一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗的制作方法与工艺

本发明涉及一种结核亚单位疫苗，具体涉及一种以Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白为抗原成份，以铝和PolyIC为复合佐剂的新型亚单位疫苗。

背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种古老而漫长的感染性疾病。近几年，随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株的增多和艾滋病的不断流行，使结核病死灰复燃。结核病已经成为危及全球的公共卫生问题。世界卫生组织于2012年公布了全球结核病状况报告，报告中显示2011年全球有870万新发结核病病例，140多万结核病死亡病例。从报告中可以看出结核病的发病、患病和死亡总数依然很高，造成的经济负担很重。我国是世界第二大结核病高负担国家，结核病患病人数多，并且每年因结核病导致的死亡人数也列于传染病死亡人数之首。世界卫生组织报道全球有1/3的人群感染了结核杆菌，即中国拥有4亿多的庞大的结核杆菌感染者。发病率高、耐药率高、因病死亡人数多、潜伏感染人群数量庞大，以上情况是中国结核病的疫情现状，由此可见中国的结核病疫情仍十分严重。针对此种疫情状况，有效地控制和预防结核病的发生有可能改变结核病流行现状。防控结核病最根本的途径可能还要依赖有效的结核病疫苗。到目前为止，卡介苗仍是预防结核唯一可用的疫苗。但在世界各国进行的数十次临床试验结果显示，卡介苗对成人肺结核的免疫保护力是0%～80%，对抑制潜伏期结核的复发毫无作用，因此研制新型结核疫苗十分必要。新型结核病疫苗不仅要对新生儿提供良好的预防作用，对于成年人和结核杆菌潜伏感染者也要起到预防作用。重组结核杆菌亚单位疫苗，特别是大肠杆菌中表达的亚单位疫苗，具有保护性抗原表位多、表达效率高、发酵工艺成熟、生成成本低、易于大规模生产及广泛使用和再次使用的特点。并且亚单位疫苗具有较高的安全性、易于被人们接受。但亚单位疫苗的主要缺点是免疫原性弱，往往需要有效的佐剂辅助才能引起理想的免疫应答。目前铝佐剂是应用最广泛的一类疫苗佐剂，但对于亚单位疫苗诱发理想的免疫应答反应效果欠佳。

技术实现要素：
基于上述佐剂诱发免疫应答效果欠佳的问题以及对新型疫苗的迫切需求，本发明将具有不同特点的结核杆菌抗原相组合，并添加筛选出的适当的佐剂，制成了含联合佐剂的新型结合亚单位疫苗。为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：本发明选用Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白作为亚单位疫苗的保护性抗原以及选用铝和PolyIC作为复合佐剂。本发明中的Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白均属于结核杆菌保护性抗原，作为疫苗成分免疫人体后，刺激机体产生对这两种成分的特异性细胞免疫，当有结核杆菌进入或潜伏于人体时，这种较强的细胞免疫可以抑制结核杆菌的增值或促进其清除，对结核病的预防起重要作用。本发明将Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白联合使用均能发挥各自的抗原作用，它们组成的疫苗，适用于结合杆菌潜伏感染者的治疗。在亚单位疫苗中，佐剂是提高免疫活性的重要成分，本发明筛选出的新型联合佐剂为铝和PolyIC的联合佐剂。优选，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为1～50:1～50:100～1000:1～100。更优选，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为10:10:200:50。在应用时，一个剂量疫苗中含Ag85b蛋白1～50μg、ESAT6-CFP10融合蛋白1～50μg、铝佐剂0.1～1mg和PolyIC佐剂1～100μg，优选一个剂量疫苗中含Ag85b蛋白10μg、ESAT6-CFP10融合蛋白10μg、铝佐剂200μg和PolyIC佐剂50μg。铝佐剂可以是但不限于氢氧化铝、磷酸铝。PolyIC选自聚肌苷酸：聚胞苷酸，聚脱氧肌苷酸：聚胞苷酸，聚肌苷酸：聚脱氧胞苷酸或聚脱氧肌苷酸：聚脱氧胞苷酸。本发明中的PolyIC是一种高效的干扰素诱生剂，在体内可以产生类似病毒感染的免疫反应，可诱导CD4+和CD8+T细胞，增强细胞免疫和体液免疫应答。研究发现，PolyIC在猪体内能有效地诱导IFN-γ的产生，同时可以诱导单核细胞MHC-II和CD80/CD86的基因表达以及趋化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12和p35的产生，证明其可以有效增强Th1型反应。铝佐剂是目前应用最广泛的一类疫苗佐剂，其安全性已被验证和认可，并且具有缓释作用，对疫苗的持续释放实现缓释给药有帮助，因此本发明的铝佐剂可以发挥上述优势。影响佐剂效果的因素很多，如与其配伍的蛋白种类与蛋白的配比等。本发明将铝和PolyIC联合Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白使用降低了联合佐剂两者的使用量，其中铝佐剂的使用量为0.2mg，PolyIC的量仅为50μg，上述剂量均远低于通常用量范围，却能达到较显著的增强免疫的效果，动物实验进一步证明，本发明疫苗可减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内潜伏感染的结核分枝杆菌。附图说明图1，Ag85b蛋白的SDS-PAGE电泳图；图2，ESAT6-CFP10融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；图3-4，本发明的结核亚单位疫苗体内Ag85b和ESAT6-CFP10抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞频率结果；图5-6，本发明的结核亚单位疫苗体内产生抗Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白抗体的结果；图7显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠脏器综合病变指数；图8显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠脾活菌数（log10）；图9显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠肺活菌数（log10）。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。实施例1Ag85b和ESAT6-CFP10两种抗原的制备1.1、试验方法1）Ag85b基因的扩增以及蛋白的纯化从Genbank查询结核杆菌H37Rv抗原ESAT6和CFP10的核酸和氨基酸序列，根据目的序列设计引物。表1首先以H37Rv全基因组为模板，引物见表1，对Ag85b在50μLPCR体系中进行扩增（ddH2O30.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、DNA模板2μL）。扩增条件为：94℃10min；94℃45s，62.2℃45s，72℃1min，循环33次；72℃5min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收，获得目的片段，经NdeI和EcoRI双酶切后在T4DNA连接酶催化下与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜，转化DH5α，37℃培养过夜。挑选菌落于10mLLB培养基扩增，提取质粒后用上述内切酶消化，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证，并确认其基因序列正确。从测序正确的菌落中提取质粒转化BL21感受态细胞，获得重组菌，于LB液体培养基中培养重组菌，待菌液在600nm光密度（opticaldensity，OD）下的值达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L，诱导表达4h。离心经诱导表达的菌液，菌体沉淀用T-E缓冲液（Tris50mmol/L,EDTA2mmol/L）洗涤后重悬，冰浴超声裂解后离心，弃上清液。沉淀用4mol/L的T-E缓冲液重悬后洗1-3遍，离心弃上清。沉淀用含6mol/L尿素的T-E缓冲液重悬，离心去沉淀。上清完全透析至6mol/L尿素的T-E缓冲液中。用source30Q阴离子交换柱进行纯化。用A液（含6mol/L尿素的T-E缓冲液）平衡柱子后上样（流速2mL/min），待流穿完全流出基线稳定后，用B液（含6mol/L尿素和1mol/L氯化钠的T-E缓冲液）线性洗脱（流速3mL/min），收集流穿后，梯度复性至T-E缓冲液中（6-4-2-0mol/L）。2）ESAT6-CFP10基因的扩增以及蛋白的纯化从Genbank查询结核杆菌H37Rv抗原ESAT6和CFP10的核酸和氨基酸序列，根据目的序列应用基因拼接法设计引物。表2首先以H37Rv全基因组为模板，引物见表2，对ESAT6和CFP10分别在50μLPCR体系中进行扩增，扩增体系为50μL（ddH2O30.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、DNA模板2μL）；然后利用OverlapPCR反应扩增ESAT6-CFP10融合基因，扩增体系为50μL（ddH2O28.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、CFP10PCR纯产物2μL，ESAT6PCR纯产物2μL）。CFP10扩增条件为：96℃5min；96℃45s，60℃45s，72℃1min，循环30次；72℃7min，4℃保存。ESAT6扩增条件为：96℃5min；96℃45s，62℃45s，72℃1min，循环30次；72℃7min，4℃保存。ESAT6-CFP10融合基因的扩增条件为：96℃5min；96℃1min，64℃1min，72℃1min，循环30次；72℃7min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收，获得目的片段，经NdeI和EcoRI双酶切后在T4DNA连接酶催化下与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜，转化DH5α，37℃培养过夜。挑选菌落于10mLLB培养基上扩增，提取质粒后用上述内切酶消化，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证，并确认其基因序列正确。从测序正确的菌落中提取质粒转化BL21感受态细胞，获得重组菌，于LB液体培养基中培养重组菌，待菌液在600nm光密度（opticaldensity，OD）下值达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L，诱导表达4h。离心经诱导表达的菌液，菌体沉淀用PB缓冲液洗涤后重悬，冰浴超声裂解后离心，取上清液待做纯化。用阴离子交换柱（QHP，QSepharoseHighPerformance）进行纯化。用A液（PB缓冲液）平衡柱子后上样（流速2mL/min），待流穿完全流出基线稳定后，用5%B液（含1mol/L氯化钠的PB缓冲液）梯度洗脱（流速2mL/min），收集洗脱液。1.2试验结果纯化后的蛋白用12%的SDS-PAGE电泳确定分子量，并进行N末端测定。结果显示，Ag85b和ESAT6-CFP10分子量分别约为34.4KD和23KD，N末端氨基酸序列分别为MTDVSRKIRAWGRRL和MAEMKTDAATLAQEAG。实施例2：本发明中的含联合佐剂结核亚单位疫苗的免疫学研究1、材料研究对象：30只SPF级雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）2、方法与结果2.1试验设计30只雌性BALB/c小鼠，随机分成5个组，每组6只小鼠，小鼠日龄与体重相近。试验分组见表2：（EC为ESAT6-CFP10）表3组别免疫剂量（/只）铝+PolyICAl(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)蛋白Ag85b(10μg)+EC(10μg)蛋白+铝Ag85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)蛋白+PolyICAg85b(10μg)+EC(10μg)+polyIC(50μg)蛋白+铝+PolyICAg85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)分别对小鼠后腿肌内免疫接种上述试剂，免疫3针，间隔10天。在末次免疫后第2周分离脾淋巴细胞和血清。用ELISPOT方法检测2.5×105个脾淋巴细胞中Ag85b和EC抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞频率，结果用斑点生成细胞数（Spotformingcells,SFC）表示，同时对分离的血清用ELISA方法检测Ag85b和EC的抗体效价（Log10对数值表示，*：P<0.05,***：P<0.001）。2.2试验结果试验结果见图3-6。试验结果图3-4（一元方差分析的Holm-Sidak多重比较，*：P<0.05,***：P<0.001，数据以平均值±标准差形式表示）表明，蛋白亚单位与铝和PolyIC配伍试验组相比于单纯的蛋白组、铝和PolyIC联合组、蛋白+铝、蛋白+PolyIC组可显著提高脾淋巴细胞中Ag85b和EC抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞频率（P<0.05）。IFN-γ可以激活Th细胞，有效增强Th1型细胞免疫免疫应答反应。试验结果图5-6（一元方差分析的Holm-Sidak多重比较，*：P<0.05，数据以平均值±标准差形式表示）表明，蛋白亚单位与铝和PolyIC配伍试验组相比于单纯的蛋白组、铝和PolyIC联合组、蛋白+铝、蛋白+PolyIC组可显著提高血清中Ag85b和EC抗体效价，以EC蛋白效果尤为显著（P<0.05）。上述结果表明，本发明的使用铝和PolyIC联合佐剂的蛋白亚单位疫苗可以有效增强Th1型细胞免疫应答反应，这对预防结核病有重要作用。实施例3动物保护力试验1、实验方法Mtb感染豚鼠的免疫治疗SPF级Hartley豚鼠16只（300-350g/只），雌雄各半，分成两组（实验组、对照组），每组8只。将实验组和对照组豚鼠于皮下攻毒5.0×103CFUMtb后，实验组注射参考疫苗进行治疗，共6针，每针间隔2周，每针剂量为[Ag85b(10μg)+EC(10μg)+Al(OH)3(0.2mg)+polyIC(50μg)]/0.5mL/只。对照组豚鼠注射等量的生理盐水作为对照。末次免疫后1周，解剖豚鼠。分析肝、脾和肺脏器综合病变指数和脾肺荷菌量。脏器病变指数评分Mtb感染的豚鼠解剖后，先对肝、脾、肺脏器按轻、中、重进行分级，然后按《现代结核病学》中《结核菌感染后病变指数评分标准》进行评分。脾、肺活菌分离剪取1/2的脾脏或肺置于研磨器中，加入3mL生理盐水研磨均匀，进行10倍系列稀释，根据脏器病变程度接种不同的稀释度，每个稀释度接种改良罗氏培养基2支，0.1mL/支，37℃培养，4周后进行菌落计数。统计分析双侧t检验法进行统计分析。2、结果及分析结果如图7～9所示，可得出：与对照组相比经疫苗治疗6针后，实验组各项指标均显著降低。这表明，本疫苗可减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内结核分枝杆菌。序列表<110>中国食品药品检定研究院<120>一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗<130>PN1305328-02<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cacgcatatgacagacgtgagcc23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgaattctcagccggcgcct21<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3gatagtctcatatggcagagatgaagaccg30<210>4<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>4gcttccacctcctccgcttccaccacctccgcttccaccgccaccgaagcccatttgcg59<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>5gctggcggtggaagcggaggtggtggaagcggaggaggtggaagcatgacagagcagcag60<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>6catgaattcctatgcgaacatcccagtgacg31<210>7<211>15<212>PRT<213>氨基酸序列<400>7MetThrAspValSerArgLysIleArgAlaTrpGlyArgArgLeu151015<210>8<211>16<212>PRT<213>氨基酸序列<400>8MetAlaGluMetLysThrAspAlaAlaThrLeuAlaGlnGluAlaGly151015