒定洗脱，经高效液相色谱分析，合并经含有C0-3的流份，共9.4mg。
[0074] 第四步：
[0075] 将第二步中含有山奈酪的流份溶解于一定比例的二氯甲烧-甲醇中，拌入Sg薄层 层析硅胶（200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶约80g。流动相系统为二氯甲烧-甲醇 (45:1至8:1梯度洗脱），每IOOmL收集为一个流份，经过化C检测合并含有山奈酪的流份。
[0076] 第五步：
[0077] 将第四步中的含有山奈酪的流份浓缩至小体积，加甲醇溶解，静置析晶，将粗晶体 滤出，W甲醇重结晶，得到单体化合物C0-4(6.9mg)。
[0078] 第六步:表征提取物
[0079] 同样，采用质谱和1H-NMR、i3C-NMR进行表征，结果与实施例1相同，C0-3为山奈酪- 3-0-0-鼠李糖巧，C0-4为山奈酪。
[0080] 实施例3 [0081 ]第一步：
[0082] 将自然阴干的油茶干燥叶粉碎过60目筛，取20kg分两批用60%乙醇按料液比1: 3.5在70-80°C加热回流，重复提取2次，每次提取化，合并所得上清液，过滤获得上清液，减 压浓缩至无醇味，得到原体积约一半的粗提液样品，备用。
[0083] 第二步：
[0084] 用工业酒精处理约IOL的DlOl型大孔吸附树脂，用水洗到无醇味，将第一步得到的 提取液分两次上样，依次用水、25 %乙醇、85 %乙醇洗脱，每个梯度洗脱3.5倍柱体积，根据 TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩。
[0085] 80%乙醇洗脱后收集的样品浓缩干燥(约150g)，溶解于10:1的二氯甲烧-甲醇中， 拌入300g薄层层析硅胶(200~300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空白层装填硅胶约 SOOgo
[0086] 流动相系统为二氯甲烧-甲醇（11:1~1:3.5梯度洗脱），每SOOmL收集为一次，经过 TLC检测合并含有山奈酪的流份段，合并含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段。
[0087] 第S步：
[00则对第二步中含有山奈酪-3-0-0-鼠李糖巧的流份段，利用DAC制备色谱分离，65 % 甲醇-水恒定洗脱，经高效液相色谱分析，合并经含有C0-3的流份，共8.7mg。
[0089] 第四步：
[0090] 将第二步中含有山奈酪的流份溶解于一定比例的二氯甲烧-甲醇中，拌入Sg薄层 层析硅胶（200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶约80g。流动相系统为二氯甲烧-甲醇 (55:1至12:1梯度洗脱），每1 OOmL收集为一个流份，经过化C检测合并含有山奈酪的流份。
[0091] 第五步：
[0092] 将第四步中的含有山奈酪的流份浓缩至小体积，加甲醇溶解，静置析晶，将粗晶体 滤出，W甲醇重结晶，得到单体化合物C0-4(6.6mg)。
[0093] 第六步:表征提取物
[0094] 同样，采用质谱和1h-NMR、i3C-NMR进行表征，结果与实施例1相同，C0-3为山奈酪- 3-0-0-鼠李糖巧，C0-4为山奈酪。
[0095] 最后应说明的是：W上各实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依 然可W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换；而运些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。
【主权项】
1. 从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤： A:以乙醇溶液为溶剂，对油茶叶进行浸提，得到粗提液； B:以DlOl大孔吸附树脂为填料，依次用水、15-25wt%乙醇溶液、75-85wt%乙醇溶液对 所述粗提液进行恒定洗脱； C:将所述75-85wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，用9-11:1至1: 2.5-3.5梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山奈 酚的流份段，命名为第一顺序组分；以及合并含有山奈酚-3-Ο-β-鼠李糖苷的流份段，命名 为第二顺序组分； D:采用DAC色谱柱，用55-65 %甲醇-水为流动相对所述第二顺序组分进行恒定洗脱，分 段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山奈酚-3-Ο-β-鼠李糖苷的流份段； E:对所述第一顺序组分进行硅胶层析，用45-55:1至8-12:1梯度的二氯甲烷-甲醇进行 梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并含有山奈酚的流份段。2. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤A中，浸提的方法为:料液比为1:2.5-3.5，在70-80°C下回流提取，乙醇溶液优选为40-60%的乙醇-水溶液。3. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤B中，每个梯度洗脱所用流动相的体积为柱体积的3.5-4.5倍，优选3.5-4倍。4. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤C中，所用的硅胶的粒径为200-300目，所述梯度洗脱优选为：用9-10:1至1:2.5-3梯度 的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。5. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤C中，所用的色谱分析优选为TLC。6. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤D中，经色谱分析合并含有山奈酚-3-Ο-β-鼠李糖苷的流份段进一步为： 经液相色谱分析，合并仅含山奈酚-3-Ο-β-鼠李糖苷的流份段。7. 根据权利要求1或6所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于， 所述步骤D中，所述55-65 %甲醇-水为55-60 %甲醇-水。8. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤E中，所用的硅胶的粒径为200-300目。9. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，所述 步骤E中，在合并含有山奈酚的流份段之后还包括：以甲醇为溶剂进行重结晶；所述梯度洗 脱优选为:用45-50:1至8-10:1梯度的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。10. 根据权利要求1所述的从油茶叶中提取山奈酚及其衍生物的方法，其特征在于，在 所述步骤C中，所述硅胶层析分离之前还包括:将所述75-85wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱 液浓缩干燥。
【文档编号】C07H17/07GK105924419SQ201610278287
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】钟海雁, 马力, 曹清明, 王蔚婕
【申请人】中南林业科技大学