冬凌草甲素联合依托泊苷在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

冬凌草甲素联合依托泊苷在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了以冬凌草甲素和依托泊苷（etoposide，又称VP-16、足叶乙甙）为主要成分的组合药物在治疗肿瘤和制备抗肿瘤药物中的应用。本发明将两种作用机制不同的抗肿瘤药物进行组合，不仅克服了凋亡不敏感细胞对依托泊苷的耐受性，而且大大提高了对肿瘤细胞的抑制和杀伤效果。冬凌草甲素和依托泊苷联合使用对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用要大于两种药物单独使用效果的简单加和。因此在组合用药中，可以大大降低冬凌草甲素和依托泊苷的使用剂量，但仍保持较好的抗肿瘤效果。这种高效低毒的抗肿瘤药物组合可用于治疗多种恶性肿瘤，尤其是白血病，包括对依托泊苷耐受的肿瘤。
【专利说明】冬凌草甲素联合依托泊苷在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗和医药领域，具体涉及通过联合用药的方法治疗恶性肿瘤及制备抗肿瘤药物，主要是以冬凌草甲素和依托泊苷为主要活性成分进行组合用药，不仅能够增强抗肿瘤疗效，还能逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐受性。
[0002]
【背景技术】
[0003]世界卫生组织的GL0B0CAN癌症报告显示，2008年全球新增癌症病例约1266万，其中因癌症死亡的人数约为756万，约占所有死亡人数的13%。该机构也预测，至2030年，全球每年癌症新发病例将增加69%，达2100万人，而癌症死亡病例预计上升72%，死亡人数将达1300万人。癌症仍是且仍将是全球范围内致人死亡的主要原因之一。因此，寻找新的行之有效的癌症治疗药物或方法，或者改进已有的癌症治疗策略，将对全球人类的健康产生深远的正面影响。
[0004]化疗是肿瘤临床治疗的主要手段之一。化疗药物一般通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式起到抗肿瘤的作用。然而，肿瘤细胞凋亡相关信号通路的紊乱常常导致其对化疗药物诱导的凋亡产生抗性，这也是肿瘤产生耐药性的主要原因之一。肿瘤细胞的耐药性使得化疗药物的疗效被大大削弱，其结果是肿瘤病人对药物治疗不再敏感。因此，开发逆转肿瘤耐药性的药物，增强化疗药物的疗效，是提高肿瘤治愈率的关键环节。
[0005]依托泊苷又称足叶乙甙或VP-16，是一种细胞周期特异性的抗肿瘤药物，主要作用于细胞周期晚S期或G2期，其靶点为DNA拓扑异构酶II，可形成由药物-酶-DNA三者组成的稳定可逆性复合物从而阻碍受损DNA的修复。依托泊苷被广泛应用于癌症的化疗方案，包括针对非小细胞肺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、睾丸肿瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、绒毛膜上皮癌、卵巢癌等癌症的治疗。但是，依托泊苷化疗存在着比较严重的骨髓抑制、胃肠道反应和肝肾损伤等，故需与其他药物联合使用。另外，依托泊苷也存在耐药性问题。如何逆转依托泊苷的耐药性，增强其对肿瘤细胞的杀伤作用，是依托泊苷临床用药上的一个巨大挑战。
[0006]冬凌草甲素是提取自我国传统中草药冬凌草的一种抗肿瘤活性成分。研究表明冬凌草甲素具有广谱的抗肿瘤活性，可以通过靶向降解癌蛋白C-Myc从而抑制肿瘤细胞生长及诱发肿瘤细胞凋亡。另外，冬凌草甲素的活性与细胞中C-Myc蛋白的表达水平具有很好的相关性，高表达C-Myc的细胞对冬凌草甲素较为敏感，而c-Myc低表达的细胞对冬凌草甲素的敏感性较低。由于c-Myc在约70%的肿瘤中高表达而在正常细胞中呈现低表达，因此这也解释了为什么冬凌草甲素具有广谱的抗肿瘤活性以及具有相对较高的安全性。冬凌草甲素也可与化疗药物联用起到更强的抗肿瘤作用，例如其与三氧化二砷联用时对肝癌细胞的作用更为明显。然而，至今未有冬凌草甲素与依托泊苷联合使用的报道。

【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供新的药物组合用于肿瘤治疗。
[0008]更具体地说，是以冬凌草甲素和依托泊苷为主要成分的组合药物在制备抗肿瘤药物中的应用；及冬凌草甲素在逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐受性中的应用。
[0009]发明提供了以下技术方案:
冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备miR-17-5p和miR-20a表达抑制剂上的应用。
[0010]冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备促凋亡蛋白Bim-S表达促进剂上的应用。
[0011]冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备预防和/或治疗肿瘤药物上的应用。
[0012]冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备逆转肿瘤细胞对于依托泊苷耐药性药物上的应用。
[0013]冬凌草甲素和依托泊苷联用在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的冬凌草甲素和依托泊苷的摩尔质量比为1:广1:8。
[0014]优选地，所述的肿瘤为miR-17和/或miR_20a高表达的肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌等。
[0015] 申请人:经过大量研究发现，冬凌草甲素可通过抑制miR-17-5p和miR_20a微RNA的表达从而上调Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白Bim-S的表达，继而引起肿瘤细胞的生长抑制和凋亡发生。依托泊苷与冬凌草甲素具有不同的作用机制。在对依托泊苷具有抗性的肿瘤细胞中联合使用冬凌草甲素和依托泊苷进行处理，可以有效逆转肿瘤细胞对于依托泊苷的抗性，使细胞的生长受到明 显抑制并发生凋亡。另外，冬凌草甲素和依托泊苷联合使用对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用显著大于两种药物单独使用效果的简单加和。
[0016]发明同时提供了一种治疗和/或预防肿瘤的药物组合物，其特征在于以冬凌草甲素和依托泊苷为主要成分。该药物组合物还可包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂。
[0017]该药物组合对依托泊苷耐受性的肿瘤也有较强的抑制和杀伤作用，可逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。冬凌草甲素和依托泊苷联合使用对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用要大于两种药物单独使用效果的简单加和。
[0018]发明人发现冬凌草甲素可用于逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐受性。通过使用冬凌草甲素降低miR-17-5p和/或miR-20a的表达，可以提高肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性。通过使用冬凌草甲素上调Bim-S促凋亡蛋白的表达，可以提高肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了冬凌草甲素与依托泊苷联合用于制备抗肿瘤药物的方法，这样的组合用药可以在取得较好的抗肿瘤效果的同时大大降低冬凌草甲素和依托泊苷的使用剂量，从而增加药物的安全性。这种高效低毒的抗肿瘤药物组合可用于治疗多种恶性肿瘤，优选的是白血病,包括对依托泊苷耐受的肿瘤。
[0020]另外，本发明提供了使用冬凌草甲素逆转依托泊苷耐药性的方法，冬凌草甲素提取自中国传统草药冬凌草，其制备工艺成熟，且在小鼠模型中未见明显毒性，临床可应用性强，这对依托泊苷耐受肿瘤的临床治疗具有潜在的巨大应用价值。【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1.实施例1冬凌草甲素与依托泊苷的抗肿瘤活性差异，其中A为冬凌草甲素处理下K562细胞的存活率；B为依托泊苷处理下K562细胞的存活率；C为冬凌草甲素处理下K562细胞的凋亡率；D为依托泊苷处理下K562细胞的凋亡率。
[0022]图2.实施例2中冬凌草甲素与依托泊苷对miR-17-5p和miR-20a微RNA和Bim-S促凋亡蛋白表达的影响，其中A为定量PCR结果，显示冬凌草甲素与依托泊苷对K562细胞中miR-17-5p和miR-20a微RNA成熟体表达的影响；B为免疫印记结果，显示冬凌草甲素与依托泊苷对K562细胞中Bim-S蛋白表达水平的影响。
[0023]图3.实施例3中冬凌草甲素与依托泊苷联合的体外协同增效作用，其中A为冬凌草甲素与依托泊苷联合对K562细胞存活率的抑制作用；B为冬凌草甲素与依托泊苷联合对K562细胞凋亡率的促进作用。
[0024]图4.实施例4中冬凌草甲素与依托泊苷联合在小鼠移植瘤模型中表现出协同增效作用。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例进一步解释本发明。实施例中用到的主要材料如下:
冬凌草甲素:购自河南济世药业有限公司，纯度经高效液相色谱(HPLC)测定大于95%。使用二甲基亚枫(DMSO)配置成40 mmol/L的储液，冻于-20度，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。
[0026]依托泊苷:购自Sigma公 司，使用二甲基亚枫(DMSO)配置成100 mmol/L的储液，冻于-20度，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。
[0027]细胞系:实施例中所用K562细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0028]抗体:Bim抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司。
[0029]miRNA定量PCR试剂盒:购自丹麦Exiqon公司。
[0030]实施例1冬凌草甲素与依托泊苷的抗肿瘤活性差异
将K562细胞按3 X 105/mL的密度接种于96孔板，培养24小时后加入不同5~20 μ mol/L冬凌草甲素或0.100 μ mo I/L依托泊苷处 理细胞(均以DMSO作为对照)。继续培养24小时后，采用MTT检测细胞活性。如图1A所示，冬凌草甲素可以有效抑制K562细胞的存活率，并且这种抑制作用呈现药物浓度依赖性。20 ymol/L冬凌草甲素可以使K562细胞的存活率下降60%以上。相比之下，依托泊苷则不能有效抑制K562细胞的存活率(图1B)。100ymol/L依托泊苷仅能使K562细胞的存活率下降约10% (图1B)。
[0031]将K562细胞按3X 105/mL的密度接种于48孔板，培养24小时后加入不同10~40μ mo I/L冬凌草甲素或10-100 μ mol/L依托泊苷处理细胞(均以DMSO作为对照)。继续培养24小时后收集细胞通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡。冬凌草甲素可显著诱导K562细胞发生凋亡。扣除DMSO的影响，冬凌草甲素浓度为20 μ mol/L时凋亡诱导率约60%，浓度为20 μ mol/L时凋亡诱导率约90% (图1C)。相反，在各个测试浓度下，依托泊苷均不能有效诱导K562细胞发生凋亡(图1D)。这些结果表明K562细胞对依托泊苷具有耐药性，而对冬凌草甲素则具有很高的敏感性。[0032]实施例2冬凌草甲素与依托泊苷对miR-17-5p、miR-20a微RNA和Bim-S促凋亡蛋白表达的影响
将K562细胞按3X 105/mL的密度接种于24孔板，培养24小时后加入20 μ mol/L冬凌草甲素或10 μ mol/L依托泊苷处理细胞(以DMSO作为对照)。24小时后收集细胞使用Trizol Reagent进行细胞总RNA的提取。采用紫外分光光度计测定RNA浓度。然后将提取的总 RNA用 miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR试剂盒进行逆转录(42 ° C I hr,95。C 5 min)及实时定量PCR反应，以U6 snRNA的表达水平作为内对照分析miR-17_5p和miR-20a成熟体微RNA在冬凌草甲素或依托泊苷处理下的表达变化。结果表明，冬凌草甲素可显著下调K562细胞中的miR-17-5p和miR_20a微RNA成熟体的表达水平(图2A)，而依托泊苷则不能下调miR-17-5p和miR-20a微RNA成熟体的表达(图2A)。
[0033]将K562细胞按3 X 105/mL的密度接种于24孔板，培养24小时后加入20 μ mol/L冬凌草甲素或10 μ mol/L依托泊苷处理细胞(以DMSO作为对照)。24小时后收集细胞，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞总蛋白，并用BCA Protein Assay Kit (美国Thermo Fisher公司)进行蛋白定量。取等量总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳和免疫印迹检测，以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)看家基因的蛋白产物的表达水平作为内对照分析促K562细胞中促凋亡蛋白Bim-S在冬凌草甲素和依托泊苷处理下的表达变化。如图2B所示，与DMSO对照组相比，Bim-S促凋亡蛋白在冬凌草甲素诱导下显著增多，而在依托泊苷处理下则无明显增加。
[0034]实施例3冬凌草甲素与依托泊苷的体外协同增效作用
将K562细胞按3 X 105/mL的密度接种于96孔板，培养24小时后加入10 μ mol/L冬凌草甲素或等量DMSO以及10~80 μ mol/L VP-16或等量DMSO处理细胞。继续培养24小时后，采用MTT检测细胞活性。如图3A所示，冬凌草甲素可以有效逆转K562细胞对依托泊苷的耐药性，并且与依托泊苷一起产生协同增效的作用。扣除DMSO对照的影响，10 μ mol/L冬凌草甲素可使K562细胞的存 活率被抑制约18%，40 μ mol/L依托泊苷可使K562细胞的存活率被抑制约8%，而10 μ mol/L冬凌草甲素与40 μ mol/L依托泊苷联合使用可大幅度抑制K562细胞的存活率，抑制率接近50%。
[0035]将K562细胞按3 X 105/mL的密度接种于48孔板，培养24小时后单独加入10μ mol/L冬凌草甲素或40 μ mol/L依托泊苷处理细胞，或者加入10 μ mol/L冬凌草甲素和40 μ mol/L依托泊苷联合处理细胞(均以DMSO作为对照)。继续培养24小时后收集细胞通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡。如图3B所示，扣除DMSO的影响，10 μ mol/L冬凌草甲素单独使用可以诱导约12%的细胞发生凋亡，40 μ mol/L依托泊苷单独使用可以诱导约7%的细胞发生凋亡。而当10 μ mol/L冬凌草甲素与40 μ mol/L依托泊苷联合使用时，细胞的凋亡率上升至约30%，明显高于两个药物单独使用时凋亡率的加和。这些结果不仅说明冬凌草甲素可以逆转K562细胞对依托泊苷的耐药性，也说明冬凌草甲素与依托泊苷呈现协同增效的抗肿瘤作用。
[0036]实施例4冬凌草甲素与依托泊苷的体内协同增效作用
将K562细胞经皮下注射入BALB/C nude小鼠(7周龄，购自广东省医学实验动物中心)构建K562移植瘤小鼠模型，在平均瘤大小达到10(Tl50 mm3时，将小鼠分成四组(DMS0对照组、依托泊苷组、冬凌草甲素组、依托泊苷与冬凌草甲素联用组)，每组3只。每三天通过腹腔注射给药一次，对照组注射安慰剂(2% DMSO, 98%生理盐水)，依托泊苷组注射10mg/kg的依托泊苷，冬凌草甲素组注射10mg/kg的冬凌草甲素，联用组注射10mg/kg的依托泊苷以及10mg/kg的冬凌草甲素。每天用游标卡尺测量瘤的长径和短径，按公式:体积=长径X短径2X0.5计算瘤体积。结果表明冬凌草甲素与依托泊苷联用可显著逆转移植瘤对依托泊苷的耐药性， 两种药物呈现明显的协同作用，大大减慢移植瘤的生长速度(图4)。
【权利要求】
1.冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备原癌基因miR-17-5p和miR-20a表达抑制剂上的应用。
2.冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备促凋亡蛋白Bim-S表达促进剂上的应用。
3.冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备预防和/或治疗肿瘤药物上的应用。
4.冬凌草甲素或其衍生物或盐类在制备逆转肿瘤细胞对于依托泊苷耐药性药物上的应用。
5.冬凌草甲素和依托泊苷联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的冬凌草甲素和依托泊苷的摩尔质量比为 1:1~1:8。
7.如权利要求1-6任一权利要求所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为miR-17和/或miR-20a高表达的肿瘤。
8.如权利要求1-6任一权利要求所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
9.一种治疗和/或预防肿瘤的药物组合物，其特征在于以冬凌草甲素和依托泊苷为主要成分。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于还包括可接受的药用载体制成各种药学上可接受的制剂。
【文档编号】A61P35/02GK103463117SQ201310273969
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】翁桁游, 黄慧琳, 周惠, 屈良鹄 申请人:中山大学