噻加宾在制备治疗多巴胺能神经元损伤药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及生物医学中神经病学、老年医学及神经药理学领域，具体涉及抗癫痫药噻加宾（Tiagabine）的新的药用用途，本发明基于帕金森病的病理特征和GABA在中枢神经系统和免疫系统的抑制性作用，在神经毒素诱导的帕金森病小鼠模型中进行试验，结果显示，噻加宾（Tiagabine，γ-氨基丁酸转运体拮抗剂）通过增强γ-氨基丁酸（GABA）能系统活性，抑制神经炎症，从而保护多巴胺能神经元，对帕金森病具有治疗作用。可制备治疗多巴胺能神经元损伤药物以及治疗帕金森病的药物。
【专利说明】噻加宾在制备治疗多巴胺能神经元损伤药物中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学中神经病学、老年医学及神经药理学领域，具体涉及抗癫痫 药噻加宾（Tiagabine)的新的药用用途,更具体地,涉及噻加宾在制备治疗多巴胺能神经元 损伤药物中的用途以及在帕金森病中的保护效应。
【背景技术】
[0002] 研究显示了帕金森病（PD)是一种慢性的中枢神经系统退行性疾病，其发病率随年 龄的增加而增大，据报道，在我国65岁以上的人群中ro的发病率约为1. 5%，随着人口老龄 化进程的发展，帕金森病病人的人数呈逐年增多趋势。目前帕金森病的确切致病原因尚不 清楚，业界普遍的观点认为其病因有环境因素，也有遗传因素，或是由两者共同引发（Vila Mand Przedborski S. Nature Medicine 2004; 10Suppl:S58_62)。研究显不帕金森病表现 为中脑黑质部位多巴胺能神经元的进行性丢失，神经兴奋性毒、神经炎症等可以导致多巴 胺能神经元的凋亡，是ro重要的病理机制。
[0003] 临床针对ro的治疗主要包括两大治疗策略：1)以左旋多巴（L-DOPA)为主的药物 治疗；2)基于深部脑刺激（DBS)的物理治疗。实践显示，这些治疗策略均存在局限性，其中， 左旋多巴使用6年左右之后，疗效会下降，并且多数ro患者常伴发出现"开关"现象、运动 障碍等严重并发症；而深部脑刺激（DBS)治疗存在一定的手术风险，且费用昂贵。
[0004] 噻加宾（Tiagabine)是一种哌陡衍生物，其通过拮抗Y -氨基丁酸转运体的功能 从而增强Y -氨基丁酸（GABA)能神经传导；Y _氨基丁酸（GABA)是中枢神经系统最主要 的抑制性递质。癫痫是一类电活动异常为主要特征的神经系统疾病，在临床上噻加宾被 用于治疗癫痫，其机制在于加强GABA能系统的活性。近来有研究表明，GABA在免疫系统 中同样具有抑制性功能（Fontainhas A etal.PLoS 0ne2011;6 (l):el5973;BhatRetal. ProcNatlAcadSciUSA, 2010. 107 (6):p.2580-5;LeeMetal. Glia, 2011. 59 (I):p. 152-65)。
[0005] 本申请的发明人拟提供抗癫痫药噻加宾的新的药用用途，具体地，涉及噻加宾在 制备治疗多巴胺能神经元损伤药物中的用途以及在帕金森病中的保护效应。
[0006] 与本发明先关的现有技术有：
[0007] Bhat R. et al. , Inhibitory role for GABA in autoimmune inflammation. ProcNatlAcadSci USA, 2010;107(6):p. 2580-5.
[0008] Bocchini V, Mazzol la R, Barluzzi R, Blasi E, Sick P, Kettenmann H. An immortali zed cell line expresses properties of activated microglial cells. JNeurosci Res. 1992;31(4):616-21.
[0009] Fontainhas AM, Wang M, Liang KJ, Chen S, Mettu P, Damani M, Fariss RN, Li ff, Wong WT. Microglial morphology and dynamic behavior isregulated by ionotropic glutamatergic and GABAergic neurotransmission. PLoS One. 2011;6(I):e15973.
[0010] Lee M1Schwab C1McGeer PL. Astrocytes are GABAergic cells that modulatemicroglial activity. Glia. 2011;59(I):152-65.
[0011] Vila M, Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson' sdisease. NatMed. 2004;lOSuppl:S58-62. 〇
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供噻加宾在制备治疗多巴胺能神经元损伤药物中的用途，本发 明的进一步目的是提供噻加宾在制备治疗帕金森病的药物中的用途。
[0013] 本发明基于帕金森病的病理特征和GABA在中枢神经系统和免疫系统的抑制性 作用，在神经毒素诱导的帕金森病小鼠模型中进行试验，结果显示，噻加宾（Tiagabine， Y _氨基丁酸转运体拮抗剂）通过增强Y _氨基丁酸（GABA)能系统活性，抑制神经炎症，从 而保护多巴胺能神经元，对帕金森病具有治疗作用。
[0014] 在本发明的第一方面，提供了抗癫痫药噻加宾的一种抑制小胶质细胞激活的新功 能，包括离体实验和在体实验两个方面。
[0015] 离体部分包括步骤：
[0016] (i)培养永生化的小鼠小胶质细胞（BV2) (BocchiniVetal. Journal of Neuroscience Research 1992;31 (4):616_621)，实验分为四组：对照组；Tiagabine 给药 组；LPS 给药组（I ii g/ml)和 Tiagabine (50 ii M)与 LPS 共给药组；
[0017] (ii) LPS可激活（i)中BV2细胞，表现为：1)核转录因子NF-K B入核增加；2)核 转录因子NF-k B的活性增大，Tiagabine自身对（i)中BV2细胞的NF-k B定位没有影响， 而Tiagabine可抑制（i)中LPS刺激的BV2细胞内NF-k B的活性。
[0018] 在本发明的另一优选例中还包括给予不同浓度的Tiagabine (1，5,10,50,100， 500 u M)
[0019] 在体部分包括步骤：
[0020] (i) 10-14周龄雄性C57BL/6,实验分为三组：对照组；MPTP给药组（20mg/kg体 重，4次腹腔注射，每次间隔2小时）；Tiagabine (lmg/kg体重，第一次MPTP给药前1小时 腹腔注射）与MPTP共给药组；
[0021] (ii) MPTP可激活（i)中的黑质-纹状体通路中的小胶质细胞，表现为：1)胞体变 大；2)突起增多；而Tiagabine可以抑制（i)中MPTP刺激下黑质-纹状体通路中小胶质细 胞的活化。
[0022] 在另一优选例中包括步骤：
[0023] (i) 10-14周龄雄性C57BL/6,实验分为三组：对照组；LPS给药组（0. 5 ill黑质内 注射，浓度为5 ii g/ yl) Jiagabine (lmg/kg体重，LPS给药前1小时腹腔注射，LPS黑质 内注射后每日1次，连续3日）与LPS共给药组；
[0024] (ii) LPS可激活（i)中的黑质-纹状体通路中的小胶质细胞，表现为：1)胞体变 大；2)突起增多；而Tiagabine可以抑制（i)中LPS刺激下黑质-纹状体通路中小胶质细 胞的活化。
[0025] 在本发明的第二方面，用上述方法获得Tiagabine抑制小胶质细胞的模型后，对 多巴胺能细胞具有保护作用，包括离体实验和在体实验两个方面。
[0026] 离体部分包括步骤：
[0027] ( i )收集本发明的第一方面离体部分（i )中BV2细胞培养液，加入培养的人多巴胺 能细胞系SH-SY5Y细胞；
[0028] (ii)分析（i)中各组细胞的活力，发现LPS刺激后BV2细胞的培养液具有神经毒 性，表现为减少了 SH-SY5Y细胞的存活；LPS与Tiagabine共给药后BV2细胞培养液的神经 毒性明显降低。
[0029] 在另一优选例中还包括给予不同浓度的Tiagabine。5,10, 50,100 U M Tiagabine 均具有保护作用。
[0030] 在体部分包括步骤：
[0031] (i)分析本发明的第一方面的在体部分（i)中黑质-纹状体通路的多巴胺能系 统，MPTP诱导纹状体内酪氨酸羟化酶（TH)蛋白水平下降、TH阳性神经末梢减少和黑质致密 部多巴胺能神经元数量降低；而Tiagabine则显著保护了黑质-纹状体通路的多巴胺能系 统；
[0032] (ii) Tiagabine在（i)中的保护作用还表现在行为学分析上，MPTP损害了小鼠的 协调运动的能力，在滚轴实验中表现为整体运动水平的降低；而Tiagabine则显著保护了 小鼠的协调运动能力。
[0033] 在另一优选例中包括LPS可损伤黑质-纹状体通路的多巴胺能系统，表现为黑质 致密部多巴胺能神经元数量降低；而Tiagabine则显著保护了黑质-纹状体通路的多巴胺 能系统。
[0034] 在本发明的第三方面，基于上述方面获得的结果，提供了噻加宾在制备治疗多巴 胺能神经细胞损伤相关疾病的的药物中的用途；所述的多巴胺能神经细胞损伤相关疾病优 选帕金森病。
[0035] 本发明的主要优点在于：抗癫痫药Tiagabine已在临床上应用多年，本发明经过 深入而广泛的研究，发现Tiagabine具有抗小胶质细胞激活的新功能，而且可以保护多巴 胺能神经细胞，进一步提供了噻加宾在制备治疗帕金森病的药物中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1显示，培养BV2细胞，给予药物处理，分析细胞中NF- K B的活性
[0037] 其中，图IA显示：静息状态下，NF-k B (p65亚单位）主要定位于细胞浆内；给予 LPS刺激后1小时，NF-k B核定位增加，表明该通路处于激活状态；
[0038] 图IB显示：给予LPS后6小时Luciferase报告基因表达明显上升，表明NF-K B 活性增加。
[0039] 图2显示，LPS刺激组中条件性培养的SH-SY5Y细胞活性明显下降；而在LPS刺激 前预先给予不同剂量的Tiagabine (5, 10, 50, 100 ii M)可以明显改善条件性培养的SH-SY5Y 细胞活性。
[0040] 图3A，B显示，MPTP腹腔注射后1天，纹状体区和黑质小胶质细胞呈现明显激活状 态，数量增多，胞体变大，突起变粗；而预给予Tiagabine能够明显减轻小胶细胞的激活；
[0041] 图3C显示小鼠黑质立体定位注射药物后，小胶质细胞活化情况。
[0042] 图4显示了小鼠模型中黑质-纹状体通路的特征
[0043] 图4A显示，MPTP给药组纹状体TH蛋白含量及多巴胺能神经末梢明显下降，黑质 部位多巴胺能神经元胞体明显减少；而Tiagabine可以明显减轻MPTP所引起的黑质纹状体 通路多巴胺能神经元和末梢的丢失，Bar=IOO Ii m。；
[0044] 图4B显示，MPTP注射组小鼠运动能力明显下降，而Tiagabine则可改善MPTP所 引起的小鼠运动能力的下降，*P〈〇. 05，**p〈0. 01。
【具体实施方式】
[0045] 实施例1 :培养BV2细胞，给予药物处理，分析细胞中NF- K B的活性
[0046] I) NF- K B核定位研究：BV2小胶质细胞于DMEM/F12+5%胎牛血清培养基中培养； 根据分组分别给予 PBS ;LPS( I y g/ml);Tiagabine(50 y M);Tiagabine 预给药 1 小时 +LPS ; LPS给药后I小时，通过细胞免疫荧光染色及激光共聚焦成像技术，观察NF- K B (p65亚单 位）核定位情况；如图IA所示：静息状态下，NF-kB (p65亚单位）主要定位于细胞浆内；给 予LPS刺激后1小时，NF-k B核定位增加，表明该通路处于激活状态；预先给予Tiagabine 可以减少NF- K B的入核，抑制炎症通路的激活；而单给予Tiagabine则对NF- K B的核定位 没有影响。
[0047] 2)通过荧光素酶（Luciferase)报告基因系统检测细胞NF-K B活性：BV2小胶质细 胞于DMEM/F12+5%胎牛血清培养基中培养。当细胞汇合度达90%左右时，将NF- K B萤火虫 酶报告基因质粒（PNFk B-Luc)与作为内参的海肾酶基因质粒（pCMV-Renilla)通过脂质体 转染法(Lipofectamine? 2000)共转染入BV2细胞；转染后24小时更换培液并将细胞移入 96孔突光检测培养板；转染后48小时，根据分组分别给予PBS ;LPS (I ii g/ml) Jiagabine (50 u M) ;Tiagabine 预给药 1 小时 +LPS ;LPS 给药后 6 小时检测 Luciferase 与 Renilla 荧光素表达，如图IB所示：给予LPS后6小时Luciferase报告基因表达明显上升，表明 NF- K B活性增加；预给Tiagabine可明显降低LPS引起的NF- K B激活；而单给Tiagabine 对NF-k B的激活没有明显影响，*p〈0. 05，#p〈0. 01与对照组相比；#p〈0. 05,与LPS组相比 较。
[0048] 实施例2 :收集BV2细胞的条件培液，加入培养的人多巴胺能细胞系SH-SY5Y细 胞，分析SH-SY5Y细胞的活力
[0049] 分别给予 BV2 小胶质细胞 PBS ;LPS (I U g/ml);Tiagabine (50 U M);Tiagabine 预 给药1小时+LPS，24小时后将各组培养基分别加入SH-SY5Y细胞中进行条件性培养，24小 时后通过MTT法检测SH-SY5Y细胞活性；如图2所示，LPS刺激组中条件性培养的SH-SY5Y 细胞活性明显下降；而在LPS刺激前预先给予不同剂量的Tiagabine (5, 10, 50, 100 ii M)可 以明显改善条件性培养的SH-SY5Y细胞活性，但500 ii MTiagabine则对细胞显示出明显毒 性作用，#P〈〇. 01与对照组相比；#P〈〇. 05, ##p〈0. 01与LPS组相比。
[0050] 实施例3 :腹腔注射MPTP或黑质立体定位注射LPS，结合Tiagabine预给药，分析 小胶质细胞的活化
[0051] 1)小鼠腹腔注射药物后，小胶质细胞活化情况：实验中使用10-14周龄C57BL/6小 鼠，实验分为三组：生理盐水对照组；MPTP组；Tiagabine与MPTP共给药组。MPTP急性模型 建立方法：每间隔2小时经腹腔注射给予MPTP ? HCl (20mg/kg)，共4次；生理盐水对照组 腹腔注射相同体积的生理盐水；而Tiagabine预给药组则在首次注射MPTP前1小时腹腔注 射Tiagabine(lmg/kg)。模型建立后第2天小鼠灌流取脑，固定，脱水，冰冻切片，通过免疫 荧光染色进行纹状体和黑质部位小胶质细胞标记物Ibal染色，观察分析小胶质细胞活化 情况。如图3A，B所示，MPTP腹腔注射后1天，纹状体区和黑质小胶质细胞呈现明显激活状 态，数量增多，胞体变大，突起变粗；而预给予Tiagabine能够明显减轻小胶细胞的激活。
[0052] 2)小鼠黑质立体定位注射药物后，小胶质细胞活化情况：本实验中使用10-14 周龄的C57BL/6小鼠，实验分为三组：生理盐水对照组；LPS组；Tiagabine与LPS共给药 组。根据分组通过脑立体定位注射生理盐水（0.5 ill)或LPS (0.5 iil，浓度为5 iig/iil)， Tiagabine组则在LPS给药前1小时腹腔注射Tiagabine (lmg/kg)，并术后每日给药1次， 连续3日，术后第4天小鼠灌流取脑，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片，通过免疫 组织化学进行黑质部位小胶质细胞标记物Ibal染色，观察分析小胶质细胞活化情况，如图 3C所示。
[0053] 实施例4 :在上述小鼠模型中分析黑质-纹状体通路的特征
[0054] 1)通过对上述实施例3的1)中各组小鼠纹状体、黑质部位脑片样本进行TH免疫 组化染色以观察纹状体多巴胺神经末梢数量和黑质部位多巴胺能神经元数量与形态，并通 过抽提纹状体蛋白进行免疫印记实验定量纹状体中TH蛋白含量。由图4A可见，MPTP给药 组纹状体TH蛋白含量及多巴胺能神经末梢明显下降，黑质部位多巴胺能神经元胞体明显 减少；而Tiagabine可以明显减轻MPTP所引起的黑质纹状体通路多巴胺能神经元和末梢的 丢失，Bar=IOO u m。
[0055] 2)小鼠腹腔注射MPTP后，运动能力的行为学观察：小鼠经上述实施例3的1)中 所述方法进行MPTP腹腔注射建模，8天后进行滚轮实验观察其运动能力。Tiagabine预给 药组则继续每日腹腔注射1次Tiagabine(lmg/kg)，直至行为学实验前一天，其余组则注射 相同体积生理盐水，由图4B所示，MPTP注射组小鼠运动能力明显下降，而Tiagabine则可 改善MPTP所引起的小鼠运动能力的下降，*p〈0. 05, #p〈0. 01。
[0056] 3)通过对上述实施例3的2)中各组小鼠黑质部位脑片样品进行多巴胺能神经元 标志物TH的免疫荧光染色观察多巴胺能神经元数量和形态。
[0057] 本申请实验结果表明，LPS对黑质部位多巴胺能神经元具有损伤作用，而 Tiagabine则保护多巴胺能神经元。
【权利要求】
1. 噻加宾在制备神经细胞损伤保护药物中的用途；所述的噻加宾是氨基丁酸转运 体拮抗剂。
2. 噻加宾在制备治疗多巴胺能神经元损伤药物中的用途。
3. 噻加宾在制备治疗多巴胺能神经细胞损伤相关疾病的药物中的用途。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺能神经细胞损伤相关疾病是 帕金森病。
5. 如权利要求1-3所述的任一项的用途，其特征在于，噻加宾通过增强氨基丁酸能 系统活性，抑制神经炎症，保护多巴胺能神经兀。
【文档编号】A61P25/16GK104415037SQ201310380332
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】黄芳, 刘杰 申请人:复旦大学