Ang2结合分子的制作方法

Ang2结合分子的制作方法
【专利摘要】Ang2结合分子，优选Ang2结合免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体，包含它们的药物组合物，及其在治疗与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病中的用途。编码Ang2结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。
【专利说明】ANG2结合分子 发明领域
[0001] 本发明涉及人的治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合 物。
[0002] 发明背景
[0003] 如 US 2008/0014196、TO 2008101985 和 US 2011/0027286 中所述，血管生成是借 以形成新血管的生物学过程，且涉及包括实体瘤和转移以及眼病在内的多种疾病的发病机 制。当肿瘤达到约Imm3的临界大小时，它们变得依赖于血管生成以保持氧气和营养物的血 液供应以便进一步生长。抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。
[0004] -种最为重要的促血管生成因子是促血管生成素2(Ang2)，Tie2受体（Tie2)的一 种配体，其通过使其他的血管生成因子（如VEGF)能够发挥功能来调控血管重构。在本领 域中，Ang2还被称为Tie2配体（美国专利号5, 643, 755, Yancopoulos等人? 2000, Nature 407 :242-248) 〇
[0005] Ang2主要由内皮细胞表达，由缺氧和其他血管生成因子强烈诱导，并已证明其调 节肿瘤血管的可塑性，使血管能够应答VEGF和FGF2(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年3月；10(3): 165-77)。与该作用相一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成 减少（Falc6n等人，Am J Pathol. 2009年11月；175 (5) :2159-70)。已经报道患有结肠直 肠癌（CRC)、非小细胞肺癌（NSCLC)和黑素瘤的患者具有升高的Ang2血清浓度（Goede等 人，& J Cancer. 2010 年 10 月 26 日；103 (9) : 1407-14) (Park 等人，Chest. 2007 年 7 月； 132 (1):200-6) (Helfrich 等人，Clin Cancer Res. 2009 年 2 月 15 日；15 (4) :1384-92)。在 CRC癌症中，Ang2血清水平与抗VEGF治疗的治疗应答相关。
[0006] Ang-Tie系统由2个受体（Tiel和Tie2)和3个配体（Angl、Ang2和Ang4)组成 (Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77) oTieS'Angl 和 Ang2 是这个家族中得到最好研究的成员，Tiel是一个孤儿受体而Ang4对血管重构的作用仍然 需要明确。Ang2和Angl在Tie2的结合和活化中介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化 导致内皮细胞活化、周细胞解离、血管渗漏和诱导血管萌芽。与Ang2相反，Angl信号传导 通过募集周细胞维持血管完整性，从而保持内皮细胞静止。
[0007] 促血管生成素2(Ang2)是一种分泌的、66kDa的Tie2受体酪氨酸激酶的配体 (Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77)。Ang2 由 N-末端 卷曲螺旋域和C-末端的纤维蛋白原样域组成，后者是与Tie2相互作用需要的。Ang2主要 由内皮细胞表达并由缺氧和其他血管生成因子（包括VEGF)强烈诱导。Tie2存在于内皮 细胞、造血干细胞和肿瘤细胞上。已经证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答 VEGF 和 FGF2。
[0008] 在体外已经表明Ang2在人脐静脉内皮细胞（HUVEC)中充当温和的有丝分裂原、趋 化吸引剂（chemoattractant)和管形成的诱导物。Ang2诱导成纤维细胞中异位表达的Tie2 的酪氨酸磷酸化，并促进下游信号传导事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。 已经描述了 Ang2在Angl诱导的内皮细胞应答中的拮抗作用。
[0009] 已经表明Ang2缺乏导致了小鼠中严重的淋巴模式（lymphatic patterning)缺 陷。虽然Ang2丧失不是胚胎血管发育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在视网膜和肾脏中具 有持久性血管缺陷。结合在血管生成部位（例如卵巢）的Ang2表达的动态模式，这些结果 表明Ang2通过使其他的血管生成因子（如VEGF)能够发挥功能而调控血管重构。
[0010] Ang2_Tie2系统在血管生成开关和肿瘤血管生成后期阶段中发挥至关重要的作 用。在肿瘤相关的内皮中Ang2的表达强烈上调。当肿瘤植入Ang2缺陷小鼠，特别是在肿 瘤生长的早期阶段植入时，观察到了肿瘤生长减少。使用Ang2单克隆抗体治疗性阻断Ang2 已经在各种肿瘤异种移植模型中显示出广泛的疗效。
[0011] 如上述美国2008/0014196中所概述，血管生成牵涉于包括实体瘤及转移的多种 疾病的发病机制中。
[0012] 在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为新生肿瘤及对于为肿瘤生长及 转移提供营养似乎是至关重要的（Folkman等人，Nature 339-58 (1989))，这使得肿瘤细胞 相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选 择。这些治疗集中于阻断VEGF途径（Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov. 2004年5月； 3(5) :391-400)。
[0013] 结合Ang2和Angl的抗体及其它肽抑制剂在例如美国专利号6, 166, 185 ; 7, 521，053 ;7, 205, 275 ;和美国专利申请号 2006/0018909 和 2006/0246071 中被提及。此 夕卜，美国2011/0027286公开了不拮抗相关分子Angl的特异性单克隆Ang2抗体。
[0014] 然而，现有技术的单克隆抗体（Mb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点： 为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以 其不适于口服给药。Mb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度低且不能靶 向于肿瘤中的所有细胞。
[0015] 本发明的一个目的在于提供新的改良的Ang2结合分子，即阻断Ang2与Tie2结合 却不阻断Angl与Tie2结合的纳米抗体。
[0016] 更具体地，本发明的目的在于提供新的Ang2结合分子，且具体是结合哺乳动物 Ang2而不结合哺乳动物Angl的Ang2结合分子,且特别是结合人Ang2而不结合人Angl的 Ang2i结核分子，其中此类分子或多肽适用于如本文所述的治疗和诊断目的。本发明的另一 目的是提供特异性结合Ang2而不结合Angl的免疫球蛋白单一可变域。
[0017] 此类Ang2结合分子或Ang2拮抗剂可用作预防、治疗、缓解和/或诊断与Ang2介 导的对血管生成的作用相关的疾病或状况的组合物中的药理学活性剂。
[0018] 此类疾病的实例是癌症或癌性疾病，例如乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌和胰腺癌，眼 病例如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变，和/或慢性肾病例如糖尿病肾病、肾 后性肾衰、肾前性氮质血症和内在肾功能衰竭。
[0019] 本发明的另一个目的在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或病状 的方法，其涉及使用和/或给予这些Ang2结合分子及包含这些Ang2结合分子的组合物。具 体地，本发明的一个目的在于提供这种药理学活性的Ang2结合分子、组合物和/或方法，其 相比于当前使用的和/或本领域中已知的药剂、组合物和/或方法体现出优势。这些优势 包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利的性质例如对于制造目的而言有利 的性质，尤其是与如上所述的常规抗体或其片段相比。
[0020] 发明概述
[0021] 根据第一方面，本发明提供了一种包含免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子， 其中所述免疫球蛋白单一可变域包含三个互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3,其中⑶Rl具有选 自SEQ ID NO: 168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有选自SEQ ID No: 171 至173中所示氨基酸序列的氨基酸序列且⑶R3具有选自SEQ ID NO: 174至177中所示氨 基酸序列的氨基酸。
[0022] 本发明还涉及由所述免疫球蛋白单一可变域组成的Ang2结合分子。
[0023] 此外，本发明涉及具有选自由SEQ ID No:167、166、129和138组成的组的序列的 Ang2结合分子。
[0024] 根据另一方面，本发明提供了编码所述Ang2结合分子的核酸以及包含所述核酸 的表达载体。
[0025] 本发明还涉及携带携带一种或多种包含所述核酸的表达载体的宿主细胞。
[0026] 本发明还涉及产生或生成根据本发明的Ang2结合分子的方法，所述方法包括以 下步骤：
[0027] (a)用一种或多种包含所述核酸分子的所述载体转染宿主细胞，
[0028] (b)培养所述宿主细胞，以及
[0029] (c)回收并纯化所述Ang2结合分子。
[0030] 本发明的另一方面涉及包含作为活性成分的一种或多种所述Ang2结合分子以及 至少生理学上可接受的载体的药物组合物。
[0031] 本发明还涉及本文所述的Ang2结合分子、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用 及用途，以及涉及用于预防和/或治疗与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病（优选 癌症、癌性疾病和眼病）的方法。
[0032] 本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明 确。
[0033] 定义
[0034] 除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义 对于本领域技术人员而言是清楚的。参考例如标准手册，如Sambrook等人，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual，'（第 2 版），第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ;Lewin, "Genes IV"，Oxford University Press,New York, (1990);及 Roitt 等人，"Immunology"（第 2 版），Gower Medical Publishing, London，New York(1989)，以 及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技 术及操作均可以以本身已知的方式进行，该方式对于本领域技术人员而言是清楚的。还可 参考例如标准手册、上述一般背景现有技术及其中引用的其他参考文献。
[0035] 除非规定为来自非人类物种（例如"小鼠 Ang2"等），否则术语"促血管生成素2" 或"Ang2"是指人Ang2或其生物活性片段（例如可在体外或体内诱导血管生成的Ang2蛋白 的片段），即，是指登录号为匪001147. 2的人Ang2(变体1)、具有登录号NM_001118887. 1 的人Ang2(变体2)或者具有登录号NM_001118888. 1的人Ang2(变体3)，和/或它们的生 物活性片段。Ang2非人类物种，例如小鼠 Ang2和猴Ang2的氨基酸序列分别可从蛋白序列 数据库的登录号：NM_〇〇7426.3(SEQ ID NO: (SEQ ID 188)和 AB172643. 1(SEQ ID N0:187) 下获得。
[0036] 除非规定为来自非人类物种（例如"小鼠 Ang2"等），否则术语"促血管生成素1" 或"Angl"是指人Angl或其生物活性片段（例如可在体外或体内诱导血管生成的Angl蛋 白的片段），即，是指登录号为NM_〇〇l 146. 3的人Angl或其生物活性片段。
[0037] 除非另有说明，否则术语"免疫球蛋白"及"免疫球蛋白序列"在本文中无论是用 于指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其 所有部分、域或片段（分别包括但不限于抗原结合域或片段，如VHH域或VH/VL域）。此外， 本文所用的术语"序列"（例如在"免疫球蛋白序列"、"抗体序列"、"（单一）可变域序列"、 "VHH序列"或"蛋白序列"等的术语中），一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码 所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。
[0038] 如本文所用的术语（多肽或蛋白的）"域"是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白 的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的各种功能性质，且在许多情况下可添 力口、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
[0039] 如本文所用的术语"免疫球蛋白域"是指抗体链（如常规4链抗体的链或重链抗 体的链）的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在 于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个3折叠中任选由保守二硫键 稳定的约7条反平行P链的2层夹层（sandwich)组成。
[0040] 如本文所用的术语"免疫球蛋白可变域"是指基本上由本领域及下文中分别称为 "框架区1 "或" FR 1 "、"框架区2 "或" FR2 "、"框架区3 "或" FR3 "、及"框架区4 "或" FR4 " 的四个"框架区"组成的免疫球蛋白域；所述框架区被本领域及下文中分别称为"互补决 定区1"或"⑶R1"、"互补决定区2"或"⑶R2"、及"互补决定区3"或"⑶R3"的三个"互 补决定区"或"CDR"间隔。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域因具有抗原结合位点而赋予抗体对 抗原的特异性。
[0041] 如本文所用的术语"免疫球蛋白单一可变域"是指能够在不与其他免疫球蛋白可 变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球 蛋白单一可变域的一个实例为"域抗体"，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL (VH域及VL 域）。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的来自骆驼科的"VHH域"（或简称 为"丽，，）。
[0042] 鉴于以上定义，常规4链抗体（例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分 子）或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F (ab'）2片段、Fv片段（例如二硫键连接的Fv 或scFv片段）、或双特异抗体（均为本领域中已知）的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白 单一可变域，这是因为在该情况下，通常并非通过一个（单一）免疫球蛋白域与抗原的各别 表位发生结合，而是通过共同结合各别抗原表位的一对（缔合）免疫球蛋白域（例如轻链 及重链可变域），即通过免疫球蛋白域的VH-VL对发生结合。
[0043] "VHH域"，也称为VHH、VhH域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为"重链抗 体"（即"缺乏轻链的抗体"）的抗原结合免疫球蛋白（可变）域（Hamers-Casterman C， Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R. : "Naturally occurring antibodies devoid of light chains" ；Nature 363， 446-448 (1993))。已选择术语"VHH域"从而将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重 链可变域（其在本文中称为"VH域"或"VH域"）以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域 (其在本文中称为"'域"或"VL域"）进行区分。VHH域可特异性结合表位而无其他抗原 结合域（此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识 别）。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型、鲁棒且高效的抗原识别单元。
[0044] 在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VhH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及 "Nanobody?"及"Nanobody?域"（"Nanobody" 为比利时根特 Ablynx N. V?公司的商 标）可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域（具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 结构且特异性结合表位无需存在第二免疫球蛋白可变域），且其通过例如WO 2009/109635 图1中定义的所谓"印记残基（hallmark residue)"区别于VH域。
[0045] 如例如 Riechmann 及 Muyldermans，J. Immunol. Methods 231，25-38 (1999)的图 2中所示，适用于骆驼科的VHH域，根据Kabat等人给出的VJt的通用编号法（"Sequence of proteins of immunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda, MD,公开案第91号）来编号免疫球蛋白单一可变域（如VHH)的氨基酸残基。
[0046] 根据该编号法，
[0047] -FRl包含在位置1-30处的氨基酸残基，
[0048] -⑶Rl包含在位置31-35处的氨基酸残基，
[0049] -FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
[0050] -⑶R2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
[0051] -FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
[0052] -⑶R3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
[0053] -FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
[0054] 然而应注意，如本领域中对于Vh域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的 总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号法所指示的氨基酸残基的总数（即根据Kabat 编号法的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编 号所允许数目的氨基酸残基）。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对 应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
[0055] 对Vh域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本 领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上 所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
[0056] VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110-120范围内，常常介于112与115之 间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
[0057] 免疫球蛋白单一可变域，例如根据本发明优选实施方案的VHH及域抗体具有大量 使其高度有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地， 且不对其进行限制，VHH域（其已本质上经"设计"为在不与轻链可变域配对情况下功能性 地结合抗原）可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。
[0058] 由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH (或VL)，无 论是单独存在还是作为较大多肽（例如双互补位分子）的一部分，均提供许多显著优点：
[0059] ?仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个单独的 域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在（即通过使用特别设计的接头，如 scFv的接头）；
[0060] ?免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰（如 糖基化）；
[0061] ?免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式（如本文进 一步论述的）；
[0062] ?免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低固有毒性，并 且可通过输注或注射以外的替代途径给予；
[0063] ?免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因 此可在不使用制冷设备情况下制备、储存或运输；
[0064] ?免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相 对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵（例如下文进一步描述的）产生， 不需要像例如常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；
[0065] ?相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相对较小的 (约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示（更）高的组织（包括但不限于实体瘤及其他 致密组织）穿透性，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；
[0066] ? VHH具有特定的所谓"空腔结合性质"（cavity-binding properties)(尤其是 由于相比于4链抗体的VH域，其⑶R3环更为伸展），因此其也能够进入常规4链抗体及其 抗原结合片段不能进入的靶点及表位；
[0067] ? VHH具有高度可溶性和极其稳定且没有聚集趋势的特别优势（如同由Ward等 人，Nature 341:544-546 (1989)所述的小鼠源抗原结合域）。
[0068] 本发明的免疫球蛋白单一可变域，其获得的具体生物来源或具体制备方法不受限 制。例如，获得VHH可包括以下步骤：
[0069] (1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从 中分离VHH ;
[0070] (2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
[0071] (3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH "人源化"（如本文所述 的），或表达编码这类人源化VHH的核酸；
[0072] (4)使动物物种（特别是哺乳动物物种，例如人）天然存在抗体的免疫球蛋白单一 可变重域"骆驼化"（如下所述），或表达编码这类骆驼化域的核酸分子；
[0073] (5)使VH "骆驼化"，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；
[0074] (6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；
[0075] (7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；
[0076] (8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变（例如随机诱变或定点诱变）和/或 任何其他技术以增加 VHH的亲和力和/或特异性；和/或
[0077] (9)组合或选择上述步骤。
[0078] 适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所 了解。举例而言，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已经在WO 2006/040153和WO 2006/122786 中描述。
[0079] 根据具体实施方案，本发明的或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域 为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经"人源化"或 "序列优化"（任选在亲和力成熟之后），即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处 存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨 基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式 使用。
[0080] 人源化的VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个进一步更具体的 实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51的人框架区序列或其部分， 或与其高度同源，任选与JH序列（例如JH5)组合。因此，人源化方案可包含单独或组合使 用生殖系VH基因（例如DP 47、DP 29及DP 51)的相应框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残 基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区（FR)可选自那 些例如WO 2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓"KERE"及"GLEW"类型。实例为在 约位置44-47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应 物。人源化VHH域可包含一个或多个完全的人框架区序列。
[0081] 例如，属于103P，R，S组和/或GLEW组（如下文所定义）的VHH的人源化取代是 将108Q取代成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。
[0082] 在治疗应用方面具有改良的性质（例如增强的亲和力或降低的免疫原性）的结合 免疫球蛋白单一可变域，可通过如下本领域中已知的技术而从各别的结合分子获得：亲和 力成熟（例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、人源化、合并源 自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于 工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所 述的术语"序列优化"。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。
[0083] 适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和力增加的结合分子，就亲 和力成熟分子而言所述另一结合分子表示"亲本"结合分子。
[0084] 获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如WO 2006/040153及WO 2006/122786中。如其中所详述的，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中 相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多 个氨基酸残基来"人源化"（本文中也称为"序列优化"，除人源化外，"序列优化"可涵盖通 过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，如移除潜在的翻译后修饰 位点）。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一进一步更具体实施方 案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51的人框架区序列，或其部分，任选与JH序列（例如 JH5)组合。
[0085] "域抗体"，也称为 "Dab" 及"dAb"（术语"域抗体（Domain Antibodies)" 及 "dAb"被GlaxoSmithKline公司集团用作商标），已描述于例如以下文献中：Ward, E. S.， 等人："Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli，'；Nature 341: 544-546 (1989) ；Holt, L. J?等人："Domain antibodies:proteins for therapy" ；TRENDS in Biotechnology 21 (11):484-490(2003);及 TO 2003/002609。
[0086] 域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体（特别是人4链抗体）的VH或VL 域。为了以单一抗原结合域的形式（即在不与VL域或VH域分别配对的情况下）结合表位， 需要例如通过使用人单一 VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
[0087] 域抗体如VHH的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进 行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得 以表达，从而显著降低总制造成本。
[0088] 此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述⑶R "移植"于其他"支 架"（包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架）上。用于这种CDR移植的适合支架及技 术在本领域中是已知的。
[0089] 可互换使用的术语"表位"及"抗原决定簇"是指大分子（例如多肽）的一部分，其 由抗原结合分子（例如常规抗体或本发明的多肽）识别，且更具体地由所述分子的抗原结 合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。 [0090] 可"结合"或"特异性结合"某一表位、抗原或蛋白（或其至少一部分、片段或表 位）、对其"具有亲和力"和/或"具有特异性"的多肽（例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免 疫球蛋白单一可变域、或一般而言抗原结合分子或其片段）是指"对抗"或"针对"该表位、 抗原或蛋白，或为对于该表位、抗原或蛋白的"结合"分子。在上下文中，Ang2结合分子也可 称为"Ang2中和分子"。
[0091] 一般而言，术语"特异性"是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白（例如本发明的 免疫球蛋白单一可变域）分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。抗原结合分子的特异 性可基于其亲和力和/或亲抗原性（avidity)来测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡 常数（KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度： KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强（或者，亲和力也可表示为亲和力常 数（KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解（例如基于本文其他公开的内容），取决于 具体感兴趣的抗原，可以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子（如免疫 球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有免疫球蛋白单一可变域的多肽）与相关抗原 之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者均有关：表位与其抗原结合分子上的抗原结合 位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
[0092] 抗原结合分子（如本发明抗体或免疫球蛋白单一可变域）识别表位的部分称为 "互补位"。
[0093] 除非另有说明，否则术语"Ang2结合分子"包括抗Ang2抗体、抗Ang2抗体片段、 "抗Ang2抗体样分子"、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单 克隆抗体。术语"抗体"涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白（如单克 隆抗体）、以及Ang2结合抗体片段或"抗体样分子"，包括单链抗体及线型抗体，如例如描述 于TO 02/056910中的所谓的"SMIP"（ "小模块免疫药物"）。抗Ang2抗体样分子包括如本 文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体（IgSF) 或⑶R移植分子。
[0094] "Ang2结合分子"是指单价靶结合分子（即与Ang2的一个表位结合的分子） 以及含有一个以上Ang2结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子，亦称为"形式化 (formatted) "Ang2结合分子。所述形式化Ang2结合分子除Ang2结合免疫球蛋白单一可 变域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分（如白蛋白结合 免疫球蛋白单一可变域）、和/或融合配偶体（如血清白蛋白）和/或附接的聚合物（如 PEG)。
[0095] 即使是次优选的，形式化Ang2结合分子也可包含识别相同或重叠表位的两个相 同的Ang2结合免疫球蛋白单一可变域或两个不同的免疫球蛋白单一可变域。在此情况下， 所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成Ang2二聚体的两个单体中每一单体的相同或重 叠表位结合。包括竞争性ELISA分析的实验数据揭示当与单一 Ang2结合分子的个体构件 比较时，形式化Ang2二聚体的效力显著改善（数据未示出）。
[0096] 通常，本发明的Ang2结合分子将以（如于Biacore或KinExA分析中测量的）10E-5 至10E-14摩尔/升（M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升（M)或 10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且进一步更优选10E-11至10E-13 的解离常数（K d)结合，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1， 如至少10E11ME-1的缔合常数（K a)结合。任何大于10E-4M的Kd值一般都视为指示非特异性 结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于 500pM的K d结合所要结合的抗原（即Ang2)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以 以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析（Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析（例如放射免疫分析（RIA)、酶免疫分析（EIA)及夹心式 竞争性分析（sandwich competition assay)及本领域中本身已知的其不同变化形式。
[0097] 氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或单字母氨基酸码 加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语"氨基酸差异"是指相比于第二序列，在该参考序 列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选 为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残 基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨 基酸取代在本领域中是公知的，例如根据W098/49185,其中保守氨基酸取代优选是以下群 组（i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所取代：（i)较小脂族非极性 或弱极性残基4]^、561'、1111'、？1'〇及617 ;(;[;0极性带负电残基及其（不带电）酰胺：八8口、 AsruGlu及Gln ; (iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys ; (iv)较大脂族非极性残基：Met、 Leu、Ile、Val及Cys ;及（V)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：
[0098] Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代； Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或 Gln取代；IIe被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met 被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp 被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
[0099] 例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基， 当多肽或核酸分子已与至少一种在该来源或介质（培养基）中通常与之相关的其他组分分 离时，其被视为"（呈）基本上分离（的形式）"（所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一 核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分）。特别地，多肽或核酸分 子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍 以上时被视为"基本上分离的"。经适合的技术（例如适合的色谱技术，例如聚丙烯酰胺凝 胶电泳）确定，"呈基本上被分离的形式"的多肽或核酸分子优选基本上为同质的。
[0100] 术语"N端"（又称氨基端、NH2端、N-末端或胺端）是指由具有游离氨基（-NH 2)的 氨基酸终止的蛋白/多肽（即Ang2结合分子）的起点。肽序列的书写惯例是将N端放在 左边并从N端至C端进行书写。当所述蛋白翻译自信使RNA时，其从N端至C端创建。 [0101] 两个Ang2结合分子序列之间的"序列同一性"指示序列之间相同氨基酸的百分 t匕。其可如WO 2008/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。"序列相似度" 指示相同或表示保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
[0102] 对Vh域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在 本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如 上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
[0103] "亲和力成熟"的Ang2结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个⑶R中具有 一个或多个变化，所述变化导致对Ang2的亲和力相比于其各自的亲本Ang2结合分子有所 增加。本发明亲和力成熟的Ang2结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法 来制备：Marks 等人，1992，Biotechnology 10:779-783 或 Barbas 等人，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813. ;Shier 等人，1995, Gene 169:147-155;Yelton 等人，1995， Immunol. 155:1994-2004 ;Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 ;及 Hawkins 等 人，1992, J.Mol.Biol. 226(3):889896 ;KS Johnson 及 RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display"，Oxford University Press 1996。
[0104] 对于本发明，除非另有说明，则"SEQ ID NO:x的氨基酸序列"包括：与各自SEQ ID N0:x中所显示的序列100%相同的氨基酸序列；
[0105] a)与各自SEQ ID NO:X中所示序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0106] b)与各自SEQ ID NO:X中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序 列。
[0107] 术语"癌症"及"癌性"是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖 为特征的生理状况。可用本发明的Ang2结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋 巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。这些癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非 小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子 宫颈癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝癌（hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠 癌、肾细胞癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌（liver cancer)、前列腺癌、夕卜 阴癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成 的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非肿瘤性症状 及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。
[0108] 非肿瘤性病症包括但不限于不希望的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节 炎（RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病（sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化 斑块、糖尿病性及其他增生性视网膜病（包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生 (retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水 肿、角膜新血管生成（corneal neovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植 排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成（虹膜红变（rubeosis))、眼新血管 病（ocular neovascular disease))、血管再狭窄（vascular restenosis)、动静脉畸 形（arteriovenous malformations，AVM)、脊膜瘤（meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤 (angiofibroma)、甲状腺增生（包括格雷夫氏病（Grave's disease))、角膜及其他组织移 植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压（primary pulmonary hypertension)、恶性肺积液（malignant pulmonary effusion)、脑水肿（例如与急性中 风/闭锁性头部损伤（closed head injury)/外伤相关）、滑液炎症、RA中的血管翳形成 (pannus formation)、骨化性肌炎（myositis ossificans)、肥大性骨形成（hypertropic bone formation)、骨关节炎（OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病（polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症（endometriosis)、第 3 间隔体液疾病（3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征（compartment syndrome)、灼伤、肠病）、子宫纤维瘤、早产、 例如IBD(克罗恩氏病（Crohn's disease)及溃疡性结肠炎）的慢性炎症、肾同种异体移 植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不希望的或异常的组织大量生长（非癌）、血友病性关 节（hemophilic joint)、肥厚性瘢痕（hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦 伯综合征（Osier-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生（pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮病（scleroderma)、沙眼、血管黏附（vascular adhesion)、滑膜炎（synovitis)、皮炎、子痫前症（preeclampsia)、腹水症、心包积液 (pericardial effusion)(例如与心包炎（pericarditis)相关的心包积液）、及胸膜积液 (pleural effusion)〇
[0109] 术语〃眼病"是指增生性视网膜病变，包括早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、 新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管形成、角膜移 植新生血管形成、角膜移植排斥反应、视网膜/脉络膜新生血管形成。
[0110] 术语"慢性肾病"是指糖尿病肾病、肾后性肾衰竭、肾前性氮质血症和内在肾功能 衰竭。
[0111] 发明详述
[0112] 在第一方面中，本发明涉及包含免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子，其中所 述免疫球蛋白单一可变域包含三个互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3,其中⑶Rl具有选自SEQ ID NO: 168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有选自SEQ ID No: 171至173 中所示氨基酸序列的氨基酸序列且CDR3具有选自SEQ ID NO: 174至177中所示氨基酸序 列的氨基酸。
[0113] ⑶Rl具有选自以下的序列：
[0114] SEQ ID N0:168DYAIG
[0115] SEQ ID N0:169DYALG
[0116] SEQ ID N0:170YYAIG
[0117] ⑶R2具有选自以下的序列：
[0118] SEQ ID N0:171AIRSSGGSTYYADSVKG
[0119] SEQ ID N0:172CIRCSGGSTYYADSVKG
[0120] SEQ ID N0:173CISSSGGITYYADSVKG
[0121] ⑶R3具有选自以下的序列：
[0122] SEQ ID N0:174VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA
[0123] SEQ ID N0:175VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA
[0124] SEQ ID N0:176SIVPRSKLEPYEYDA
[0125] SEQ ID N0:177DSGGYIDYDCSGLGYDY
[0126] 根据优选实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中
[0127] (a)CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 174中所示的氨基酸序列，或者其中
[0128] (b)CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 175中所示的氨基酸序列，或者其中
[0129] (c)CDRl具有SEQ ID NO: 169中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 172中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 176中所示的氨基酸序列，或者其中
[0130] (d)CDRl具有SEQ ID NO: 170中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 173中 所示的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 177中所示的氨基酸序列。
[0131] 根据另一优选实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中所 述免疫球蛋白单一可变域为VHH或域抗体。
[0132] 根据又更优选的实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中 所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。
[0133] 根据具体实施方案，所述VHH由具有选自由SEQ ID No: 167、166、129和138组成 的组的序列的免疫球蛋白单一可变域组成。
[0134] 在另一方面中，本发明涉及由所述免疫球蛋白单一可变域组成的Ang2结合分子。
[0135] 根据本发明的Ang2结合物序列可在其N端被修饰（即缺失或置换第一氨基酸） 而不显著降低其结合活性。此修饰增强在细菌宿主（例如但不限于大肠杆菌）中胞内/胞 质表达期间的N端甲硫氨酸的翻译间/后切割。
[0136] 在一个方面中，由免疫球蛋白单一可变域组成的所述VHH在N端具有修饰或置换， 其中所述修饰是缺失第一氨基酸且所述置换是由另一氨基酸替代所述第一氨基酸。
[0137] 在一个优选实施方案中，N端的所述第一氨基酸是缬氨酸（V)或天冬氨酸（D)，被 例如丙氨酸（A)所替代。
[0138] 在治疗应用方面具有改良性质（例如增强的亲和力或降低的免疫原性）的Ang2 结合组分，可通过如下技术而从本发明的各别Ang2结合组分获得：亲和力成熟（例如从合 成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白 序列的片段、使用重叠引物的PCR组装，及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋 白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合。例如参考标准手册以及其他描述及 实施例。
[0139] 优选地，具有增强的亲和力的本发明的Ang2结合组分是通过另一 Ang2结合组分 的亲和力成熟来获得的，就亲和力成熟分子而言所述另一 Ang2结合组分代表"亲本"Ang2 结合组分。
[0140] 因此，在另一项优选实施方案中，本发明的Ang2结合分子是通过使上述亲本免疫 球蛋白单一可变域的亲和力成熟获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0141] 在另一项优选实施方案中，本发明涉及通过使VHH的亲和力成熟获得的免疫球蛋 白单一可变域。
[0142] 在一项优选实施方案中，本发明涉及免疫球蛋白单一可变域，其用于人源化具有 SEQ ID NO: 1、17和80中所示氨基酸序列的VHH。
[0143] 在另一优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO: 127、132和146中所 示氨基酸序列的VHH人源化而获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0144] 本发明也涉及Ang2结合分子，其通过上述定义的VHH的亲和力成熟和/或序列优 化而获得，例如涉及通过使具有SEQ ID NO: 167、166、129和138所示氨基酸序列的VHH序 列优化获得的VHH。
[0145] 在另一项更优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO: 167所示氨基酸 序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0146] 在进一步更优选的实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO: 166所示氨基 酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0147] 在另一项优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO: 129所示氨基酸序 列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0148] 在又一优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO: 138中所示氨基酸序 列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。
[0149] 在另一实施方案中，本发明或存在于本发明多肽中的代表性种类的Ang2结合免 疫球蛋白单一可变域具有对应于已经"骆驼化"的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸 序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基替代常规 4链抗体的天然存在的可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域 技术人员所了解的本身已知的方式进行，且可另外参考WO 1994/04678。这种骆驼化可优 先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓的骆驼科印记残基处（也参见例如WO 1994/04678)。这些"人源化"及"骆驼化"技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可 参见WO 2006/040153的第46页和第98页及WO 2006/122786的第107页。
[0150] 本发明的Ang2结合组分（例如免疫球蛋白单一可变域和/或含有其的多肽）对 Ang2具有特异性，因为其包含与Ang2分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个 免疫球蛋白单一可变域。
[0151] Ang2结合组分对其抗原Ang2的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方 式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析（例如放射免疫分析 (RIA)、酶免疫分析（EIA和ELISA)及夹心式竞争分析）及本领域中本身已知的其不同变化 形式来测定。
[0152] 关于抗原Ang2,本发明的Ang2结合组分（例如免疫球蛋白单一可变域）在物种方 面不受限制。因此，若欲用于人的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有其的 多肽优选结合至人Ang2。然而，结合至另一哺乳动物物种的Ang2的免疫球蛋白单一可变域 或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种的Ang2形式结合的本发明的免疫球蛋 白单一可变域，可与一个或多个其他物种的Ang2发生交叉反应。例如，结合人Ang2的本发 明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的Ang2和/或与用于 疾病动物模型（且特别是用于与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病及病症的动物 模型）（例如本文提及的物种及动物模型）中的一个或多个动物物种（例如猴（特别是食 蟹猴或恒河猴）、小鼠、大鼠、兔、猪、犬）的Ang2的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本 发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物开发中是有利的，因为其允许在公认的 疾病模型（例如猴（特别是食蟹猴或恒河猴）、或小鼠及大鼠）中对本发明的免疫球蛋白单 一可变域进行测试。
[0153] 而且,本发明的Ang2结合组分不限于其所针对的Ang2的特定域或Ang2的抗原决 定簇或不由其所针对的Ang2的特定域或Ang2的抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外 的物种（欲在治疗性Ang2拮抗剂的开发期间将该物种用作动物模型）的一种或多种Ang2 分子的交叉反应性，Ang2结合组分识别与人Ang2具有高同一'丨生的感兴趣的Ang2区域中的 表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于 FLD-域内的表位，所述 FLD-域发表在 Kim H-Z，Jung K，Kim HM，Cheng Y 和 Koh GY(2009) 中。一种经设计的促血管生成素2变体，五聚体C0MP-Ang2,强烈活化Tie2受体并刺激血管 生成。Biochim Biophys Acta 1793,772-780。
[0154] 因此，根据一项优选实施方案，本发明涉及Ang2结合组分，具体涉及免疫球蛋白 单一可变域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自与完全或部分地包含于 FLD域（SEQ ID NO: 188-190)内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域。
[0155] 优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选 小于IOnM,例如小于500pM(如通过表面等离子共振分析所测定）的亲和力结合Ang2。
[0156] 优选地，如竞争ELISA分析中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC5tl 值在KT6至KTltl摩尔/升或KTltl摩尔/升以下的范围内，更优选在KT 8至KTltl摩尔/升 或KTltl摩尔/升以下的范围内、且进一步更优选在1〇_ 9至KTltl摩尔/升或KTltl摩尔/升 以下的范围内。
[0157] 根据本发明的一个非限制性但优选的实施方案，本发明的Ang2结合免疫球蛋白 单一可变域或含有其的多肽以1〇_ 5至1〇_12摩尔/升（M)或KT12摩尔/升以下、且优选KT7 至KT12摩尔/升（M)或KT12摩尔/升以下、且更优选KT8至KT 12摩尔/升（M)或KT12摩 尔/升以下的解离常数（Kd)，和/或以至少IO 7M'优选至少IO8M'更优选至少IO9M'例如 至少IO12M- 1的缔合常数（Ka);且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例 如小于500pM的K d结合Ang2。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对Ang2的Kd及 Ka值。
[0158] 根据另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。
[0159] 存在于本发明的单特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域具有对应于已经 "骆驼化"的天然存在VH域的氨基酸序列的序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH 域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链的氨基酸序列中的 一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且可另外 参考WO 94/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆 驼科印记残基处（也参见例如W094/04678)。这些"人源化"及"骆驼化"技术及与此相符的 优选框架区序列的详述也可参见WO 2006/040153的第46页和第98页及WO 2006/122786 的第107页。
[0160] 所述结合组分对Ang2具有特异性，因为在一项优选实施方案中其包含与Ang2分 子内的一个或多个表位特异性结合的一个免疫球蛋白单一可变域。
[0161] 结合组分对其抗原Ang2的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括 例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析（例如放射免疫分析（RIA)、酶 免疫分析（EIA和ELISA)及夹心式竞争分析）及本领域中本身已知的其不同变化形式来测 定。
[0162] 关于抗原Ang2,免疫球蛋白单一可变域在物种方面不受限制。因此，若欲用于人 中的治疗目的，则免疫球蛋白单一可变域优选结合人Ang2。然而，结合另一哺乳动物物种 的Ang2的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种形式 的Ang2结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反 应。例如，结合人抗原的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的 各别抗原和/或与用于疾病动物模型（例如猴（特别是食蟹猴或恒河猴）、小鼠、大鼠、兔、 猪、犬）（且特别是用于可通过抑制Ang2而调节的疾病及病症的动物模型）中的一个或多 个动物物种（例如本文提及的物种及动物模型）的抗原的交叉反应性。表现这种交叉反应 性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在 公认的疾病模型（例如猴（特别是食蟹猴或恒河猴）、或小鼠及大鼠）中对本发明的免疫球 蛋白单一可变域进行测试。
[0163] 而且，所述结合组分不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇或不由其所针 对的抗原的特定域或抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种（其欲在治疗性 Ang2拮抗剂的研发期间将其用作动物模型）的一种或多种抗原分子的交叉反应性，结合组 分识别与人抗原具有高度同一性的各别抗原的区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模 型，本发明的单特异性结合分子中含有的抗Ang2免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分 位于Ang2的EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示高同一性。
[0164] 因此，根据一项优选实施方案，本发明的单特异性结合分子包含Ang2结合分子， 其为选自与完全或部分地包含于FLD域内的表位结合的由SEQ ID NO: 167、166、129和139 所构成的组的免疫球蛋白单一可变域。
[0165] 本发明还涉及编码本发明的所述Ang2结合分子的核酸。
[0166] 在一项优选实施方案中，当本发明的Ang2结合分子表达于大肠杆菌中时，其由选 自以下的核苷酸序列编码：
【权利要求】
1. 一种Ang2结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变 域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3,其中CDRl具有选自SEQ ID NO: 168至170中 所示氨基酸序列的氨基酸序列，⑶R2具有选自SEQ ID N〇:171至173中所示氨基酸序列的 氨基酸序列且⑶R3具有选自SEQ ID NO: 174至177中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1的所述Ang2结合分子，其中 (a) CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中所示 的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 174中所示的氨基酸序列，或者其中 (b) CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中所示 的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 175中所示的氨基酸序列，或者其中 (c) CDRl具有SEQ ID NO: 169中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 172中所示 的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 176中所示的氨基酸序列，或者其中 (d) CDRl具有SEQ ID NO: 170中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 173中所示 的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 177中所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1或2的所述Ang2结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH 或域抗体。
4. 根据权利要求1至3中任一项的所述Ang2结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变 域为VHH。
5. 根据权利要求1至4中任一项的所述Ang2结合分子，其中所述VHH由具有选自由 SEQ ID No:167、166、129和138组成的组的序列的免疫球蛋白单一可变域组成。
6. 由如权利要求1至5中任一项中指出的所述免疫球蛋白单一可变域组成的Ang2结 合分子。
7. 根据权利要求1至6中任一项的所述Ang2结合分子，其中由免疫球蛋白单一可变域 组成的所述VHH在N端具有修饰或置换，其中所述修饰是缺失第一氨基酸且所述置换是由 另一氨基酸替代所述第一氨基酸。
8. 编码根据权利要求1至7中任一项的所述Ang2结合分子的核酸分子。
9. 包含根据权利要求8的所述核酸分子的表达载体。
10. 携带根据权利要求9的一种或多种表达载体的宿主细胞。
11. 产生根据权利要求1至10中任一项的所述Ang2结合分子的方法，所述方法包括以 下步骤： (a) 用根据权利要求9的一种或多种所述载体转染宿主细胞， (b) 培养所述宿主细胞，以及 (c) 回收并纯化所述Ang2结合分子。
12. -种药物组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求1至7中任一项的一种或多 种所述Ang2结合分子，和至少一种生理学上可接受的载体。
13. 根据权利要求12的所述药物组合物，还包含一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂 如癌细胞中的DNA损伤剂和/或抗有丝分裂药物（例如紫杉醇）、或者抑制血管生成的治疗 活性化合物（抗血管生成药物如抗VEGF/VEGF受体抑制剂，例如安维汀、Nitedanib或舒尼 替尼）、或者信号转导途径抑制剂如mTOR抑制剂（例如替西罗莫司）、或者激素治疗剂（例 如他莫昔芬）。
14. 根据权利要求12至13中任一项的所述药物组合物，其用于治疗与Ang2介导的对 血管生成的作用相关的疾病。
15. 根据权利要求14的所述药物组合物，其用于治疗癌症和癌性疾病，如乳腺癌、肾细 胞癌、卵巢癌和胰腺癌。
16. 根据权利要求14的药物组合物，其用于治疗眼病，如年龄相关性黄斑变性和糖尿 病性视网膜病变。
17. 根据权利要求14的药物组合物，其用于治疗慢性肾病，例如糖尿病性肾病、肾后性 肾衰竭、肾前性氮质血症和内在肾衰竭。
18. 治疗有此需要的患者的如权利要求14至17任一项中所述的疾病的方法，其包括向 所述患者给予根据权利要求1至7中任一项的一种或多种所述Ang2结合分子，或者根据权 利要求12至1中7任一项的药物组合物。
【文档编号】A61K39/395GK104321344SQ201380026471
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】E·博格斯, A·格施温德, R·G·奥特, M-A·拜斯, J·波科诺, P·默切尔斯, E·德普拉, F·史蒂夫内特 申请人:勃林格殷格翰国际有限公司