一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，该方法以白芸豆为原料，将白芸豆粉碎后通过微波-复合酶耦合处理将白芸豆中α-淀粉酶抑制剂加速从白芸豆粉中溶解析出，同时微波-复合酶耦合催化水解只需短短几十分钟可一步将白芸豆中脂肪、蛋白质、糖类等杂质通过酶水解去除，使粗提取物中α-淀粉酶抑制剂的纯度远高于一般的粗提方法，再经超滤、离子柱层析精制可得纯的、高活性的α-淀粉酶抑制剂，本发明提取条件温和，以水为溶剂，保证产品的纯天然，且微波-复合酶法耦合提取大大缩短提取纯产品的时间，产品的抑制活性达到90%以上，可为促进国内降糖、减肥市场的开拓提供基础原料。
【专利说明】—种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于α -淀粉酶抑制剂【技术领域】，特别是涉及一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002]肥胖症发病率伴随着人们生活水平的不断提高以及饮食结构的不尽合理而逐年攀升，并与爱滋病、毒麻药瘾和酒癖，并列为世界四大医学社会问题，严重威胁人类健康。当今国内外普遍关注的热点是如何采取有效措施，科学地预防和治疗肥胖。肥胖不但影响体态和活动，而且易并发高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、高血压、糖尿病、脂肪肝、痛风、胆囊炎及致抵抗力低下等。中国目前减肥保健品年销售额己达210亿元，每年以15%至35%的速度增长，明显高于发达国家7%至10%的增长速度。同时，糖尿病的发病率也每年逐步攀升，糖尿病辅助治疗药物具有极大的开拓市场，因此呈几何数增长的减肥产品市场和糖尿病辅助治疗药物市场将极大地刺激其生产厂商的胃口。
[0003]α -淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂，它通制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，选择性地减少糖分摄取，从而起到减低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高，可以有效地配合糖尿病人的饮食治疗。对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道的排空，增加脂肪的消耗以减少体重。因此，α -淀粉酶抑制剂可以作为防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等疾病的有效药物。近年来α-淀粉酶抑制剂成为各国学者研究的热点，目前已经从小麦、豆类、野生苋属等植物种子中分离得到α-淀粉酶抑制剂，其中从白芸豆中提取一种天然、无副作用α-淀粉酶抑制剂活性较高，国外已将其作为减肥保健食品和治疗糖尿病的药物进行应用，而我国在这方面的研究开发较晚，大量的资源还未得到开发利用。白芸豆是世界各国常见的一种食用豆，在我国各省、区均有种植。白芸豆不仅营养价值丰富，而且具有很高的药用和保健价值，是我国传统的药食同源食品。
[0004]现有技术中，从白芸豆中提取α -淀粉酶抑制剂的方法大多耗时长，且α -淀粉酶抑制剂的纯度和活性不高，因此开发一种从白芸豆中快速、安全提取纯天然、纯的、高活性α -淀粉酶抑制剂的方法可以促进国内农产品资源的还发利用，同时促进国内降糖、减肥市场的开拓，具有较好的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，该方法简单、耗时短、制备的产品是纯品且活性高。
[0006]本发明所要解决的技术问题可以通过如下技术方案来实现:一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，含以下步骤:将白芸豆粉碎后先利用微波-复合酶耦合催化水解进行粗提取，再经超滤、柱层析精制工序处理得到纯的、高活性的α-淀粉酶抑制剂。
[0007]本发明上述利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α -淀粉酶抑制剂的方法，优选具体含以下步骤:
(1)粗提取将白芸豆低温粉碎，加水调PH值后，再加入糖化酶和纤维素酶混匀，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解，水解后待温度降至室温调整好pH，加入木瓜蛋白酶和脂肪酶，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解，水解后将酶解液进行灭酶处理；或将白芸豆低温粉碎，加水调PH值后，再加入木瓜蛋白酶和脂肪酶混匀，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解，水解后待温度降至室温调整好pH，加入糖化酶和纤维素酶，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解，水解后将酶解液进行灭酶处理；
(2)精制将灭酶处理后的酶解液离心，取上清液用超滤膜超滤后取截留物经离子柱层析，洗脱液洗脱收集活性洗脱峰，将活性成分经超滤膜过滤后浓缩、干燥得纯的、高活性的α-淀粉酶抑制剂。
[0008]上述利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α -淀粉酶抑制剂的方法中:
步骤(1)中水的用量优选为白芸豆总重量的10-20倍。
[0009]步骤(1)中糖化酶和纤维素酶的添加量优选为白芸豆总重量的0.3-1.5%，其中糖化酶和纤维素酶的质量比优选为10-20:1 ;木瓜蛋白酶和脂肪酶的添加量优选为白芸豆总重量的0.2-0.8%，其 中木瓜蛋白酶和脂肪酶的质量比优选为1-5:1。
[0010]步骤(1)中微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解时微波辐射的功率优选为200-1000W，温度优选为40-60°C，反应时间优选为10_60min ;微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶催化水解时微波辐射的功率优选为200-1000W，温度优选为30-55°C，反应时间优选为 10-40min。
[0011]本发明方法采用微波-复合酶耦合催化酶解，作用有两点，第一是在微波作用下可加速将α-淀粉酶抑制剂从白芸豆粉中溶解析出，而传统水浸泡让α-淀粉酶抑制剂从白芸豆粉中溶解析出至少要24h，所以，在微波作用下酶解可以大大加速这个过程，第二是采用水浴进行酶水解，酶解需要几个小时，酶解效率较低，而微波代替水浴可催化酶快速水解，可极大程度地缩短酶解时间，提高酶解效率，并且可以控制水解程度，只需短短几十分钟可一步能将白芸豆中蛋白质、脂肪和糖类等杂质通过酶水解去除；这样在两次微波-复合酶耦合催化水解下即可以促进α-淀粉酶抑制剂从白豆中析出又可以快速的将α-淀粉酶抑制剂中的糖类、蛋白质、脂肪等大分子物质去除，提高粗产品的纯度。
[0012]其中两种复合酶添加的顺序可以调换，添加顺序改变则水解的条件也相应改变。
[0013]步骤(1)中加水调pH值至4.0-4.8后，再加入糖化酶和纤维素酶混匀，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶催化水解；水解后待温度降至室温后调整好PH至6.0-7.0,加入木瓜蛋白酶和脂肪酶，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶催化水解；或步骤(1)中加水调PH值至6.0-7.0后，再加入木瓜蛋白酶和脂肪酶混匀，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解；水解后待温度降至室温后调整好PH至4.0-4.8，加入糖化酶和纤维素酶，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解。
[0014]步骤(1)中将酶解液优选在60-80°C进行灭酶处理为20min-60min。
[0015]步骤(2)中离子柱层析优选为葡萄糖凝胶柱层析、CM-纤维柱层析、DEAE-纤维柱层析或DEAE-琼脂糖柱层析。
[0016]步骤(2)中α -淀粉酶抑制剂的活性为90%以上。
[0017]与现有技术相比，本发明具有如下优点: (1)本发明以白芸豆为原料，利用微波-复合酶耦合提取法在微波作用下可加速将α -淀粉酶抑制剂从白芸豆粉中溶解析出，同时微波辐射可以催化酶快速水解，只需短短几十分钟可一步能将白芸豆中脂肪、蛋白质、糖类等杂质通过酶水解去除，从白芸豆中提取α -淀粉酶抑制剂的时间大大缩短，且使粗提取物中α -淀粉酶抑制剂的纯度远高于一般的粗提方法(如水浸提、有机溶剂浸提等)，而且此过程条件温和，使α -淀粉酶抑制剂的活性很好的保留下来；
(2)本发明整个提取过程中条件温和、提取溶剂为水，确保α-淀粉酶抑制剂纯天然、无污染；
(3)本发明通过微波-复合酶耦合法可快速从白芸豆中提取纯的α-淀粉酶抑制剂，抑制活性达90%以上，为促进国内降糖、减肥市场的开拓提供基础原料。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例1中的白芸豆提取物的SDS-PAGE电泳图，其中A图为SDS-PAGE电泳糖染色；Β图为SDS-PEAG电泳蛋白染色，Μ.标准分子量蛋白，I为白芸豆提取物；2为标准品。
【具体实施方式】
[0019]以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明，以下采用的原料和试剂，如无特殊指明，均为市售。
[0020]实施例1
本实施例提供的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，含以下步骤:
粗提取:取白芸豆1000g低温粉碎，按照1:15 (质量比，下同)比例加入水调其pH至
4.5，再加入白芸豆总重量0.6%的糖化酶和纤维素酶(糖化酶:纤维素酶=10:1，质量比，下同)置于700W、55°C的微波辐射下反应30min，待温度降为室温调其pH值为6.5，再加入白芸豆总重量0.3%的木瓜蛋白酶和脂肪酶(木瓜蛋白酶:脂肪酶=2:1，质量比，下同)置于700W、50°C的微波辐射下反应20min，然后将酶解液在70°C灭酶30min ；
精制:灭酶后的滤液离心，上清液用超滤膜超滤，其膜上面的截留液经DEAE-纤维素离子柱层析，用0.025mol/L (ρΗ4.5)的醋酸-醋酸钠缓冲液(可含0-0.3mol/L NaCl)以洗脱流速lmL/min，梯度洗脱，收集活性蛋白峰，其活性洗脱液经超滤膜过滤后浓缩、干燥后的α -淀粉酶抑制剂。
[0021]其中梯度洗脱过程采用传统方法，具体过程优选为:用浓度为0.025mol/L pH4.5的HAc-NaAc缓冲液进行梯度洗脱，洗脱流速为I mL/min，每管3mL收集洗脱液，逐管检测A280 (波长为280nm下的紫外吸光度)和a_淀粉酶抑制活性，以管数为横坐标，每管的A28tl和a_淀粉酶抑制活性为纵坐标绘制曲线，洗脱液蛋白峰与抑制活性峰重合的活性洗脱液就是洗脱下来的活性成分，一般只收集抑制率大于50%洗脱液，下同。[0022]将α -淀粉酶抑制剂进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图1所示，从图1中可以看出，α-淀粉酶抑制剂经SDS-PAGE电泳后，分别经蛋白质及多糖染色，均得到单一的谱带且蛋白谱带与多糖谱带迁移率相同，说明本发明的方法得到结构均一的纯产品。经DNS法检测α -淀粉酶抑制剂的抑制活性约为90.4%。
[0023]产品的纯度和抑制活性的检测采用传统方法，具体过程如下:采用10%SDS_PAGE电泳，其中蛋白质用考马斯亮蓝法，糖染色用麝香草酚法，进行产品的确定和产品纯度的检测。α -淀粉酶抑制剂的活性测定采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法进行。具体为:100μ?，lmg/mL的a-淀粉酶与ΙΟΟμ? α -淀粉酶抑制剂在37°C下保温lOmin，然后加入ΙΟΟμ?的1%的可溶性淀粉(用含20mM NaCl,0.2mM CaCl2, pH6.0的磷酸缓冲液配置)，37°C下反应IOmin,加入5mL 3，5-二硝基水杨酸显色剂,沸水浴IOmin终止反应,最后用蒸懼水定容至IOmL,于540nm处测定光吸收值。以不加a_淀粉酶抑制剂的样品作为对照。α -淀粉酶抑制剂的抑制率(抑制活性)(％)= ((A对照-A样品)/A对照)XlOO0
[0024]实施例2
粗提取:取白芸豆1000g低温粉碎，按照1:20比例加入水调其pH至4.5，再加入0.6%糖化酶和纤维素酶(糖化酶:纤维素酶=15:1)置于700W、55°C的微波辐射下反应20min，待温度降为室温调其pH值为6.5，再加入0.3%木瓜蛋白酶和脂肪酶(木瓜蛋白酶:脂肪酶=2:1)置于600W、50°C的微波辐射下反应30min，然后在70°C灭酶30min ；
精制:灭酶后的滤液离心，上清液用超滤膜超滤，其膜上面的截留液经CM-纤维素离子柱层析，用0.02511101/1(?!14.5)的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-1.0 mo I/L NaCl)以洗脱流速lmL/min,梯度洗脱，收集活性蛋白峰，其活性洗脱液经超滤膜过滤后浓缩、干燥后的α _淀粉酶抑制剂。
[0025]将α -淀粉酶抑制剂进行SDS-PAGE电泳，分别经蛋白质及多糖染色，均得到单一的谱带且蛋白谱带与多糖谱带迁移率相同，说明本发明的方法得到结构均一的纯产品。经DNS法检测α -淀粉酶抑制剂的抑制活性约为90.8%。
[0026]实施例3
粗提取:取白芸豆1000g低温粉碎，按照1:15比例加入水调其pH至4.5，再加入1.0%糖化酶和纤维素酶(糖化酶:纤维素酶=18:1)置于700W、5(TC的微波辐射下反应30min，待温度降为室温调其pH值为6.5，再加入0.3%木瓜蛋白酶和脂肪酶(木瓜蛋白酶:脂肪酶=4:1)置于700W、55°C的微波辐射下反应30min，然后在70°C灭酶30min ；
精制:灭酶后的滤液离心，上清液用超滤膜超滤，其膜上面的截留液经S^hadex G-75凝胶柱层析，用0.025mol/L (ρΗ4.5)的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-0.3 mo I/L NaCl)以洗脱流速lmL/min，梯度洗脱，收集活性蛋白峰。其活性洗脱液经超滤膜过滤后浓缩、干燥后的α -淀粉酶抑制剂。
[0027]将α-淀粉酶抑制剂进行SDS-PAGE电泳，分别经蛋白质及多糖染色，均得到单一的谱带且蛋白谱带与多糖谱带迁移率相同，说明本发明的方法得到结构均一的纯产品，α -淀粉酶抑制剂的活性测定采用3，5- 二硝基水杨酸(DNS)方法进行，经检测α -淀粉酶抑制剂的抑制活性约为91.4%。
[0028]实施例4
粗提取:取白芸豆1000g低温粉碎，按照1:15比例加入水调其pH至4.5，再加入0.5%糖化酶和纤维素酶(糖化酶:纤维素酶=12:1)置于700W、60°C的微波辐射下反应30min，待温度降为室温调其pH值为6.5，再加入0.3%木瓜蛋白酶和脂肪酶(木瓜蛋白酶:脂肪酶=2:1)置于700W、55°C的微波辐射下反应50min，然后在70°C灭酶30min ；
精制:灭酶后的滤液离心，上清液用超滤膜超滤，其膜上面的截留液经DEAE-Sephadex柱层析，用0.02511101/1(?!14.5)的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-0.3 mo I/L NaCl)以洗脱流速lmL/min，梯度洗脱，收集活性蛋白峰，其活性洗脱液经超滤膜过滤后浓缩、干燥后的α-淀粉酶抑制剂。
[0029]将α -淀粉酶抑制剂进行SDS-PAGE电泳，分别经蛋白质及多糖染色，均得到单一的谱带且蛋白谱带与多糖谱带迁移率相同，说明本发明的方法得到结构均一的纯产品。经DNS法检测α -淀粉酶抑制剂的抑制活性约为90.2%。
[0030]实施例5
粗提取:取白芸豆1000g低温粉碎，按照1:18比例加入水调其pH至6.5，再加入
0.8%木瓜蛋白酶和脂肪酶(木瓜蛋白酶:脂肪酶=3:1)置于500W、45°C的微波辐射下反应30min，待温度降为室温调其pH值为4.6，再加入1.0 %糖化酶和纤维素酶(糖化酶:纤维素酶=12:1)置于500W、50°C的微波辐射下反应40min，然后在80°C灭酶20min ；
精制:灭酶后的滤液离心，上清液用超滤膜超滤，其膜上面的截留液经DEAE-Sephadex柱层析，用0.025mol/L(pH4.5)的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-0.3 mo I/L NaCl)以洗脱流速lmL/min，梯度洗脱，收集活性蛋白峰，其活性洗脱液经超滤膜过滤后浓缩、干燥后的α-淀粉酶抑制剂。
[0031]将α -淀粉酶抑制剂进行SDS-PAGE电泳，分别经蛋白质及多糖染色，均得到单一的谱带且蛋白谱带与多糖谱带`迁移率相同，说明本发明的方法得到结构均一的纯产品。经DNS法检测α -淀粉酶抑制剂的抑制活性约为90.2%。
[0032]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是含以下步骤:将白芸豆粉碎后先利用微波-复合酶耦合催化水解进行粗提取，再经含超滤、柱层析精制工序处理得到纯的、高活性的α-淀粉酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是具体含以下步骤: (1)粗提取将白芸豆低温粉碎，加水调PH值后，再加入糖化酶和纤维素酶混匀，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解，水解后待温度降至室温调整好PH，加入木瓜蛋白酶和脂肪酶，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解，水解后将酶解液进行灭酶处理；或将白芸豆低温粉碎，加水调PH值后，再加入木瓜蛋白酶和脂肪酶混匀，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解，水解后待温度降至室温调整好pH，加入糖化酶和纤维素酶，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解，水解后将酶解液进行灭酶处理； (2)精制将灭酶处理后的酶解液离心，取上清液用超滤膜超滤后取截留物经离子柱层析，洗脱液洗脱收集活性洗脱峰，将活性成分经超滤膜过滤后浓缩、干燥得纯的、高活性的α-淀粉酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(1)中水的用量为白芸豆总重量的10-20倍。
4.根据权利要求2所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(1)中糖化酶和纤维素酶的添加量为白芸豆总重量的0.3-1.5%，其中糖化酶和纤维素酶的质量比为10-20:1 ;木瓜蛋白酶和脂肪酶的添加量为白芸豆总重量的0.2-0.8%，其中木瓜蛋白酶和脂肪酶的质量比为1-5:1。
5.根据权利要求2 所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(1)中微波-糖化酶和纤维素酶复合酶催化水解时微波辐射的功率为200-1000W，温度为40-60°C，反应时间为10_60min ;微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶催化水解时微波辐射的功率为200-1000W，温度为30-55°C，反应时间为10_40min。
6.根据权利要求2所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(1)中加水调PH值至4.0-4.8后，再加入糖化酶和纤维素酶混匀，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解；水解后待温度降至室温后调整好PH至6.0-7.0，加入木瓜蛋白酶和脂肪酶，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解；或步骤(1)中加水调PH值至6.0-7.0后，再加入木瓜蛋白酶和脂肪酶混匀，进行微波-木瓜蛋白酶和脂肪酶复合酶耦合催化水解；水解后待温度降至室温后调整好PH至4.0-4.8，加入糖化酶和纤维素酶，进行微波-糖化酶和纤维素酶复合酶耦合催化水解。
7.根据权利要求1所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(1)中将酶解液在60°C _80°C摄氏度进行灭酶处理20min-60min。
8.根据权利要求1所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(2)中离子柱层析为葡萄糖凝胶柱层析、CM-纤维柱层析、DEAE-纤维柱层析或DEAE-琼脂糖柱层析。
9.根据权利要求1所述的利用微波-复合酶耦合法从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征是:步骤(2)中α -淀粉酶抑制剂的活性为90%以上。
【文档编号】A61P3/06GK103638089SQ201310620780
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】寇秀颖, 袁娟, 卫娜, 张素娟, 骆海平 申请人:广东省食品工业研究所