舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法；本发明还公开了舌状蜈蚣藻提取物在制备抗氧剂、抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用研究；本发明还确定了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的任何一种溶剂萃取得到的提取物可用于制备抗氧剂方面的应用，石油醚或乙酸乙酯萃取得到的提取物可用于制备抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用。
【专利说明】舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物天然产物综合开发利用【技术领域】，具体涉及舌状蜈蚣藻乙醇总提取物及其他各有机溶剂萃取的提取物，尤其涉及各提取物的制备方法及其在制备抗氧剂、抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用。
【背景技术】
[0002]广阔的海洋占地球面积的70%以上，蕴藏着丰富的生物资源。随着陆地生态资源的匮乏，天然药物开发的持续发展，对海洋资源开发利用的呼声日益高涨。海藻作为海洋生物资源的重要组成部分，它在海洋生态系统中处于被捕食者吞食的地位，与附生、共生于其中的微生物也存在着复杂的拮抗、共生关系，因此海藻常能合成具有细胞毒、抗菌等活性的次级代谢产物来保护自己。这些化学生态学现象启示研究者们对海藻天然成分的生物活性进行深入的研究。大量文献表明很多海藻成分具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗细菌、免疫增强或抑制、抗氧化、防治脑心血管疾病、抑制某些靶酶等生物活性。
[0003]舌状蜈蚁藻(Grateloupia livida (Harv).Yamada)是红藻门、真红藻纲，隐丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属的一种海水藻类植物，主要分布于海南如广东沿海。辽宁、浙江沿海也有分布。在潮汕地区，作为一种药食两用的藻类植物，舌状蜈蚣藻常被用于治疗咽喉肿痛、腹痛腹泻、湿热痢疾等疾病，具有很高的药用保健价值。
[0004]尽管舌状蜈蚣藻的资源丰富，来源广泛，并且有一定的生物活性，但目前国内外对它应用方面的研究还不多见，尤其是关于舌状蜈蚣藻提取物抗氧化，抗菌及体外抗血吸虫活性等生物活性方面的文献和专利，几乎没有。为了填补舌状蜈蚣藻提取物在生物活性这一块的技术空白，本申请充分利用了舌状蜈蚣藻的植物资源，采用体外实验来研究树莓花色苷的抗氧化能力，并考察其抑菌作用及抗血吸虫活性，希望为舌状蜈蚣藻的应用开辟更广阔的空间。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是克服现有蜈蚣藻提取物在生物活性方面应用的不足，提供舌状蜈蚣藻提取物在制备抗氧化剂、抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用。
[0006]本发明的另一目的是提供所述舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法。
[0007]本发明的舌状蜈蚣藻提取物包括舌状蜈蚣藻乙醇总提取物(EE)、经石油醚萃取蒸发得到的石油醚提取物(PE)，经乙酸乙酯萃取蒸发得到的乙酸乙酯提取物(EA)和经正丁醇萃取蒸发得到的正丁醇提取物(BuOH)。
[0008]发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种舌状蜈蚣藻乙醇提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻乙醇提取物通过如下步骤制得:
S1.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液；S2.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻乙醇提取物。
[0009]步骤SI中所述乙醇的量是干粉体积的5~10倍，所述乙醇为70%_95%体积百分比的乙醇。
[0010]所述舌状蜈蚣藻乙醇提取物于室温下避光保存。
[0011]所述舌状蜈蚣藻乙醇提取物在制备抗氧剂、抗菌剂或体外抗血吸虫剂方面的应用。
[0012]一种舌状蜈蚣藻石油醚提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻石油醚提取物通过如下步骤制得:
51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液；
52.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏；
53.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，再加入石油醚萃取，收集萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻石油醚提取物。
[0013]步骤SI中所述乙醇的量是干粉体积的5~10倍，所述乙醇为70%_95%体积百分比的乙醇。
[0014]步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏质量的3飞倍，所述石油醚萃取的次数为2飞次，每次萃取所述石油醚的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
`[0015]所述舌状蜈蚣藻石油醚提取物于室温下避光保存。
[0016]所述舌状蜈蚣藻石油醚提取物在制备抗氧剂、抗菌剂或体外抗血吸虫剂方面的应用。
[0017]一种舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物通过如下步骤制得:
51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液；
52.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏；
53.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，先加入石油醚萃取，移去石油醚萃取液后再加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物。
[0018]步骤SI中所述乙醇的量是干粉体积的5~10倍，所述乙醇为70%_95%体积百分比的乙醇。
[0019]步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏质量的3飞倍，所述石油醚萃取或乙酸乙酯萃取的次数为2飞次，每次萃取所述石油醚或乙酸乙酯的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
[0020]所述舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物于室温下避光保存。
[0021]所述舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物在制备抗氧剂、抗菌剂或体外抗血吸虫剂方面的应用。
[0022]本发明通过实验发现，所述舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物在制备的过程中未先采用石油醚萃取，而直接将步骤S2中的浸膏加入乙酸乙酯萃取，所制备得到的舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物的抗氧化效果和抗血吸虫成虫活性会降低。原因可能是一部分可溶于石油醚的成分会与不溶于石油醚而溶于乙酸乙酯的有效成分产生相克的作用。
[0023] 一种舌状蜈蚣藻正丁醇提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻正丁醇提取物通过如下步骤制得:
S1.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液；
S2.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏；
S3.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，先分别加入石油醚和乙酸乙酯萃取，分别移去石油醚和乙酸乙酯萃取液后再加入正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻正丁醇提取物。
[0024]步骤SI中所述乙醇的量是干粉体积的5~10倍，所述乙醇为70%_95%体积百分比的乙醇。
[0025]步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏的3飞倍，所述石油醚萃取、乙酸乙酯萃取或正丁醇萃取的次数为2飞次，每次萃取所述石油醚或乙酸乙酯的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
[0026]所述舌状蜈蚣藻正丁醇提取物于室温下避光保存。
[0027]所述舌状蜈蚣藻正丁醇提取物在制备抗氧剂方面的应用。
[0028]本发明通过实验发现，所述舌状蜈蚣藻正丁醇提取物在制备的过程中未先分别采用石油醚和乙酸乙酯萃取，而直接将步骤S2中的浸膏加入正丁醇萃取，所制备得到的舌状蜈蚣藻正丁醇提取物的抗氧化效果会降低。原因可能是一部分可溶于石油醚或乙酸乙酯的成分会与不溶于石油醚或乙酸乙酯而溶于正丁醇的有效成分产生相克的作用。
[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明提供了舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法；本发明还公开了舌状蜈蚣藻提取物在制备抗氧剂、抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用研究；本发明还确定了石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的任何一种溶剂萃取得到的提取物可用于制备抗氧剂方面的应用，石油醚或乙酸乙酯萃取得到的提取物可用于制备抗菌剂和/或体外抗血吸虫剂方面的应用。
[0030]【专利附图】
【附图说明】
图1为本发明所用的舌状蜈蚣藻，采自广东省汕头市南澳岛，由汕头大学海洋生物研究所鉴定。
【具体实施方式】
[0031]为了便于理解本发明，特列举以下实施例。但实施例仅是对本发明的诠释而绝非对本发明的任何形式的限制。
[0032]实施例1
制备舌状蜈蚣藻乙醇总提取物(EE)
海藻样品采集后经自来水冲洗干净，置于烘箱中于30°C烘干，烘干后用粉碎机粉碎。称取干粉100g，加入95%乙醇1000ml，于70°C加热回流3h，重复两次。提取液收集后于40°C旋转蒸发至浸膏(EE)(约14.8 g)，室温下避光保存。
[0033]实施例2制备舌状蜈蚣藻石油醚提取物(PE)和残留水相(AQ)
海藻样品采集后经自来水冲洗干净，置于烘箱中于40°C烘干，烘干后用粉碎机粉碎。称取干粉100g，加入95%乙醇1000 ml，于70°C加热回流3h，重复两次。提取液收集后于40°C以下旋转蒸发至浸膏(EE)(约14.8 g)，接着加75 ml水搅拌溶解浸膏，再加入石油醚萃取3次，每次萃取石油醚用量为150 ml，萃取后收集三次石油醚萃取液，萃取液与残留水相(AQ)于40°C以下旋转蒸发至浸膏，将PE浸膏及AQ浸膏于室温下避光保存。
[0034]实施例3
制备舌状蜈蚣藻乙酸乙酯提取物(EA)
海藻样品采集后经自来水冲洗干净，置于烘箱中于30°C烘干，烘干后用粉碎机粉碎。称取干粉100g，加入95%乙醇1000ml，于70°C加热回流3h，重复两次。提取液收集后于40°C旋转蒸发至浸膏(EE)(约14.8 g)，然后加75 ml水搅拌溶解浸膏；先采用石油醚萃取3次，每次萃取石油醚用量为150 ml，除去石油醚萃取液后再加入乙酸乙酯萃取3次，每次萃取乙酸乙酯用量为150 ml，最后收集乙酸乙酯萃取液，将萃取液于40°C旋转蒸发至浸膏(EA)，于室温下避光保存。
[0035]实施例4
制备舌状蜈蚣藻正丁醇提取物(BuOH)
海藻样品采集后经自来水冲洗干净，置于烘箱中于40°C烘干，烘干后用粉碎机粉碎。称取干粉100g，加入95%乙醇1000ml，于70°C加热回流3h，重复两次。提取液收集后于40°C旋转蒸发至浸膏(EE)(约14.8 g)，然后加75 ml水搅拌溶解浸膏；先分别采用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，每次萃取石油醚和乙酸乙酯的用量为150 ml，除去石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液后再加入正丁醇萃取3次，每次萃取正丁醇的用量为150 ml，最后收集正丁醇萃取液，将萃取液于40°C旋转蒸发至浸膏(BuOH)，于室温下避光保存。
[0036]实施例5
舌状蜈蚣藻提取物清除自由基1，6- 二( 二苯基膦基)(DPPH )的作用用无水乙醇将DPPH配置成5 X 10_4 mo I/L的溶液，用70%乙醇将2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)配置成lmg/ml的溶液。用70%乙醇将实施例1_4所制备的各提取物分别配置成10 mg/ml的溶液，在不同试管中分别加入不同体积5 μ L，IOyL, 20 μ L, 40 μ L,80 μ L, 160μ L 样品液(10mg/ml)后，加入 5X1(T4 mol/L DPPH 溶液 50ul，再加入 70% 乙醇至终体积为250ul，溶液避光放置30min后于517nm处测定吸光度。平行操作三次，空白组与模型组分别用70%乙醇溶液与BHT溶液代替样品液，加入方法相同。样品自由基的清除能力表不为 DPPH(Ip) = [Acontrol-(Asample-Ablank) ]/Acontrol X 100, Asample 为各样品吸光度，Acontrol为空白吸光度(表1)。
[0037]实施例6
舌状蜈蚣藻提取物对脱氧核糖自由基的清除活性
在不同试管中分别加入不同体积3 μ L，6μ L, 12.5μ L, 25 μ L, 50 μ L, 100 μ L样品液(10mg/ml)，后加 I mM FeCl3 0.1 ml, 1.04 m M EDTA 0.1 ml, 20 m M H2O2 0.1 ml,2mM抗坏血酸0.1 ml和60 mM 2-脱氧-D-核糖0.1 ml,然后分别用50 mMol/L,pH 7.4的KH2PO4-KOH缓冲液加至1ml。然后将试管置于37°C恒温水浴锅中保持I h，取出后迅速加入2.8 (w/v,质量体积比)三氯乙酸I mL和质量比为1%的硫代巴比妥酸(1%溶解于50 m MNaOH) lmL，在沸水加热15min后取出，冷却，于532nm处测定吸光度值。空白组以蒸馏水代替待测样品，同时以一定浓度的BHT做对照。按照下式计算清除率:清除率=(A对照-A样品)/A对照X 100% (表1)。
[0038]实施例7
舌状蜈蚣藻提取物在胡萝卜素-亚油酸体系的活性
取2mg0 -胡萝卜素,用氯仿定容至10ml。依次加入亚油酸0.02ml,吐温40 0.2ml,混合物于20°C放置15min后，用40°C旋转蒸发除去残留氯仿，冷却至25°C后加入氧饱和的纯净水50ml,大力旋摇Imin后成乳液状。分别加入不同体积5 μ L, 10 μ L, 20 μ L, 40 μ L,80 μ L, 160 μ L待测样品于96孔板中，再加蒸馏水使其总体积为200 μ L,再各加入IOOul乳液，置于涡旋仪上于IOOrpm涡旋Imin后放置于50°C酶标仪中，于470nm处测定第O分钟，与120分钟时的吸光度。空白组用纯净水代替样品液，模型组为BHT，所有试验重复三次。抗氧化能力表现为抑制率，计算公式为:AA%= [1-(SAO-SAt)/ (CAO-CAt)] X 100，SAO与CAO表示样品与空白组在第O分钟时的吸光度，Sat与Cat表示样品与空白组在第120分钟时的吸光度(表1)。
[0039]Table 1.舌状蜈蚣藻各部位在不同抗氧化模型中的IC50 (mg/ml)
【权利要求】
1.一种舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻提取物通过如下步骤制得: 51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液； 52.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻提取物。
2.一种舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻提取物通过如下步骤制得: 51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液； 52.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏； 53.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，再加入石油醚萃取，收集萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻提取物。
3.一种舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻提取物通过如下步骤制得: 51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液； 52.将步骤SI得到的滤 液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏； 53.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，先加入石油醚萃取，移去石油醚萃取液后再加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻提取物。
4.一种舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，所述舌状蜈蚣藻提取物通过如下步骤制得: 51.将舌状蜈蚣藻烘干及粉碎后，加入乙醇并控制温度在7(T80°C回流2~4小时，重复回流两次，收集滤液； 52.将步骤SI得到的滤液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏； 53.将步骤S2得到的浸膏加水溶解，先分别加入石油醚和乙酸乙酯萃取，分别移去石油醚和乙酸乙酯萃取液后再加入正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液在35~45°C条件下挥发溶剂至浸膏即为所述舌状蜈蚣藻提取物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，步骤SI中所述乙醇的量是干粉体积的5~10倍，所述乙醇为70%-95%体积百分比的乙醇。
6.根据权利要求2所述舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏质量的3飞倍，所述石油醚萃取的次数为2飞次，每次萃取所述石油醚的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
7.根据权利要求3所述舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏质量的3飞倍，所述石油醚萃取或乙酸乙酯萃取的次数为2飞次，每次萃取所述石油醚或乙酸乙酯的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
8.根据权利要求4所述舌状蜈蚣藻提取物，其特征在于，步骤S3中所述水的加入体积是S2所得浸膏质量的3飞倍，所述石油醚萃取、乙酸乙酯萃取或正丁醇萃取的次数为2~5次，每次萃取所述石油醚、乙酸乙酯或正丁醇的用量为所述水的加入体积的2~3倍。
9.根据权利要求1-3任一项所述舌状蜈蚣藻提取物在制备抗氧剂、抗菌剂或体外抗血吸虫剂方面的应用。
10.根据权利要求4所述舌状蜈蚣藻提取物在制备抗氧剂方面的应用。
【文档编号】A61P33/12GK103638068SQ201310498020
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】石刚刚, 陈一村, 江泽斌, 郑娇娇 申请人:汕头大学医学院