蚕丝支架、制备方法、应用以及三相蚕丝韧带移植物、制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种蚕丝支架、制备方法、应用以及三相蚕丝韧带移植物、制备方法，首先将蚕丝编织成具有大孔结构的网状支架，再将网状蚕丝支架划分为三个区域：A.韧带区、B.软骨修饰区、C.骨修饰区，在A、B、C区分别种植韧带细胞、软骨细胞、成骨细胞，卷折分区修饰的网状支架，形成具有生理过渡结构的圆柱形韧带移植物。这种从软组织到硬组织逐渐过渡的结构，既有效避免了软硬组织直接连接造成的应力集中的问题，又解决了目前单相组织工程韧带存在的韧带移植物-骨结合部生物固定不牢靠的问题，以及传统韧带编织方法种子细胞无法进入韧带深层的问题，同时韧带移植物具有完整的编织结构，解决了目前三相组织工程韧带存在的层与层之间连接薄弱的问题。
【专利说明】蚕丝支架、制备方法、应用以及三相蚕丝韧带移植物、制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学组织工程领域，具体属于能够重建韧带-骨接合部正常解剖结构的三相蚕丝韧带移植物领域。
【背景技术】
[0002]前交叉韧带(ACL, anterior cruciate ligament)损伤是膝关节常见疾患。ACL损伤常导致膝关节不稳和退行性骨关节炎。由于其再生能力有限，损伤后不能自行修复，因而重建必须通过韧带移植。韧带移植物的来源主要有两个:①自体或同种异体韧带移植
组织工程韧带。[0003]目前临床多采用自体韧带移植，但是自体韧带移植的来源不足，并且自体韧带移植取材后也会造成很多并发症。目前多采用髌韧带中1/3部分重建前交叉韧带，但是取了这部分肌腱后髌韧带就相对薄弱了，而且髌骨缺损一部分，术后容易骨折，此外，最重要的是术后有相当一部分患者发生髌前痛。另外一种常用的移植物是胭绳肌腱，该移植物两端没有骨质，韧带-骨界面愈合差，骨道内瘢痕填充，力学性能不能达到前交叉韧带的要求，并且切取自体胭绳肌后屈膝肌力会减弱。异体韧带移植虽然避免了取材区并发症，但存在免疫排斥反应、感染艾滋病病毒、价格昂贵等不足，临床应用受到限制。
[0004]由于自体或异体韧带需求量大而来源有限，组织工程韧带成为一种很好的选择。目前用于人体临床治疗的主要有聚四氟乙烯韧带(Gore-Tex韧带)和聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维韧带(LARS人工韧带)。
[0005]但是目前的人工韧带仍存在一定的局限性:①由于人工韧带并非生物重建，远期易发生蠕变、疲劳、力学失败；②目前单相结构(即单一结构)的韧带支架很难在骨道中再生出典型的韧带一骨接合部四层结构(胶原纤维、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨)，多数情况下形成韧带胶原纤维与骨组织的直接连接文献报道一种PLGA的三相支架，其层与层之间的结合欠佳，韧带部分的力学性能还不能满足于ACL重建的要求(SpalazziJPjDoty SB，Moffat KLjet al.Development of controlled matrix heterogeneityon a triphasic scaffold for orthopedic interface tissue engineering.TissueEng2006; 12:3497 - 508.) 传统编织方法制备的蚕丝支架虽然可获得近似于ACL的力学强度，MSC也可在支架上粘附、增殖和分化(Altman GH, Horan RL, Lu HH, Moreau J, Martin
I,Richmond JC,et al.Silk matrix for tissue engineered anterior cruciateligaments.Biomaterials2002; 23:4131 - 41),但这种编织方式的蚕丝纤维间孔隙率小，MSC植入后刚开始粘附在材料表面，体外培养I周和2周后支架表面完全被分泌的细胞外基质包被，而内部没有细胞进入。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种蚕丝支架、制备方法、应用以及三相蚕丝韧带移植物、制备方法。
[0007]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0008]一种蚕丝支架，该蚕丝支架包括具有微孔结构的蚕丝支架本体，所述蚕丝支架本体沿纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，第一过渡区以及第二过渡区沿横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区，韧带重建中心区以及韧带重建边缘区均采用丝素蛋白进行修饰，软骨修饰区采用明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素进行修饰，骨修饰区依次采用丝素蛋白以及羟基磷灰石进行修饰。
[0009]所述蚕丝支架本体采用网状蚕丝支架制备而成。
[0010]上述蚕丝支架在制备韧带移植物中的应用。
[0011]一种蚕丝支架的制备方法，包括以下步骤:
[0012]I)将蚕丝用编织机编织成孔径为2_4mm的网状蚕丝支架；
[0013]2)将网状蚕丝支架的一侧表面沿网状蚕丝支架纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，将第一过渡区以及第二过渡区沿网状蚕丝支架横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区；
[0014]3)于室温下使用质量分数为1.8-2.0%的丝素蛋白溶液将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区浸透，同时，采用溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液将软骨修饰区浸透，然后将网状蚕丝支架于-15~-30°C下静置0.5~2小时,静置后于-60~_90°C再静置0.5~2小时；
[0015]4)经过步骤3)后，将网状蚕丝支架进行真空冷冻干燥；
[0016]5)经过步骤4)后， 将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区均用体积分数90%的甲醇水溶液浸泡8-15min，浸泡后将网状蚕丝支架放入干燥箱干燥或自然风干，然后在骨修饰区制备羟基磷灰石涂层。
[0017]所述蚕丝在编织前进行脱丝胶处理，或者，用未脱丝胶的蚕丝进行编织，在步骤2)之前将编织得到的网状蚕丝支架进行脱丝胶处理。
[0018]所述脱丝胶处理的步骤为:将质量分数0.2-0.3%的碳酸钠水溶液煮沸，然后按照每升碳酸钠水溶液处理2-3g蚕丝的比例，将未脱丝胶的蚕丝或由未脱丝胶的蚕丝编织成的网状蚕丝支架置于沸腾的碳酸钠水溶液中，然后继续加热煮沸20-30分钟。
[0019]所述丝素蛋白溶液的制备方法为:将蚕丝在加热、搅拌的条件下溶解在溴化锂水溶液中得溶液a，将溶液a使用去离子水进行透析，将透析后的溶液a于4°C、8000_10000转/分的条件下离心，取离心后的上清液得丝素蛋白溶液。
[0020]所述溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液的制备方法为:将0.5g明胶粉剂、0.1g硫酸软骨素粉剂和5mg透明质酸钠溶解于10-20mL双蒸水中，然后向双蒸水中再加入I~3mL质量分数为1%的EDAC。
[0021]所述真空冷冻干燥的条件为:真空度为0.010~0.4mbar，温度为-20~_50°C，时间为 48-72h。
[0022]所述羟基磷灰石涂层采用两种溶液交替浸润的方法制备，其中一种溶液为用PH值为7.4的Tris-HCl缓冲液以及氯化钙配置的氯化钙溶液，另一种溶液为磷酸氢二钠水溶液。
[0023]一种三相蚕丝韧带移植物，包括卷折为柱状的蚕丝支架、韧带细胞、软骨细胞和成骨细胞，所述蚕丝支架包括具有微孔结构的蚕丝支架本体，蚕丝支架本体的一侧表面依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，第一过渡区和第二过渡区分别位于柱状的蚕丝支架的两端，第一过渡区以及第二过渡区沿蚕丝支架的卷折方向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区，韧带细胞位于韧带重建中心区和韧带重建边缘区，软骨细胞位于软骨修饰区，成骨细胞位于骨修饰区。
[0024]所述蚕丝支架本体采用网状蚕丝支架制备而成，所述韧带重建中心区以及韧带重建边缘区均采用丝素蛋白进行修饰，软骨修饰区采用明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素进行修饰，骨修饰区依次采用丝素蛋白以及羟基磷灰石进行修饰。
[0025]一种三相蚕丝韧带移植物的制备方法，包括以下步骤:
[0026]I)将蚕丝用编织机编织成孔径为2_4mm的网状蚕丝支架；
[0027]2)将网状蚕丝支架的一侧表面沿网状蚕丝支架纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，将第一过渡区以及第二过渡区沿网状蚕丝支架横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区；
[0028]3)使用钴60照射对网状蚕丝支架消毒，然后将韧带细胞种植于韧带重建中心区和韧带重建边缘区，将软骨细胞种植于软骨修饰区，将成骨细胞种植于骨修饰区，韧带细胞、软骨细胞以及成骨细胞采用0.8-1.5 X IO5个细胞/cm2的浓度进行种植；
[0029]4)待种植的细胞黏附于网状蚕丝支架后，将网状蚕丝支架沿其横向按照从韧带重建边缘区到软骨修饰区再到骨修饰区的次序进行卷折，制成柱状的韧带移植物。
[0030]所述蚕丝在编织前进行脱丝胶处理，或者，用未脱丝胶的蚕丝进行编织，在步骤2)之前将编织得到的网状蚕丝支架进行脱丝胶处理。
[0031]所述脱丝胶处理的步骤为:将质`量分数0.2-0.3%的碳酸钠水溶液煮沸，然后按照每升碳酸钠水溶液处理2-3g蚕丝的比例，将未脱丝胶的蚕丝或由未脱丝胶的蚕丝编织成的网状蚕丝支架置于沸腾的碳酸钠水溶液中，然后继续加热煮沸20-30分钟。
[0032]所述步骤3)之前，对韧带重建中心区、韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区进行修饰，修饰的具体方法为:
[0033]第一步，于室温下使用质量分数为1.8-2.0%的丝素蛋白溶液将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区浸透，同时，采用溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液将软骨修饰区浸透，然后将网状蚕丝支架于-15~_30°C下静置0.5~2小时,静置后于-60~90°C再静置0.5~2小时；
[0034]第二步，经过第一步后，将网状蚕丝支架进行真空冷冻干燥；
[0035]第三步，经过第二步后，将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区均用体积分数90%的甲醇水溶液浸泡8-15min，浸泡后将网状蚕丝支架放入干燥箱干燥或自然风干，然后在骨修饰区制备羟基磷灰石涂层。
[0036]所述丝素蛋白溶液的制备方法为:将蚕丝在加热、搅拌的条件下溶解在溴化锂水溶液中得溶液a，将溶液a使用去离子水进行透析，将透析后的溶液a于4°C、8000_10000转/分的条件下离心，取离心后的上清液得丝素蛋白溶液。
[0037]所述溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液的制备方法为:将0.5g明胶粉剂、0.1g硫酸软骨素粉剂和5mg透明质酸钠溶解于10-20mL双蒸水中，然后向双蒸水中再加入I~3mL质量分数为1%的EDAC。[0038]所述真空冷冻干燥的条件为:真空度为0.010~0.4mbar，温度为-20~_50°C，时间为 48-72h。
[0039]所述羟基磷灰石涂层采用两种溶液交替浸润的方法制备，其中一种溶液为用PH值为7.4的Tris-HCl缓冲液以及氯化钙配置的氯化钙溶液，另一种溶液为磷酸氢二钠水溶液。
[0040]本发明的有益效果体现在:
[0041]本发明所述蚕丝支架通过在同一网状蚕丝支架上制备用于种植韧带细胞的韧带区、用于种植软骨细胞的软骨修饰区以及用于种植成骨细胞的骨修饰区而形成，通过上述区域在网状蚕丝支架上的排布，可以用作制备蚕丝韧带移植物的支架，结构简单，有利于提高韧带移植物的使用效果。
[0042]本发明所述三相蚕丝韧带移植物包括卷折为柱状的蚕丝支架以及韧带细胞、软骨细胞和成骨细胞，蚕丝支架被划分为韧带区、软骨修饰区以及骨修饰区，并在种植对应的细胞后按照次序进行卷折，使所述三相蚕丝韧带移植物的韧带-骨接合部在横切面上由内向外具有从“韧带一软骨一骨”的移行结构，模拟并重建了正常韧带-骨接合部的生理过渡结构；由于该三相蚕丝韧带移植物具有与正常韧带-骨结合部相近的组织结构，其可在移植骨道内形成新生骨，韧带移植物-骨结合部的生物固定更加牢固，不易拔脱，增加了韧带的插入强度；由于该三相蚕丝韧带移植物具有与正常韧带-骨结合部相近的移行结构(韧带—软骨一骨)，可以有效避免应力的集中，提高韧带移植物的生物力学性能。
[0043]同时，本发明中通过卷折完整的网状蚕丝支架形成韧带移植物，由于具有完整的编织结构，层与层之间连接紧密，使本发明所述韧带移植物具有与正常韧带相近的力学强度。
[0044]本发明所述韧带移植物的制备采用了先将种子细胞培养在网状支架上，再卷折网状支架，形成圆柱状韧带的方法，在圆柱体的深层也同样有细胞长入，解决了传统韧带编织方法种子细胞无法进入韧带深层的问题。
[0045]本发明所述韧带移植物的制备中各个分区分别被丝素蛋白、明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素和丝素蛋白+羟基磷灰石修饰，营造了适合三种不同细胞(韧带细胞/成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞)的三种微环境，更加有利于不同细胞的存活和增殖，有效地避免了细胞的分化和老化。其中，明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素的组合，模拟了软骨细胞的细胞外基质，可以明显减少软骨细胞的分化，有利于软骨细胞增殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为本发明所述蚕丝支架本体的分区及卷折示意图；图1中:A为韧带区，B为软骨修饰区，C为骨修饰区；
[0047]图2为本发明所述蚕丝支架光学显微观察图像；
[0048]图3为本发明所述蚕丝支架扫描电镜观察图像；
[0049]图4为羟基磷灰石修饰材料的扫描电镜图像；
[0050]图5为本发明所述移植物细胞生长的微观结构图。
【具体实施方式】[0051]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0052]一种理想的组织工程韧带应具备以下特点:①支架材料具有良好的生物相容性；②组织工程韧带具有足够的力学强度及抗疲劳能力韧带强度维持时间必须要足够长，以利于韧带重建；④韧带一骨接合部需要再生出典型的韧带一骨接合部四层结构(胶原纤维、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨)，利于增加韧带-骨接合部的固定强度和避免应力集中；⑤种子细胞能在支架材料上生长和增殖；⑥种子细胞需要均匀地分布于韧带里层和外层。
[0053]为了达到以上要求，由细胞和可吸收生物材料共同构成的组织工程韧带进行生物重建是最终发展方向。蚕丝重量轻(1.3g/cm3)、强度高(约4.8GPa)、弹性好(弹性形变高达35%)，编织的蚕丝支架可获得近似于ACL的力学强度。蚕丝具有很好的生物相容性，种子细胞可在支架上粘附、增殖和分化。蚕丝的降解十分缓慢，在韧带的重建期间能够维持足够的力学性能。真正再生韧带，需要在支架上种植细胞，通过细胞增殖和不断地分泌基质，形成新生韧带，同时人工支架不断降解，达到韧带再生的目标。可以使用丝素蛋白、明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素和丝素蛋白+羟基磷灰石修饰网状蚕丝支架，分别为成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞提供更适合其生长和增殖的特有的微环境。将网状蚕丝支架分成韧带区、软骨区(即软骨修饰区)和骨区(即骨修饰区)，分别使用不同的材料修饰，并种植相应细胞，再将网状蚕丝支架卷折成柱状韧带移植物，可以重建韧带-骨接合部的移行结构。同时，卷折已均匀种植细胞的网状蚕丝支架可以使柱状韧带移植物深层也同样有细胞长入，更加有利于韧带的再生。
[0054]据此，本发明提出一种重建韧带-骨接合部正常解剖结构的三相蚕丝韧带移植物的制备方法，所制备的韧带移植物既能够模拟正常韧带-骨结合部的解剖结构以获得韧带-骨接合部的高强度固定，避免应力集中，同时又具有完整的编织结构以获得理想的力学强度，包括以下步骤:
[0055]I)网状蚕丝支架的制备
[0056]1.1蚕丝脱丝胶
[0057]将质量分数0.2-0.3%的碳酸钠(Na2CO3)水溶液煮沸，按照每升碳酸钠水溶液处理2-3g未脱丝胶的蚕丝的比例，将未脱丝胶的蚕丝置于沸腾的碳酸钠溶液中，继续加热沸腾20-30分钟。用钳子取出蚕丝，用去离子水或超纯水冷却蚕丝，用手挤出多余的水和碳酸钠溶液。将蚕丝放入IL去离子水或超纯水中(按照IL水最多清洗12.5g蚕丝的比例)，轻柔地震荡清洗20分钟，再钳出蚕丝、拧干，再换IL去离子水或超纯水后清洗，重复震荡清洗3遍，取出蚕丝、拧干，置于清洁容器中，在电子恒温干燥箱中烘干。
[0058]1.2网状蚕丝支架的编织
[0059]1.2.1用已脱丝胶的蚕丝进行编织
[0060]将已脱丝胶蚕丝直接用编织机编织成孔径为2_4mm的网状蚕丝支架，使用纬平针组织或罗纹组织的编织方法。
[0061]1.2.2用未脱过丝胶的蚕丝进行编织
[0062]将未脱过丝胶的蚕丝用编织机编织成孔径为2_4mm的网状蚕丝支架。再将编织好的网状蚕丝支架用1.1中的方法，进行脱丝胶处理，获得脱过丝胶的网状蚕丝支架。
[0063]根据实际情况，若编织过程中蚕丝容易被污染，那么可以选择采用如1.2.2所述的方法。[0064]2)网状蚕丝支架的分区和修饰
[0065]2.1网状蚕丝支架的分区
[0066]将网状蚕丝支架划分为三个区域，如图1所示:A区:韧带区、B区:软骨修饰区、C区:骨修饰区。卷折分区后的网状支架，可以用于形成柱状组织工程韧带。该组织工程韧带的特点是:韧带两端的横切面形成从中央到边缘的韧带一软骨一骨的过渡区(A — B — C区)。A区均使用丝素蛋白溶液(即蚕丝溶液)进行修饰，网状蚕丝支架中央部的A区域为韧带重建区，网状蚕丝支架两边的A区域可以重建韧带移植骨道内的胶原韧带区域。
[0067]2.2网状蚕丝支架的修饰
[0068]2.2.1丝素蛋白溶液的制备
[0069]将溴化锂(LiBr)用去离子水配成浓度为9.3mol/L的溶液，按照SOmL溴化锂溶液溶解20g蚕丝(4ml:lg)的比例来溶解蚕丝。将所需溶解的蚕丝称重后放入玻璃烧杯中，将溴化锂溶液按4mL/g的比例浇在蚕丝上，放入一枚搅拌子，将烧杯置于可加热的磁力搅拌器上,轻柔搅拌,加盖,并将液体温度加热至60°C，溶解3-5小时后，蚕丝可完全溶解，溶液呈褐色或透明，记为溶液a。将溶液a加入透析袋(3500MWC0)中，按照每10_12mL溶液a使用1-1.5L的去离子水比例进行透析，分别于I小时、4小时、当天晚上、第二天早上、第二天晚上、第三天早上更新去离子水(48小时换6次水)。然后将透析袋内的溶液a装入离心管中，在温度为4°C的条件下，离心2~3次，离心转速为8000-10000转/分(离心30分钟)，取上清得蚕丝溶液。将0.5mL制备好的蚕丝溶液加在已称量的容器内，于60°C烘箱完全干燥后，再次称重，减去原来容器的重量，除以0.5mL，得到最终蚕丝溶液的浓度。
[0070]2.2.2网状蚕丝支架各个 分区的修饰
[0071]用直径1.5mm的钢针制成长方形绷子，将网状蚕丝支架绷开，支架网格间大孔直径约2-4mm，用分隔培养器将网状蚕丝支架按图1所示分隔成A、B、C三区，各个区域之间是密封的，分隔培养器具有与所示各个区域一一对应的分隔空间，各个空间相互独立，并分别与对应的分区相通，为了防止液体在不同区域间相互渗漏，用封口膜将各个分区交界处的部分密封，密封方式为将封口膜压入网状蚕丝支架上各个分区的交界处。
[0072]A区、C区使用质量分数2.0%的丝素蛋白溶液浸润透，液面高度高出网状蚕丝支架平面l_2mm。同时，B区使用明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素进行修饰:将0.5g明胶粉剂, 0.1g硫酸软骨素粉剂和5mg透明质酸钠加入10-20mL双蒸水中搅拌至溶解,然后再加入2mL质量分数为1%的EDAC (乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺)水溶液(pH值为5_6)得溶液b，将溶液b倒入与B区对应的分隔空间，液面高度高出网状蚕丝支架平面l_2mm，室温下胶联2-3min后置于_20°C I小时终止交联，然后置于_80°C I小时。将整个支架于真空度
0.2mbar、温度_35°C的条件下进行抽真空冷冻干燥48h完成造孔。
[0073]然后,A区、C区均用体积分数90%甲醇水溶液浸泡8_15min,浸泡处理后放入干燥箱干燥或自然风干。
[0074]支架干燥或风干后将C区用“两种溶液交替浸润”的方法在经冷冻干燥造好微孔的蚕丝支架上引入羟基磷灰石(HA)涂层得三相网状蚕丝支架。具体步骤如下:第一步，配置两种溶液:①钙(Ca)溶液:用PH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配置200mM的氯化钙(CaCl2)溶液；②磷(P)溶液:120mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)水溶液。第二步，先将C区用10-30mL配置的钙溶液浸泡，并在37°C恒温箱反应I小时。然后倒出钙溶液，并用吸纸吸干残留液体。再用配置的磷溶液浸泡，同样在37°C恒温箱反应I小时。然后倒出磷溶液，并用吸纸吸尽磷溶液后，再用钙溶液浸泡I小时。重复上述交替钙磷溶液浸泡3-4次，阴干后可在蚕丝周围形成羟基磷灰石(HA)涂层，至此得到三相蚕丝支架，参见图2-图4，其中图4中箭头所指为支架表面HA颗粒。
[0075]2)细胞的种植
[0076]将制备好的三相蚕丝支架使用钴60照射消毒，按照0.8-1.5 X IO5个细胞/cm2的浓度分别将韧带细胞(成纤维细胞)、软骨细胞和成骨细胞接种于A、B和C区。
[0077]3)种植细胞24h_7天后(具体时间以细胞黏附于支架，且可以正常增殖为准)，参见图5，箭头所指为粘附在支架上的细胞。将三相网状蚕丝支架按照横轴方向(韧带横切面方向)从A — B — C的方向卷折，制成柱状韧带移植物。[0078]按此方法制成的重建韧带-骨接合部正常解剖结构的三相蚕丝韧带移植物的韧带-骨接合部在横切面上由内向外具有从“韧带一软骨一骨”的移行结构，模拟并重建了正常韧带-骨接合部的生理过渡结构。这种生理过渡结构，使该韧带移植物在移植骨道内形成新生骨，韧带移植物-骨结合部的生物固定更加牢固，不易拔脱，增加了韧带的插入强度。同时，这种过渡结构也有效地避免韧带-骨接合部的应力集中，提高韧带移植物的抗疲劳能力。该三相蚕丝韧带移植物的A、B和C三区分别被丝素蛋白、明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素和丝素蛋白+羟基磷灰石修饰，营造了适合三种不同细胞(韧带细胞/成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞)三种微环境。更加有利于不同细胞的存活和增殖，有效地避免了细胞的分化和老化。另外，该三相蚕丝韧带移植物的三相蚕丝网状蚕丝支架具有完整的编织结构，层与层之间连接紧密，使该组织工程韧带具有与正常韧带相近的力学强度。最后该三相韧带移植物的制备采用了先将种子细胞培养在网状支架上，再卷折网状支架，形成圆柱状韧带的方法，保证了在圆柱体的深层也同样有细胞长入，解决了传统韧带编织方法种子细胞无法进入韧带深层的问题。
[0079]总之，本发明首先将蚕丝编织成具有大孔结构的网状支架，再将网状蚕丝支架划分为三个区域:A.韧带区、B.软骨修饰区、C.骨修饰区，A区使用丝素蛋白溶液进行修饰以利于韧带再生，B区使用明胶+透明质酸钠+硫酸软骨素进行修饰以利于软骨再生，C区用丝素蛋白溶液修饰后再用羟基磷灰石(HA)修饰以利于骨的再生。在A、B、C区分别种植韧带细胞(成纤维细胞)、软骨细胞、成骨细胞。卷折分区修饰的网状支架，形成具有生理过渡结构(韧带一软骨一骨)的圆柱形韧带移植物。这种从软组织(韧带)到硬组织(骨)逐渐过渡的结构，既有效避免了软硬组织直接连接造成的应力集中的问题，又解决了目前单相组织工程韧带存在的韧带移植物-骨结合部生物固定不牢靠的问题。同时，本发明制备的韧带移植物具有完整的编织结构，解决了目前三相组织工程韧带存在的层与层之间连接薄弱的问题。另外，本发明采用的先将种子细胞培养在网状支架上，再卷折网状支架，形成圆柱状韧带的方法，保证了在圆柱体的深层也同样有细胞长入，解决了传统韧带编织方法种子细胞无法进入韧带深层的问题。
【权利要求】
1.一种蚕丝支架，其特征在于:该蚕丝支架包括具有微孔结构的蚕丝支架本体，所述蚕丝支架本体沿纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，第一过渡区以及第二过渡区沿横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区，韧带重建中心区以及韧带重建边缘区均采用丝素蛋白进行修饰，软骨修饰区采用明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素进行修饰，骨修饰区依次采用丝素蛋白以及羟基磷灰石进行修饰。
2.根据权利要求1所述一种蚕丝支架，其特征在于:所述蚕丝支架本体采用网状蚕丝支架制备而成。
3.—种如权利要求1所述蚕丝支架在制备韧带移植物中的应用。
4.一种蚕丝支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将蚕丝用编织机编织成孔径为2-4mm的网状蚕丝支架； 2)将网状蚕丝支架的一侧表面沿纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，将第一过渡区以及第二过渡区沿横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区； 3)于室温下使用质量分数为1.8-2.0%的丝素蛋白溶液将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区浸透，同时，采用溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液将软骨修饰区浸透，然后将网状蚕丝支架于-15~-30°C下静置0.5~2小时，静置后于-60~-90°C再静置0.5~2小时； 4)经过步骤3)后，将网状蚕丝支架进行真空冷冻干燥； 5)经过步骤4)后，将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区均用体积分数90%的甲醇水溶液浸泡8-15min，浸泡后将网状蚕丝支架放入干燥箱干燥或自然风干，然后在骨修饰区制备羟基磷灰石涂层。
5.根据权利要求4所述一种蚕丝支架的制备方法，其特征在于，所述蚕丝在编织前进行脱丝胶处理，或者，用未脱丝胶的蚕丝进行编织，在步骤2)之前将编织得到的网状蚕丝支架进行脱丝胶处理。
6.一种三相蚕丝韧带移植物，其特征在于:包括卷折为柱状的蚕丝支架、韧带细胞、软骨细胞和成骨细胞，所述蚕丝支架包括具有微孔结构的蚕丝支架本体，蚕丝支架本体的一侧表面依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，第一过渡区和第二过渡区分别位于柱状的蚕丝支架的两端，第一过渡区以及第二过渡区沿蚕丝支架的卷折方向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区，韧带细胞位于韧带重建中心区和韧带重建边缘区，软骨细胞位于软骨修饰区，成骨细胞位于骨修饰区。
7.根据权利要求6所述一种三相蚕丝韧带移植物，其特征在于:所述蚕丝支架本体采用网状蚕丝支架制备而成，所述韧带重建中心区以及韧带重建边缘区均采用丝素蛋白进行修饰，软骨修饰区采用明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素进行修饰，骨修饰区依次采用丝素蛋白以及羟基磷灰石进行修饰。
8.—种三相蚕丝韧带移植物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将蚕丝用编织机编织成孔径为2-4mm的网状蚕丝支架； 2)将网状蚕丝支架的一侧表面沿纵向依次划分为第一过渡区、韧带重建中心区和第二过渡区，将第一过渡区以及第二过渡区沿横向依次划分为韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区；3)使用钴60照射对网状蚕丝支架消毒，然后将韧带细胞种植于韧带重建中心区和韧带重建边缘区，将软骨细胞种植于软骨修饰区，将成骨细胞种植于骨修饰区，韧带细胞、软骨细胞以及成骨细胞采用0.8-1.5 X IO5个细胞/cm2的浓度进行种植； 4)待种植的细胞黏附于网状蚕丝支架后，将网状蚕丝支架沿其横向按照从韧带重建边缘区到软骨修饰区再到骨修饰区的次序进行卷折，制成柱状的韧带移植物。
9.根据权利要求8所述一种三相蚕丝韧带移植物的制备方法，其特征在于，所述蚕丝在编织前进行脱丝胶处理，或者，用未脱丝胶的蚕丝进行编织，在步骤2)之前将编织得到的网状蚕丝支架进行脱丝胶处理。
10.根据权利要求8所述一种三相蚕丝韧带移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)之前，对韧带重建中心区、韧带重建边缘区、软骨修饰区以及骨修饰区进行修饰，修饰的具体方法为: 第一步，于室温下使用质量分数为1.8-2.0%的丝素蛋白溶液将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区浸透，同时，采用溶质为明胶、透明质酸钠以及硫酸软骨素的溶液将软骨修饰区浸透，然后将网状蚕丝支架于-15~-30°C下静置0.5~2小时,静置后于-60~_90°C再静置0.5~2小时； 第二步，经过第一步后，将网状蚕丝支架进行真空冷冻干燥； 第三步，经过第二步后，将韧带重建中心区、韧带重建边缘区以及骨修饰区均用体积分数90%的甲醇水溶液浸泡8-15min，浸泡后将网状蚕丝支架放入干燥箱干燥或自然风干,然后在骨修饰区制备羟基磷灰 石涂层。
【文档编号】A61L27/38GK103505762SQ201310454976
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】范宏斌, 李宏国, 孙立国, 郭征, 薛英森, 张涌泉 申请人:中国人民解放军第四军医大学