一种独活香豆素活性单体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种独活香豆素活性单体的制备方法，其特征在于包括下述工艺步骤：取独活药材粉碎，用95%的乙醇回流提取3次，减压回收95%乙醇，再对浓缩后的提取液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述的萃取液，经减压回收溶剂，制得60℃温度下测相对密度1.0-1.2的浸膏；对浸膏进行硅胶柱色谱分离，以石油醚：乙酸乙酯为100:0→5:1的混合液梯度洗脱，选取其中10:1梯度分离得到的无色结晶，即为化合物蛇床子素的结晶。本发明方法操作简单，工艺成熟，所得蛇床子素量大、纯度高、成本低，因此易于推广，并被广大阿尔茨海默病患者接受。具有广阔的临床应用前景和明显的社会经济价值。
【专利说明】一种独活香豆素活性单体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于一种中药的制备方法，具体是一种中药独活活性单体的制备方法，该单体可用于治疗阿尔茨海默病。
【背景技术】:
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)又称老年性痴呆，是中老年人常见的神经退行性疾病，主要表现为进行性记忆力减退和认知功能障碍，是当今老年医学面临的最为严峻的课题之一 [1_2]。其发病机制尚不十分清楚，目前普遍认为β淀粉样蛋白(i3-Amyloid，Ai3)沉积是病变形成和发展的主要原因。在AD脑内病灶周围聚集着大量活化的小胶质细胞，产生大量炎性介质引起炎症反应，氧化应激过强使自由基大量产生，影响了细胞的代谢与功能，导致以凋亡为主的大量神经元溃变丢失、组织萎缩，其中以基底前脑胆碱能神经元丢失最为严重，引起学习与记忆功能障碍[2_3]。传统的治疗药物包括改善胆碱能神经功能药、改善脑循环药、抗氧化药及非留体抗炎药等，都只能部分缓解症状，且副作用较重，病人难以长期服用，因而至今对该病仍无有效治疗方法[2_3]。
[0003]独活(Radix Angelicae pubescentis)是《中国药典》收载的常用祛风湿散寒药，正品为伞形科植物重齿毛当归的干燥根，主治风寒湿痹、腰膝疼痛等症。纵观历代医家对独活的记载，会发现其除具有祛风散寒的功效外，还具有调补五脏，尤善补肾，祛瘀化痰，宣通脑络之功效，是一味入阴而升阳，通补并用的防治衰老良药。作为祛风除湿类中药之首，独活相当于西医的非 甾体类抗炎药，能抑制AD脑内的免疫炎症反应保护神经组织，减轻神经元损伤；同时其通实补虚的功效还能纠正AD肾精亏虚、本虚标实之病机，调节机体的免疫机能，增强抗病能力，因此具有防治AD的中医理论基础。
[0004]现代药理研究已证实独活煎剂或浸膏具有镇静催眠、降压、抑制血小板聚集及抗肿瘤等作用，近年亦有报道独活能减轻AD模型动物脑内炎性反应和氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，改善学习与记忆能力等。但以上研究所用制剂仅限于独活水煎剂和醇提物等，其中主要药理活性部位香豆素的含量较低(最高为29.1 % )，且对其中化合物指认不清，治疗
效果欠佳[4_5]。
[0005]已知香豆素类化合物是独活的主要药理活性部位，包括蛇床子素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹乙酸乙酯、异欧前胡素等[6_7]。现有关独活香豆素提取纯化的报道较少，才谦等
[8]用超临界提取工艺纯化得到的独活总香豆素提取物，香豆素含量略大于50%，其操作工艺复杂，设备昂贵，难以推广应用；中国专利200710024862.8 “一种独活提取物的制备方法”，采用回流提取和有机溶剂萃取法制备的独活提取物，虽方法工艺简单，但重复此方法所得提取物中香豆素含量不超过30%，且成分不清、难以排除有机溶剂的残留，用于体外细胞实验效果不佳。
【发明内容】
[0006]本发明的目的，是提供一种独活香豆素活性单体。[0007]本发明的另一个目的，是提供一种独活香豆素活性单体的制备方法。
[0008]本发明的又一目的，是证明了该单体能治疗阿尔茨海默病。
[0009]采用的技术方案是:
[0010]1、一种独活香豆素活性单体，其特征在于该单体是香豆素中的蛇床子素。[0011]取纯度99%的香豆素，经LC-MS法检测分析其结构，确定所得化合物为蛇床子素(Osthole)。用于体内、体外药理实验，证实该蛇床子素对阿尔茨海默病细胞模型-A β损伤神经元有明显保护作用，且能显著改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠的学习与记忆能力，治疗效果明显优于独活水煎剂和醇提物。
[0012]2、一种独活香豆素活性单体的制备方法，包括下述工艺步骤:
[0013]取独活药材粉碎，用95% (体积百分比)乙醇回流提取3次，减压回收95%乙醇，再对浓缩后的提取液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述萃取液，经减压回收溶剂，制得60°C温度下测相对密度为1.0-1.2的浸膏。对浸膏进行硅胶柱色谱分离，以石油醚:乙酸乙酯为100: O —5:1的混合液梯度洗脱，选取其中10: I梯度分离得到的无色结晶，即为化合物蛇床子素的结晶。
[0014]本发明的优点:
[0015]用本发明方法制备的结晶的蛇床子素纯度为99.0%以上，提高了治疗阿尔茨海默病的疗效。
[0016]本发明方法操作简单，工艺成熟，所得蛇床子素量大、纯度高、成本低，因此易于推广，并被广大AD患者接受，具有广阔的临床应用前景和明显的社会经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是HPLC法对蛇床子素纯度检查示意图。
[0018]图2为样品与蛇床子素HPCC示意图。
[0019]图2中1、样品HPLC图；2、蛇床子素HPLC图；3、紫外全波长扫描匹配图。
[0020]图3为样品负离子模式，[M+H]+峰示图。
[0021]图4为神经元鉴定图。其中:绿色=NF-M+ ;蓝色=DAPI+细胞核。40倍放大。
[0022]图5、图6和图7为独活香豆素活性单体对Αβ25_35损伤神经元的保护作用示图。其中:
[0023](A)神经元形态，40Χ ； (B)MTT法检测细胞活力；(C) LDH释放量测定。##Ρ < 0.01，与正常组相比；*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01与模型组比较。
[0024]图8、图9为:独活香豆素活性单体抑制Αβ25_35$导的神经元凋亡示图，其中:
[0025](A)Hoechst33258染色，箭头所指为凋亡细胞核；(B)定量分析凋亡细胞百分率，P < 0.01与正常组相比；*P < 0.05，**P < 0.01与模型组比较。
[0026]图10为独活香豆素活性单体对AD小鼠脑内炎性细胞因子水平的影响示图。
[0027]^?<0.01，与正常组比较；#卩<0.05，呷<0.01与模型组比较；@Ρ<0.05，与吲哚美辛组比较。
【具体实施方式】
[0028]一种独活香豆素活性单体的制备方法，包括下述步骤:[0029]1.仪器与材料
[0030]UV-1100型紫外可见分光光度计(日本岛津)；BS21S型精密电子天平(德国赛多利斯天平有限公司)；RE_52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D循环水式真空泵(予华仪器公司)；Agilentl290UPLC-6520Q-T0F型质谱仪(美国Agilent公司)；Agilentl260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。柱色谱硅胶(200~300目)及薄层色谱硅胶G为青岛海洋化工厂产品；甲醇为色谱纯，水为双重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
[0031]独活药材购自安徽毫州药材市场(2012年)，由辽宁中医药大学药学院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为伞形科重齿毛当归Angelica pubescens Maxim, f.biserrataShan et Yuan的干燥根；蛇床子素对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110822-200305)。
[0032]2.提取与分离
[0033]独活干燥根2kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，减压浓缩提取液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，制得在60°C温度下测相对密度为1.0-1.1的浸膏。对浸膏进行硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(100: 0 — 5: I的不同比例)梯度洗脱，选取其中10: I梯度分离得到的无色结晶进一步检测。
[0034]3.纯度检查
[0035]3.1薄层检查将步骤2所得无色结晶体配制成2.087mg/mL的样品溶液，分别在三个展开系统内展开，以10%硫酸乙醇溶液显色。结果:得到3组单一斑点，确定为单一组分。
[0036]3.2HPLC 面积归一化法色谱条件:Diamonsil C18 (5 μ m, 200 X 4.6mm)色谱柱，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，O~30min，20%~100%甲醇；流速lmL/min ;检测波长322nm ；柱温30°C ;取经薄层检查的样品溶液，进样量30 μ I ;结果表明，26.966min时出现单峰，归一化法得该化合物纯度为99.2% (图1)。
[0037]4.结构鉴定
[0038]4.1HPLC法色谱条件同3.2项下，分别取样品和蛇床子素对照品溶液，进样量30 μ 1，比对保留时间和紫外全波长扫描特征谱图，样品和蛇床子素对照品保留时间一致，紫外全波长扫描图谱重叠(图2)，初步判断该化合物为蛇床子素。
[0039]4.2LC-MS 法色谱条件:poroshell 1205B-C18 (150 X 3.0mm 2.7micron)(p.η.683975-302)色谱柱；Gas Temp:350 °C Drying Gas:9L/min Nebulizer:35psiVcap: 4000V Fragmentor: 175V Skimmer:65V OctlRF Vpp: 750V ;流动相:乙臆-水，流速:
0.4ml/min，柱温:40°C，检测波长:302nm、322nm。结果:测得该化合物MW = 244.1172(图
3)，分子式为C15H1603，结合文献推测该结晶为蛇床子素。
[0040]5.结论
[0041]本法制得的独活活性单体化合物为蛇床子素，纯度达99%。
[0042]二、独活香豆素活性单体对A β 25_35诱导神经元损伤的保护作用
[0043]1.材料与方法
[0044]1.1动物:出生3天的乳鼠(昆明种小鼠)，购自大连医科大学实验动物中心，合格证号:SCXK (辽):2008-0002。[0045]1.2主要试剂:DMEM高糖培养基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；Α β 25_35多肽，北京博奥森生物技术有限公司；兔抗小鼠中分子量神经丝蛋白(NF-M)抗体，Stem-CellTechnologies ;FITC 标记羊抗兔 IgG, Jackson ImmunoResearch ;LDH试剂盒,南京建成生物工程研究所；DAP1、H0echst33258、多聚赖氨酸，Sigma公司；阳性对照药丹酚酸B (Sal B)，美国Sigma公司。
[0046]1.3仪器:酶标仪(MR-96A)，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；紫外可见分光光度计(UV-1800)，北京瑞利分析仪器公司；超低温冰箱(DW-86L386)，青岛海尔电器有限公司；倒置荧光显微镜(CKX41-F32FL) ,Olympus株式会社；Image J分析软件，美国NIH ;二氧化碳培养箱(BPN-150CW)，上海一恒科技有限公司。
[0047]1.4 方法:
[0048]1.4.1小鼠皮层神经元原代培养与纯化:分离新生乳鼠大脑皮层，剪碎、消化、过100 μ m细胞筛网，制备单细胞悬液；以6 X IOVmL细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，加入含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(lOOyg/mL)的DMEM高糖培养基，37°C,5% CO2培养，每3天换液I次；第5天时加入阿糖胞苷(终浓度为2.5 μ mol/L, 24h)抑制胶质细胞生长，第12天时神经元成熟，用于实验[9]。 [0049]1.4.2免疫荧光化学法鉴定神经元:用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗3次；加入 0.1% Triton X-100 通透 15min，PBS 洗 3 次；加入一抗稀释液(NF-M，I: 100)，4°C孵育过夜；次晨PBS洗3次，加入FITC标记二抗稀释液(I: 200, green)，室温孵育30min，PBS洗3次；滴加含有DAPI的封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察，Image J cell counter计数NF-M+细胞占细胞总数(DAPI+)的百分比[1°]。
[0050]1.4.3Αβ 25_35损伤神经元和独活香豆素活性单体的干预:将Αβ 25_35干粉溶于三蒸水(1000ymol/L)，37°C孵育7天成聚合态[11]。向培养神经元的96孔板中分别加入八325_35(3(^11101/1)、不同浓度独活香豆素活性单体(^11016(0、10、50、100、150、50(^8/mL)和阳性对照药丹酚酸B (Sal B)，共同孵育24h后，光镜下观察细胞形态，并用于以下检测。
[0051]1.4.4MTT法检测细胞活率:将MTT液加入96孔板中(10 μ L/孔)，37°C孵育4h，弃去含MTT的培养基，加入二甲亚砜(150 μ L/孔)，Ih后用酶标仪测定492nm处吸光度值。设空白组吸光度值为100%，其余各组与之相比得相对细胞活率[12]。
[0052]1.4.5LDH的测定:取各组细胞培养上清液，按LDH测定试剂盒说明书操作，用紫外-可见分光光度计于450nm下测定吸光度值[12]。
[0053]1.4.6Hoechst33258染色检测凋亡细胞核:各组细胞用4%多聚甲醛固定、0.1 %Triton X-100 通透后，再加入 Hoechst33258 (0.5 μ g/mL, ρΗ7.4)室温下 30min, PBS 洗涤、封片，倒置荧光显微镜观察细胞核改变[13]。Image J cell counter计数凋亡细胞百分比
[14]
O
[0054]1.4.7统计学处理:结果以均值土标准差(f 士50表示，采用SPSS15.0软件完成统计处理，各组间比较采用t检验。
[0055]2.结果
[0056]2.1神经元鉴定:原代培养至第12天时神经元呈成熟状态，免疫荧光染色结果显示NF-M+细胞数占DAPI+细胞总数90%以上(图4)。[0057]2.2独活香豆素活性单体对A β 25_35损伤神经元的保护作用
[0058]与正常组相比，经A β 25_35处理的神经元数量减少，胞体缩小，轴突缩短或消失；加入独活香豆素活性单体Osthole (100 μ g/mL)共孵育24h后神经元数量明显增多，胞体明显增大，轴突明显增长，生长状态明显好于A β25_35模型组(图5)。
[0059]MTT法检测结果显示，Aβ 25_35处理后的神经元活率明显降低(49% )，而Osthole能剂量依赖性地提高细胞活力，在100 μ g/mL时
[0060]使活率达89.8%，显著高于A β 25_35模型组(P <0.01)，与阳性对照组丹酚酸B无明显差异(90.32%)，说明Osthole对Αβ25_35损伤的神经元具有保护作用；但当其浓度高达500 μ g/mL时，细胞活率降至26.2%，说明过高浓度Osthole具有一定细胞毒性(图6)。
[0061]LDH检测结果显示，A β25_35模型组细胞LDH释放量为正常组的2倍(207% )，与Osthole共孵育使LDH水平明显下降，在100 μ g/mL时使LDH降低最明显(125% )，与模型组比较差异显著(P < 0.01)，与阳性对照药丹酚酸B组无明显差异，但500 μ g/mL时又使LDH明显升高(254% )，说明过高浓度Osthole导致神经元损害(图7)。
[0062]2.3独活香豆素活性单体抑制A β 25_35诱导的神经元凋亡
[0063]Hoechst33258染色结果显示，Αβ25_35&理后，以皱缩、明亮为特征的凋亡细胞核明显增多(27%，如箭头所指)，而与Osthole共孵育组凋亡核明显减少，其中Osthole浓度为100 μ g/mL时凋亡细胞百分率最低(17% ),说明Osthole能显著抑制A β 25_35诱导的神经元凋亡(图8，图9)。
[0064]3.结论
[0065]独活香豆素活性单体能使Αβ25_35损伤神经元的生长状态明显好转，存活率明显提高，LDH释放量和凋亡数目明显减少，有效保护损伤神经元，为临床用于AD的治疗奠定基础。
[0066]三、独活香豆素活性单体对AD动物模型的治疗作用
[0067]1.材料与方法
[0068]1.1动物模型:APP/PS1双转基因AD模型小鼠购自南京模式动物中心，携带突变的APP及PSl基因，表现了人类AD的主要病理变化，有记忆力缺失(3月龄)及老年斑(5月龄)等出现，是研究AD的理想动物模型。同种野生型C57BL/6J小鼠为正常对照组(WT)。
[0069]1.2主要试剂、药品与仪器:吲哚美辛片(国药准字H13023005)，河北亿能普药业有限公司；丹参颗粒剂(国药准字Z61021162)，陕西奥星制药有限公司；IL-1、IL-6、TNF-a Elisa试剂盒，美国R&D公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；H0echst33258，美国Sigma公司；酶标仪(MR-96A)，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；超低温冰箱(DW-86L386)，青岛海尔电器有限公司；倒置荧光显微镜(CKX41-F32FL)，Olympus株式会社；Image J分析软件，美国NIH ;M0rris水迷宫仪，成都仪器厂。独活醇提物(2kg独活干燥根，粉碎后用95%乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，减压浓缩提取液至含生药1.5g/ml)。
[0070]1.3 方法:
[0071]1.3.1AD模型小鼠分组及给药取7月龄APP/PS1双转基因AD小鼠，随机分为TCA治疗组、阳性药对照组和模型对照组，10只/组，治疗组分别灌胃高、中、低剂量独活香豆素活性单体Osthole (25、50、100mg/kg);独活醇提物组每日灌服12ml/kg体重(相当含生药18g/kg) [15];阳性对照组分别灌胃丹参(5mg/kg)、吲哚美辛(20mg/kg)，根据成人临床用量换算为小鼠等效剂量；模型对照组灌胃等量生理盐水。每日给药一次，连续给药6周。另取同种野生型C57BL/6J小鼠15只为正常对照组(WT)，不予任何处理。
[0072]1.3.2Morris水迷宫实验用于测量AD小鼠的学习和记忆能力。实验系统由水迷宫装置、图像自动采集和处理分析系统组成。水迷宫池分为四个象限，每天在4个象限各训练I次，训练时将小鼠从任一象限1/2弧度处面向池壁轻放于水中，其游泳图像经拍摄系统采集、分析，可提供潜伏期(即从入水点找到平台所用时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期和游泳路径作为衡量学习和记忆能力的指标，潜伏期和游泳路径越短，说明小鼠的学习、记忆能力越强。于治疗后第5周末开始连续训练，连续7d，以第7d成绩作为测试成绩。
[0073]1.3.3AD脑内相关炎症介质、抗氧化指标及胆碱酯酶活力的检测治疗6周后处死小鼠，每只小鼠各取一半脑组织，称重、匀浆、离心后取上清液，按试剂盒操作说明书进行以下检测:①相关炎症介质IL-l、IL-6、TNF-a含量测定(美国R&D Elisa Kit);②脑组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及胆碱酯酶(AChE)活力测定。
[0074]1.3.4AD脑内神经细胞凋亡的检测治疗6周后取各组小鼠的另一半脑组织，，制成冰冻切片，用H0echst33258染色、倒置荧光显微检测脑内海马区凋亡细胞核数目，Image Jcell counter计数凋亡细胞百分比 (方法同第二部分)。
[0075]通过以上研究揭示独活香豆素活性单体Osthole抑制AD免疫炎症损伤、改善胆碱能神经功能、抑制神经细胞凋亡的作用与机制。
[0076]1.3.5统计学处理实验数据以均数土标准差土 S)表示，组间比较采用t检验，
多组间比较采用方差分析。
[0077]2.结果
[0078]2.1独活香豆素活性单体改善AD小鼠的学习和记忆能力
[0079]经过6天Morris水迷宫检测训练后，第7天测试结果显示，模型组小鼠的潜伏期和游泳路径明显长于正常组(P < 0.05)，说明AD小鼠的学习和记忆能力显著下降；而独活香豆素活性单体Osthole中、高剂量治疗6周后使其潜伏期和游泳路径明显缩短，与模型组比较差异显著(P < 0.05)，但仍长于正常组，说明Osthole能使AD小鼠的学习和记忆能力明显提高，但尚未完全恢到正常水平，恢复程度与吲哚美辛组相似，强于独活醇提物组和丹参组。见表1、2。
[0080]表1 AD小鼠给药前后潜伏期的变化s)
[0081]
【权利要求】
1.一种独活香豆素活性单体，其特征在于该单体为香豆素中的蛇床子素。
2.一种独活香豆素活性单体的制备方法，其特征在于包括下述工艺步骤: 取独活药材粉碎，用体积百分比为95%的乙醇回流提取3次，减压回收95%乙醇，再对浓缩后的提取液依次用溶剂石油醚和乙酸乙酯萃取得到萃取液，合并上述萃取液，经减压回收溶剂，制得60°C温度下测相对密度为1.0-1.2的浸膏；对浸膏进行硅胶柱色谱分离，以石油醚:乙酸乙酯为100:0 — 5:1的混合液梯度洗脱，选取其中10:1梯度分离得到的无色结晶，即为化合物蛇床子素的结晶。
3.如权利要求2所述的一种独活香豆素活性单体的制备方法，其特征在于用该方法制备的香豆素单体能治疗阿尔茨海默病。
【文档编号】A61P25/28GK103709134SQ201310568116
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】杨静娴 申请人:辽宁中医药大学