一种外源性ngf的新用途
【专利摘要】本发明公开了一种外源性NGF的新用途，首先建立SD大鼠隐睾模型，通过外源性注射NGF，设立对照组，利用实时定量PCR、原位杂交、免疫荧光、免疫组化及透射电子显微镜等技术，观察隐睾组织形态学变化，以及睾丸组织中NGF、HoxA10mRNA及蛋白质的表达变化，证实NGF是可促进睾丸精子的形成。因此，NGF在制备用于促生精、促进隐睾模型睾丸组织发育、降低隐睾组织的损伤以及治疗隐睾症药物中具有广泛的应用。
【专利说明】一种外源性NGF的新用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体的涉及一种外源性NGF的新用途。
【背景技术】
[0002]隐睾症即睾丸未降，是由于一侧或两侧睾丸未能成功进入阴囊造成的泌尿生殖系统畸形，新生男婴的发病率为2% _4%，早产儿的发病率更高。正常情况下，在胎儿出生前睾丸首先在腹腔发育，然后在引带的牵拉作用下，逐步下降至阴囊。睾丸之所以未能成功下降至阴囊，主要是由于未将睾丸发生组织学改变。此外，隐睾症是男性不育及睾丸肿瘤发生的危险因素之一。有研究表明，未经及时有效治疗的隐睾患儿，对其以后的生育能力有着不可逆的影响，且患睾丸恶性肿瘤的机率更高。目前睾丸下降固定术和激素疗法是治疗隐睾的主要手段。1930年HCG (人绒毛膜促性腺激素)激素疗法首次应用于临床，并获得广泛应用，尤其是欧洲国家更为盛行。然而，近几年，因激素疗法对生殖细胞的副作用较大，而再次被国内外学者广泛重视，其临床应用较前减少。[0003]隐睾症是一种涉及多种基因的多因素疾病。前期研究证实，在未降睾丸中β-NGF和HoxAlOmRNA及蛋白质表达显著降低。NGF (Nerve growth factor,神经生长因子)被认为是神经生长、扩增、分化及存活的主要调控因子之一，而且，在睾丸中也有NGF的表达，且由男性生殖细胞产生。HoxAIO则与隐睾症密切相关，是腹腔内睾丸下降、引带发育的重要原因之一。迄今为止，外源性NGF已被应用于多种神经系统模型，且应用于临床，研究NGF的传递方式及在成熟或发育的神经系统中的作用机制。因此，将β-NGF和HoxAIO作为睾丸发育情况的检测指标。然而，外源性NGF是否影响大鼠隐睾模型中内源性NGF和HoxAIO的表达变化尚未有相关报道。
【发明内容】
[0004]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种外源性NGF的新用途，通过建立SD大鼠单侧隐睾模型，利用电生理显微技术观察外源性NGF作用于隐睾后NGF和HoxAIO基因及蛋白的表达变化，证实其NGF具有明显地促生精作用，外源性注射NGF，可促进隐睾模型睾丸组织发育，降低隐睾组织的损伤，对人类隐睾症具有潜在的治疗效果。
[0005]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]外源性NGF在制备用于促生精药物中的应用。
[0007]所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
[0008]外源性NGF在制备用于降低隐睾组织的损伤药物中的应用。
[0009]所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
[0010]外源性NGF在制备用于治疗隐睾症药物中的应用。[0011]所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
[0012]外源性NGF在制备用于促进隐睾模型睾丸组织发育药物中的应用。
[0013]所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
[0014]本发明首先建立SD大鼠隐睾模型，通过外源性注射NGF，设立对照组，利用实时定量PCR、原位杂交、免疫荧光、免疫组化及透射电子显微镜等技术，观察隐睾组织形态学变化，以及睾丸组织中NGF、HoxAlOmRNA及蛋白质的表达变化，证实NGF是可促进睾丸精子的形成。
[0015]有益效果:与现有技术相比，本发明的外源性NGF的新用途，通过一步法实时定量PCR、免疫杂交、免疫荧光、免疫组化技术检测隐睾组织中NGF、HoxA10基因和蛋白表达变化，高剂量组(NGF高浓度)比低剂量组和对照组(HCG组)NGF和HoxAlO蛋白和基因表达较高，证实了 NGF具有明显地促生精作用，外源性注射NGF，可促进隐睾模型睾丸组织发育，降低隐睾组织的损伤，对人类隐睾症具有潜在的治疗效果。可见，NGF在药物开发中具有广泛的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是一步法实时定量PCR检测结果图；A图是睾丸中β -NGF mRNA的表达水平，B图是HoxAlOmRNA的表达水平；
[0017]图2是原位杂交结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
[0018]图3是免疫荧光结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
[0019]图4是免疫组化结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
[0020]图5是透射电子显微镜下睾丸组织显微结构图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
[0021]图6是模型的建立示意图；
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0023]实施例1
[0024]模型的建立，如图6所示。
[0025]获取日龄21天SD雄鼠约30只(此时SD鼠的睾丸尚未下降，SD鼠睾丸的下降通常在日龄20-30d)，戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，下腹正中切开腹腔，切断睾丸引带远端，缝合睾丸白膜，将睾丸固定于相应的腹膜上，关闭腹腔，完成隐睾模型的建立。对侧睾丸作为对照组。
[0026]模型建立术后分为4组，每组6只，NGF高、低注射剂量组(HN组、LN组)，注射HCG组(HC组)，阴性对照组(NC组)。自术后第2天起，HN组每次肌肉注射鼠NGF9000IU，LN组每次肌肉注射鼠NGF4500IU，共注射5天。HC组每次肌肉注射HCG400IU，NC组肌肉注射生理盐水。另取6只正常SD大鼠，作为空白对照组。模型建立术后第7天(幼鼠期)、术后第60天(性成熟期)快速脱颈椎法每次处死12只大鼠，取未降睾丸和对侧已降睾丸标本用于后续实验。
[0027]实施例2 —步法实时定量PCR
[0028]组织总RNA的提取:取50~IOOmg的睾丸组织应用Trizol试剂盒(Invitrogen,USA)，按说明书步骤提取总RNA，置_70°C冰箱保存备用。为了避免可能的基因组DNA污染，所有的RNA样品均使用无RNA酶的DNA酶(Promega，Madison，WI，USA)。经紫外分光光度计测定各样本的OD26tZOD28tl(R)值，以鉴定RNA纯度及完整性。R值如表1所示，1.8 < R < 2.0证实Trizol法提取的RNA纯度较好，可用于后续实验。
[0029]根据标准协议，使用Rotor_Gene3000实时DNA分析系统(Corbett Research,Sydney, Australia),应用 SensiMixTM One-Step 试剂盒(Quantace, UK)完成一步法突光实时定量 PCR (one-step qPCR),应用 Rotor-Gene 实时分析软件 6.1 (Build90)计算 β -NGF和 HoxlOmRNA 的表达结果。PCR 扩增体系:Dream Taq PCR Master Mix (2x) IOul ；ForwardPrimer2ul ；Reverse Primer2ul ；Template DNA3ul ;Water, nuclease_free3ul。PCR扩增程序包括:42°C，30min反转录后，95°C Taq酶激活2min，随后95°C 15s，58°C 30s共45个循环，最后72°C 40s延伸。GAPDH作为标准内参基因对照。β -NGF, Hox I O, GAPDH的PCR引物序列如下:
[0030]β -NGF-forward:5/ -ACCTCTTCGGACACTCTG-3'；
[0031]β -NGF-reverse:5/ -GTGGCTGTGGTCTTATCTC-3'；
[0032]Hox10-forward:5/ -ACAAGCACACCACAATTCTCC-3'；
[0033]HoxlO-reverse:5/ -ATCCAAACAATGTCTCCCTTCTC-3'；
[0034]GAPDH-forward:5/ -TCGTGGAGTCTACTGGCGTCT-3'；
[0035]GAPDH-reverse:5/ -CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3'。
[0036]结果如图1所示，显示在高剂量组(LN)中，HoxAlO及β -NGF mRNA的表达水平最高(F = 125.58，P < 0.0Oland F = 49.03，P < 0.001)，与阴性对照组(NC)相比，高剂量组和低剂量组的HoxAlO及β -NGF mRNA的表达水平显著提高。
[0037]如下面表一所示，
[0038]表1Trizol法提取的RNA纯度鉴定结果
[0039]
【权利要求】
1.外源性NGF在制备用于促生精药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
3.外源性NGF在制备用于降低隐睾组织的损伤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
5.外源性NGF在制备用于治疗隐睾症药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxAIO基因的蛋白表达量来实现。
7.外源性NGF在制备用于促进隐睾模型睾丸组织发育药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、Ho xAIO基因的蛋白表达量来实现。
【文档编号】A61P15/00GK103933551SQ201410037990
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】咸华, 黄剑飞, 咸云, 刘莉莉 申请人:南通大学附属医院